专利名称：中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。
背景技术：
抗菌肽(Antibacterial Peptides,ABP)是由胚系基因编码的内源性活性肽分子，广泛存在于多种生物体内，是生物体对外界病原物入侵感染而产生的一系列免疫反应的产物。由于其分子量小，极易扩散到感染部位，不存在使用后产生耐药性的问题，且进入机体后无有害残留，因此，抗菌肽在畜禽养殖业上的研究与应用，将是实现健康养殖、消除抗生素残留的重要措施。鲎是一种极其珍贵的海洋无脊椎动物，也是海洋动物界现存的“活化石”，其经济价值和科研价值很高。鲎缺乏获得性免疫系统，在抵抗病原侵袭的过程中形成了多种天然防御系统，在这些防御系统中，鲎素(Tachyplesin)发挥了主要的抗病原作用。鲎素是一类存在于鲎血细胞中的具有抗菌活性的阳离子多肽，它的发现被医学界称为“抗生素”研究的一个里程碑，是后抗生素时代到来的标致。1969年，Koichi Ogata首次发现了一种可以利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌[]。甲醇可以 很廉价的从天然气中合成，因此立即引起人们将毕赤酵母开发成动物高蛋白饲料的兴趣。20世纪70年代，Phillips Petroleum Company研制了毕赤酵母单细胞蛋白(SCP)的培养基及连续高密度培养方法(〈130 g/L细胞干重)。进入80年代，SalkInstitute Biotechnology/Industrial Associate Inc.(SIBIA)将毕赤酵母开发为异源蛋白表达系统，并构建了载体、菌株及毕赤酵母的基因工程操作方法。沿用SCP生产中使用的培养基及发酵方法，联合AOXl启动子的调控，实现了外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。1993年,授权Invitrogen Company向全世界出售该系统,推动了毕赤酵母表达系统的发展和应用。到目前，已用毕赤酵母表达系统成功的表达了 200种以上的蛋白，毕赤酵母还被美国食品和医药管理局(Food and Drug Administration, FDA)确认为是一种安全的生物，具有良好的生物安全性。1997年开发的A pastor is的组成型甘油醛_3_磷酸脱氢酶基因(Glyceraldehydes - 3-phosphate dehydrogenase,GAP)启动子,该启动子是组成型表达的，所以不存在诱导的问题，在以葡萄糖为碳源的培养基上就可以表达，从而有利于产品的生产和应用，且表达量较诱导型高。目前，该系统还很少应用于抗菌肽的表达，预期将该系统引入抗菌肽的表达，能够成为抗菌肽规模化生产的最佳途径。
发明内容
本发明的目的是采用微生态理论和分子生物学技术，将中国鲎抗菌肽Tachyplesins I (TP I)基因克隆到组成型表达载体pGAPZ a A中，构建鲎素抗菌肽基因GAP启动子酵母表达载体。本发明首先根据tachyplesins基因的测序结果设计引物TP 1-NNXl和TP
1-NNX2，含如下酶切位点:
上游引物 TP 1-NNXl:5’ -CCGCI TCGAGAAAAGAAAATGGTGCTTCCGTGTTTG-3 Xho I
下游引物 TP 1-NCX2:5’ -GCT I CTAGATTAACGGCAACGACGGTAGCAG-3，
Xba I
然后根据PGAPZ α使用手册合成通用引物:
上游引物 5’ pGAP:5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’
下游引物 3’ AOXl:5’ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’
对TP I基因的克隆质粒pMD-18T-TP I和酵母表达载体pGAPZ a A进行双酶切，回收酶切目的片段，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，筛选阳性转化子，提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定，并进行测序。本发明由上述方法获得的中国鲎素组成型酵母表达载体pGAPZ a A-TPI。本发明采用微生态理论和分子生物学技术,将中国當抗菌肽Tachyplesins I (TP
I)基因克隆到组成型表达载体pGAPZ a A中，构建鲎素抗菌肽基因GAP启动子酵母表达载体，电转化到酵母宿主菌Χ-33中，筛选能够高效表达、零污染的鲎素抗菌肽酵母高效表达基因工程菌。并以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌进行初步的抑菌活性检测。为下一步进行工业化生产及进一步探究抗菌肽在体内体外的生物学作用及其作用机制提供材料。
图1是pGAPZ a A质粒图谱；
图2是重组质粒pGAPZ a A-TP I图谱`；
图3是重组质粒pGAPZ a A-TP I的PCR和酶切鉴定结果；
图4是重组质粒pGAPZ a A-TPI酶切鉴定结果；
图5是pGAPZ a A-TP I重组质粒测序结果；
图6是X33-GAP-TP I重组酵母菌PCR鉴定；
为对酵母菌株DNA用引物TP 1-NCX2和5 ’ pGAP进行PCR扩增检测结果，理论扩增片段大小为376 bp,如图所示，阳性菌株在目的片段附近均有特异性扩增(3 16泳道)，2泳道为空白的X-33酵母菌株DNA对照；
图7是X33-GAP-TPI重组酵母菌PCR鉴定；
为对酵母菌株DNA用引物TP 1-NNXl和3’AOXl进行PCR扩增检测结果，理论扩增片段大小为230 bp,如图所示，阳性菌株在目的片段附近均有特异性扩增(2 15泳道)，I泳道为空白的X-33酵母菌株DNA对照；
图8是X33-GAP-TPI重组酵母菌PCR鉴定；
为对酵母菌株DNA用引物TP 1-NNXl和TP 1-NNX2进行PCR扩增检测结果，理论扩增片段大小为66 bp，如图所示，阳性菌株在目的片段附近均有特异性扩增(2 15泳道)，16泳道为空白的X-33酵母菌株DNA对照；
图 9 是发酵产物 Tricine-Glycerol-SDS-PAGE 结果；
图10是发酵产物的活性检测结果。
具体实施例方式本发明涉及的中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期:2011年11月16日，保藏编号=CGMCC N0.5462，分类命名:巴斯德毕赤酵母pichia pastoris。
本发明首先根据tachyplesins基因的测序结果设计引物TP 1-NNXl和TP 1-NNX2，含如下酶切位点:
上游引物 TP 1-NNX 1:5’ -CCGCI TCGAGAAAAGAAAATGGTGCTTCCGTGTTTG-3，
Xho I
下游引物 TP 1-NCX2:5’ -GCT I CTAGATTAACGGCAACGACGGTAGCAG-3，
Xba I
然后根据PGAPZ α使用手册合成通用引物:
上游引物 5 ’ pGAP: 5，-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，
下游引物 3’ AOXl:5’ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’
对TP I基因的克隆质粒pMD-18T-TP I和酵母表达载体pGAPZ a A进行双酶切，回收酶切目的片段，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，筛选阳性转化子，提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定，并进行测序。本发明由上述方法获得的中国鲎素组成型酵母表达载体pGAPZ a A-TPI。菌株及质粒
主要菌株及质粒见表I和图1。表I使用的主要菌株和质粒
权利要求
1.一种中国當素组成型酵母表达载体的制备方法，其特征在于:根据tachyplesins基因的测序结果设计引物TP 1-NNXl和TP 1-NNX2，含如下酶切位点:上游引物 TP 1-NNXl:5’ -CCGCI TCGAGAAAAGAAAATGGTGCTTCCGTGTTTG-3 Xho I下游引物 TP 1-NCX2:5’ -GCT I CTAGATTAACGGCAACGACGGTAGCAG-3，Xba I 根据pGAPZa使用手册合成通用引物:上游引物 5’ pGAP:5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’下游引物 3’ AOXl:5’ -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ 对TP I基因的克隆质粒pMD-18T-TP I和酵母表达载体pGAPZ a A进行双酶切，回收酶切目的片段，用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，筛选阳性转化子，提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定，并进行测序。
2.由权利要求1的方法·获得的中国鲎素组成型酵母表达载体pGAPZα Α-ΤΡΙ。
全文摘要
一种中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备方法，属于生物技术领域。本发明的目的是采用微生态理论和分子生物学技术，将中国鲎抗菌肽TachyplesinsI(TPI)基因克隆到组成型表达载体pGAPZαA中，构建鲎素抗菌肽基因GAP启动子酵母表达载体。本发明首先根据tachyplesins基因的测序结果设计引物TPI-NNX1和TPI-NNX2，然后根据pGAPZα使用手册合成通用引物，对TPI基因的克隆质粒pMD-18T-TPI和酵母表达载体pGAPZαA进行双酶切，回收酶切目的片段，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性转化子，提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定，并进行测序。本发明筛选能够高效表达、零污染的鲎素抗菌肽酵母高效表达基因工程菌。
文档编号C12N15/81GK103233035SQ201210051429
公开日2013年8月7日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者韩文瑜, 冯新, 雷连成, 宋战昀, 刁昱文, 赵红蕾, 高宇 申请人:吉林大学