专利名称：一种具有表面涂层的细胞培养装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有表面涂层的细胞培养装置，还涉及一种用于细胞培养的方法。
背景技术：
细胞生长的外环境对细胞的生长形态和功能都有重要的影响。在体内，细胞被错综复杂的脚手架似的细胞外腔所包围，它影响着细胞的极化、生长以及细胞的运动。所以， 在细胞组织工程或体外实验中，除了需无菌、维持适当温度和提供一定的营养条件模拟体内生理环境使细胞生存、生长之外，还非常有必要构建一种细胞培养的外环境使得细胞能够保持一种更为接近体内的形态，有利于了解细胞在体内生理状态下的功能特征和评估细胞在病理状态下的作用。通常的体外培养使用聚苯乙烯合成的培养瓶皿表面或其它普通表面，这些表面对水或培养基没有疏水性，接触角在30度左右，是一个二维培养环境，细胞在这种表面上受到的限制相对较小而常常呈平铺的形态，功能特征也发生变化。一直以来，研究者都在寻求一种能使维持细胞自然形态的体外培养方式，目前已取得了一定发展，其中使用三维形式的培养物质进行三维培养为研究的热点，例如专利CN101484574A公开了一种含聚合的高内相比乳液聚合物的细胞培养底物，经调整和修饰后用于常规的细胞三维培养，典型的用于哺乳动物细胞培养，还公开了该底物在细胞培养系统中的使用方法以研究和分析细胞的增殖、分化及功能化；专利CN1973029A公开了用于细胞培养和组织工程的一种纳米纤丝结构，在细胞培养中主要用于细胞增殖和/或分化的环境，其中纳米纤丝结构由一种或多种纳米纤维网络限定，纳米纤维包括直径为约1000纳米或更少的聚合物细纤维；还有研究者使用比如组织切片或器官培养的方法来研究细胞的功能。虽然这些方法有利于模拟细胞在体内的环境，但仍存在某些不足如用于细胞培养的底物其配制较麻烦，不易控制；同一底物用于同一细胞培养，可能产生不同的结果，即重复性不好；培养时细胞存活率可能受到影响；特别对于研究单种细胞的结构功能来说，目标细胞生长在培养基质内导致观察比较困难，且培养方式相对比较复杂，所以并没有被广泛应用于单种或单个细胞的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备方便、稳定性好、生物相容性好易于细胞生长的， 有利于构建类似于体内的细胞外环境的具有表面涂层的细胞培养装置，其能防止灰尘、油脂、微生物孢子、污物等粘附，并使得细胞能够保持一种更为接近体内的形态，从而有利于了解细胞在体内生理状态下的功能特征及评估细胞在病理状态下作用的；本发明的另一目的在于提供一种用于细胞培养的方法。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的一种具有表面涂层的细胞培养装置，它包括塑料基层和表面涂层，所述表面涂层为纳米材料层，表面涂层对水的接触角大于150度、分形维数为2. 2 2. 3。
上述接触角大于150度的纳米材料具有超疏水性，能有效防止灰尘、油脂、污物等的粘附，分形维数反映了复杂形态占有空间的有效性，实验研究发现分形维数为2. 2^2. 3、 接触角大于150度的纳米材料能构建类似于体内的细胞外环境，有利于细胞维持类似体内的形态结构、具有较好的生物相容性和易于观察目标细胞。为了获得更优的安全性和无菌性，作为本发明的优选，所述纳米材料层铺展或涂
覆于塑料基层上。作为本发明的优选，上述具有表面涂层的细胞培养装置可通过如下步骤获得
(1)将三棕榈酸甘油酯在65 70°C下熔化1(T15min ；
(2)将熔融的三棕榈酸甘油酯铺展或涂覆于塑料基层上；
(3)在1(T20min内快速冷却凝固后加热至4(T45°C后保温10 hr，形成表面对水的接触角大于150度、分形维数为2. 23士0. 03的具有表面涂层的细胞培养装置。作为本发明的优选，所述步骤(2)中铺展或涂覆的厚度太薄则表面涂层易剥落，太厚，不利于细胞观察，选择5(Γ100 μ m较为适宜。作为本发明的另一优选，上述具有表面涂层的细胞培养装置还可以通过如下步骤获得
(1)将烷基烯酮二聚体在7(T75°C下熔化5 10min ；
(2)将熔融的烷基烯酮二聚体铺展或涂覆于塑料基层上；
(3)在1(T15min内快速冷却凝固后加热至45飞0°C后维持40 min,形成表面对水的接触角大于150度、分形维数为2. 27士0. 03的具有表面涂层的细胞培养装置。作为本发明的优选，所述步骤(2)中铺展或涂覆的厚度太薄则表面涂层易剥落，太厚，不利于细胞观察，选择6(Γ80 μ m较为适宜。作为本发明的优选，所述用于细胞培养的塑料基层为培养皿、培养板、培养瓶中的一种。本发明还提供用于细胞培养的方法，是将细胞种植于上述任一所述的具有表面涂层的细胞培养装置上进行培养，使得细胞能够保持一种更为接近体内的形态和功能。综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下突出优点及有益效果
1.本发明的表面涂层为超疏水性纳米材料层，可降低涂层表面能，赋予涂层表面超疏水能力，稳定性好，能有效防止灰尘、油脂、微生物孢子、污物等粘附，从而利于提供一种无菌无尘的细胞体外培养环境；
2.研究发现，本发明的表面涂层能构建类似于体内的细胞外环境，使细胞维持一种更为接近体内的形态结构，从而有利于了解细胞在体内生理状态下的功能特征及评估细胞在病理状态下的作用；
3.本发明制备方便，具有较好的生物相容性，易于观察目标细胞；在本发明表面涂层上生长的细胞可以用于免疫化学染色、原位杂交实验、细胞成份也可以用于定性或定量的分析，具有很强的实用性和应用性。
图1为实施例1的细胞培养装置的表面扫描电镜(SEM)照片A电压5.0KV， Bar=40 μ m ;B 电压 10. OKV, Bar=80 μ m。
图2为水分别在实施例IA和实施例2B的细胞培养装置上的照片(Bar=500 μπι)。图3为大鼠星形胶质细胞在不同培养装置上培养不同时间后进行骨架蛋白 actin染色后的照片(Bar=25ym):A普通细胞培养装置；B为实施例1的具有表面涂层的细
胞培养装置。图4为大鼠星形胶质细胞在不同培养装置上培养的初级突起个数、分支个数、突起长度比值、细胞分形维数的比较(炉<0. 05; #7X0.01; #炉<0. 001)。图5为大鼠星形胶质细胞在不同培养装置上培养的细胞死亡率(采用Hoechst/ PI 染色)(*/X0. 05)。图6为大鼠胶质瘤C6细胞在不同培养装置上培养不同时间后进行骨架蛋白 actin染色后的照片(Bar=50 μ m) =A普通细胞培养装置；B为实施例1的细胞培养装置。图7为实施例2的细胞培养装置的表面SEM照片A电压5. OKV, Bar=IOO μ m ;B电压 5. OKV, Bar=80μ m。图8为星形胶质细胞在不同培养装置上培养2 d后进行骨架蛋白actin染色后的照片(Bar=50 μ m) =A普通细胞培养装置；B为实施例2的细胞培养装置。图9为大鼠胶质瘤C6细胞在不同培养装置上培养2 d后进行骨架蛋白actin染色后照片(Bar=20 μ m) =A普通细胞培养装置；B为实施例2的细胞培养装置。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出任何修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。实施例1
一种具有表面涂层的细胞培养装置，其通过如下步骤获得
(1)将三棕榈酸甘油酯在65 70°C下熔化1(T15min ；
(2)将熔融的三棕榈酸甘油酯铺展或涂覆于塑料培养皿上，铺展或涂覆厚度为 50 100μπι ；
(3)在1(T20min内快速冷却凝固后加热至4(T45°C后保温10 hr。该细胞培养装置表面的SEM照片见图1，其中表面的横截面(图IB) SEM图像用盒计数法计算分形维数为2. 23士0. 03，水在其表面的照片见图2A，用接触角测量仪测量该表面对水的接触角为 150^160度，表明该材料具有超疏水性。脊椎动物中枢神经系统中呈星形的神经胶质细胞即星形胶质细胞，其可调节细胞外离子和化学环境，支持脑血屏障，为神经组织提供营养物质，是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种，在体内具有大量突起的精细立体结构。但是在普通细胞培养装置如塑料或玻璃培养表面培养时，星形胶质细胞常呈扁平的多角型，失去大量的突起。我们将大鼠的皮层星形胶质细胞种植于上述具有表面涂层的细胞培养装置上进行培养(培养基为DMEM含10%胎牛血清，37°C，5% C02)，培养1 d、2 d、3 d后进行细胞骨架 actin染色(染料为rhodamine-phalloidin，Molecularfrobes)，然后在荧光显微镜下拍摄照片见图3B，在相同条件下对种植于普通细胞培养装置表面的星形胶质细胞培养相同的时间，然后进行细胞骨架actin染色，照片见图3A，对比A和B可以发现星形胶质细胞外表显著不同，在普通细胞培养装置表面上呈多角的扁平的形状，显示出异质性和无组织性，而星形胶质细胞在三棕榈酸甘油酯超疏水纳米材料上成多突起状态，具有复杂的形态结构， 与体内形态更为接近。我们还比较了在普通细胞培养装置上培养的星形胶质细胞与在具有表面涂层的细胞培养装置上培养的星形胶质细胞的突起个数(图4A、B)、突起长度(图4C)和细胞的分形维数(图4D，反映细胞结构复杂性的指标)，发现在具有三棕榈酸甘油酯超疏水纳米材料表面涂层的细胞培养装置上星形胶质细胞的初级突起个数和分支个数(包括二级及其以上的突起个数)明显多于普通材料上星形胶质细胞、相对突起长度((细胞中心至突起顶端长度一细胞内圆半径的差值)X 100%/细胞中心至突起顶端长度)明显长于普通细胞培养装置上星形胶质细胞，同时细胞分形维数也明显大于普通细胞培养装置上的星形胶质细胞的分形维数。由此表明，在三棕榈酸甘油酯超疏水纳米材料上，星形胶质细胞形态更为接近体内的多突起、突起较长的复杂形态，更有利于了解细胞体内生理状态下的功能特征及评估细胞在病理状态下的作用。我们还进一步比较了在具有三棕榈酸甘油酯超疏水纳米材料表面涂层的细胞培养装置上和在普通细胞培养装置上培养的星形胶质细胞的死亡率(图5)，发现在具有表面涂层的细胞培养装置上培养的细胞死亡率低于在普通细胞培养装置上培养的死亡率，特别是培养2 d时的死亡率明显低于普通细胞培养装置上的星形胶质细胞死亡率，表明具有表面涂层的细胞培养装置具有较好的生物相容性。此外，还将大鼠胶质瘤C6细胞(可从上海博耀生物科技有限公司购得)种植于上述具有表面涂层的细胞培养装置上进行培养(DMEM含10%胎牛血清，37°C，5% C02)，培养2 d 后进行细胞骨架actin染色，然后在荧光显微镜下拍摄照片(图6B)。在相同条件下对种植于普通细胞培养装置表面的同一胶质瘤C6细胞培养相同的时间，然后进行细胞骨架actin 染色，照片见图6A，对比A和B可以发现大鼠胶质瘤细胞C6在普通细培养装置表面上呈双极的形态，而在三棕榈酸甘油酯超疏水纳米材料上成多分支状态，有大量的细小的突起， 表明其结构更为复杂，提示这种材料能使细胞保持一种更为接近体内的形态。实施例2
一种具有表面涂层的细胞培养装置，其通过如下步骤获得
(1)将烷基烯酮二聚体在7(T75°C下熔化5 10min ；
(2)将熔融的烷基烯酮二聚体铺展或涂覆于塑料培养板或培养瓶上，铺展或涂覆的厚度为60 80 μ m ；
(3)在1(T15min内快速冷却凝固后加热至45飞0°C后维持40 min。该细胞培养装置表面的SEM照片见图7。其中表面的横截面(图7B)SEM图像用于盒计数法计算分形维数为 2. 27士0. 03，用接触角测量仪测量该表面对水的接触角为15(Γ160度(图2Β)，表明该表面具有超疏水性。将大鼠皮层星形胶质细胞种植于具有烷基烯酮二聚体超疏水纳米材料的细胞培养装置上进行培养(培养基为DMEM含10%胎牛血清，37°C，5% C02)，培养3天后进行细胞骨架actin染色，然后在荧光显微镜下拍摄照片见图8B ；在相同条件下对种植于普通细胞培养装置表面的星形胶质细胞培养相同的时间，培养后的细胞骨架actin染色照片见图8A，对比A和B可以发现星形胶质细胞外表显著不同，在普通细胞培养装置表面上呈扁平多角的形态，而在具有烷基烯酮二聚体超疏水纳米材料表面涂层的细胞培养装置表面上有较多突起，与体内形态更为接近。此外，还将大鼠胶质瘤细胞C6种植于上述具有表面涂层的细胞培养装置上进行培养(DMEM含0. 1%胎牛血清、ImM dbcAMP, 37°C, 5% CO2),培养2 d后进行细胞骨架actin 染色，然后在荧光显微镜下拍摄照片图9B，在相同条件下对种植于普通细胞培养装置表面的同一胶质瘤细胞C6培养相同的时间，培养后的细胞骨架actin染色照片见图9A，对比A 和B可以发现大鼠胶质瘤C6细胞在普通细胞培养装置表面上呈多角的扁平的形状，而在具有表面涂层的细胞培养装置表面上成多分支状态，有大量的细小的突起，三维结构观察成立体形态。分析细胞的分析维数后发现，大鼠胶质瘤C6细胞在烷基烯酮二聚体超疏水纳米材料上的分形维数为1.27士0. 06，而普通表面为1. 14士0. 04 UKQ. 05)，表明其结构更为复杂，提示这种材料能使细胞保持一种更为接近体内的形态。本发明中未详尽部分均为本领域技术人员所熟知的技术。
权利要求
1.一种具有表面涂层的细胞培养装置，其特征在于它包括塑料基层和表面涂层，所述表面涂层为纳米材料层，表面涂层对水的接触角大于150度、分形维数为2. 2^2. 3。
2.根据权利要求1所述一种具有表面涂层的细胞培养装置，其特征在于所述纳米材料层铺展或涂覆于塑料基层上。
3.根据权利要求2所述一种具有表面涂层的细胞培养装置，其特征在于其通过如下步骤获得(1)将三棕榈酸甘油酯在65 70°C下熔化1(T15min ；(2)将熔融的三棕榈酸甘油酯铺展或涂覆于塑料基层上；(3)在l(T20min内快速冷却凝固后加热至4(T45°C后保温10hr，形成表面对水的接触角大于150度、分形维数为2. 23士0. 03的具有表面涂层的细胞培养装置。
4.根据权利要求3所述一种具有表面涂层的细胞培养装置，其特征在于所述步骤(2)中铺展或涂覆厚度为5(Γ100 μ m。
5.根据权利要求2所述一种具有表面涂层的细胞培养装置，其特征在于其通过如下步骤获得(1)将烷基烯酮二聚体在7(T75°C下熔化5 10min ；(2)将熔融的烷基烯酮二聚体铺展或涂覆于塑料基层上；(3)在1(T15min内快速冷却凝固后加热至45飞0°C后维持40 min,形成表面对水的接触角大于150度、分形维数为2. 27士0. 03的具有表面涂层的细胞培养装置。
6.根据权利要求5所述一种具有表面涂层的细胞培养装置，其特征在于所述步骤(2)中铺展或涂覆的厚度为6(Γ80 μ m。
7.根据权利要求1至6任一所述一种具有表面涂层的细胞培养装置，其特征在于所述塑料基层为培养皿、培养板、培养瓶中的一种。
8.一种用于细胞培养的方法，其特征在于将细胞种植于权利要求广7任一所述的具有表面涂层的细胞培养装置上进行培养，使得细胞能够保持一种更为接近体内的形态和功能。
全文摘要
本发明公开了一种具有表面涂层的细胞培养装置，它包括塑料基层和表面涂层，所述表面涂层为纳米材料层，表面涂层对水的接触角大于150度、分形维数为为2.2~2.3，该纳米材料层铺展或涂覆于塑料基层上。本发明还公开了一种用于细胞培养的方法，是将细胞种植于具有表面涂层的细胞培养装置上进行培养，使得细胞能够保持一种更为接近体内的形态和功能。本发明制备方便、稳定性好、生物相容性好且易于细胞生长，有利于了解细胞在体内生理状态下的功能特征及评估细胞在病理状态下作用的，具有很强的实用性和应用性。
文档编号C12M3/00GK102559494SQ201210051188
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者徐晓武, 戴海斌, 方文军, 王喆, 胡薇薇, 陈忠, 魏云海 申请人:浙江大学