一种酵母表达载体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，特别是一种酵母表达载体。
【背景技术】
[0002]酿酒酵母表达载体是基因工程中常用的载体，目前商用载体主要是Invitrogen公司的PYES系列、pYC系列和ATCC的YEP系列、pBT系列等，其中，pYES2作为酿酒酵母表达系统的表达载体应用较为广泛，尤其在基因功能验证中具有广泛的应用:王留强等(2011)通过把二色补血草的DREB基因构建到pYES2中，验证了该基因在干旱、高盐和冷害胁迫下的抗性，以及抗其他重金属的能力；周凯(2011)把棉花GhGnT基因构建到pYES2上，发现其过表达能提高酵母耐盐性；孙新华等(2012)则用PYES2载体验证了四翅滨黎AcERF基因对高温、强碱和活性氧的抗性。然而这些商用载体均为细胞内表达载体，不适于细胞外分泌表达。赵颖怡等(2002)将来源于克鲁维酵母的菊粉酶基因是信号肽克隆至pYES2载体上，构建了一种酿酒酵母分泌表达载体；胡亚冬等(2009)将酿酒酵母的a-交配因子克隆至酿酒酵母胞内表达载体PYES2/CT中，构建了一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体PYES2/CT/a-factor,实现了酵母系统分泌蛋白的外表达。
[0003]然而，当目的基因构建到表达载体pYES2上时，尽管在添加诱导剂诱导之后，仍然需要通过诸如SDS-PAGE和Western杂交等方式来确认目的蛋白是否表达以及表达量，为了快速检测目的基因是否在酵母细胞中有效表达，B1vector有限公司将绿色荧光蛋白基因(EGFP)引入表达载体中，构建pYES2-EGFP表达载体(如图1所示)，目的基因与绿色荧光蛋白基因同时表达，通过荧光检测即可获得目的基因表达量，但是该表达载体仅有—个酶切位点可用，这样对目的基因的克隆以及含有该酶切位点基因酵母转化造成了限制，不能广泛应用于基因工程中。
[0004]pJITI66-GFP瞬时表达载体是由南京农业大学作物遗传与育种国家重点实验室改造而成，已经在多篇文章中报道(如“棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立”李妮娜等，作物学报，2014 ;“葡萄花发育基因的亚细胞定位和表达分析”杨光等，中国农业科学，2011)，载体所含GFP基因为增强型荧光蛋白基因；目前，含有该蛋白基因且具有多个酶切位点的酵母表达载体未见报道。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，发明提供一种酵母表达载体PYES2-GFP，较现有载体，引入HindIII和SalI酶切位点，便于多目标基因的克隆，本发明是这样实现的:
一种酵母表达载体，该载体是利用HindIim 对瞬时表达载体pJITI66-GFP和载体pYES2分别进行双酶切，回收酶切目的片段HindII1-GFP+NOS-EcoRI和HindII1-pYES2-EcoRI中，再以T4DNA连接酶连接后获得；所述酵母表达载体包含历Saim及丽7/的酶切位点以及NOS终止子。
[0006]由本发明方法获得的酵母表达载体pYES2-GFP。
[0007]本发明所构建的pYES2-GFP酵母表达载体采用GALI启动子，可用的多克隆位点内切酶分别为Hindlll、Sail和BamHI，相比市售pYES2_EGFP表达载体，引入了 SalI和HindIII两个新的酶切位点，基因选择的酶切位点范围扩大，便于基因的功能鉴定和克隆；同时添加了 NOS终止子，便于融合蛋白翻译的有效终结；当目标基因与GFP基因融合时，快速检测GFP的表达，即可推断目标蛋白表达与否，荧光信号强，目标蛋白亚细胞定位准确，省去了诸如SDA-PAGE和Western杂交等蛋白检测手段，操作简单，结果可靠，对于目标基因在酵母细胞中的快速表达检测和目标蛋白的细胞定位具有重要的意义。
【附图说明】
[0008]图1为市售pYES2-EGFP表达载体结构示意图。
[0009]图2为实施例表达载体构建流程示意图。
[0010]图3为实施例PYES2-GFP表达载体结构示意图。
[0011]图4 为实施例 HindII1-GFP+NOS-EcoRI 电泳图。
[0012]图5 为实施例 HindII1-pYES2_EcoRI 电泳图。
[0013]图6为实施例pYES2-GFP电泳图。
[0014]图7为细胞膜蛋白TIP5; I在酵母细胞中的表达及耐旱功能结果示意图。
[0015]图8为细胞膜蛋白TIP5; I在拟南芥原生质体中的亚细胞定位分析结果示意图。
[0016]图9为细胞膜蛋白蛋白SIPl ；3在酵母细胞中的表达结果示意图。
[0017]图10为细胞膜蛋白蛋白SIPl ；3在酵母细胞中表达的耐旱功能结果示意图。
[0018]图11为内质网膜蛋白SIPh ^5转基因烟草的耐逆功能鉴定。
【具体实施方式】
[0019]1.实施例中所涉及试剂:
Hindlll, EcoRI限制性内切酶购自MBI公司(Fermentas)、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶(ExTaq、rTaq)购自 Takara 公司；
氨节青霉素和卡那霉素均购自Sigma公司； pYES2载体购自Invitrogen公司；
PJITI66-GFP瞬时表达载体由南京农业大学作物遗传与育种国家重点实验室惠赠； TIP5；m幻户人.基因均由本实验室克隆自大豆植株。
[0020]2.实施例涉及试剂盒及基因测序
酿酒酵母INVScI ( (Saccharomyces cerevisiae)、SD/_ura酵母缺陷型培养基和酵母质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；
大肠杆菌(hcAericAia.coli)质粒提取试剂盒购自Axygen公司；
琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒和pGEM-T Easy Vector T克隆试剂盒均购自Promega公司；
实施例中所用引物和测序由南京金斯瑞有限公司合成和完成。
[0021]3.实施例所涉及培养基的配制
LB液体培养基:酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加水至1L，高压灭菌(121。。0.1MPa 20 min)后备用； LB固体培养基:酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂粉20 g，加水至1L，高压灭菌(121 °C 0.1MPa 20 min)后备用；
YPDA 液体培养基:称取 YPDA 粉 50g,量取 0.2% (w/v) Adenine hemisulfate 15ml,加蒸懼水定容至I L,高压灭菌(121 V 0.1 MPa 20 min)后备用；
YPDA 固体培养基:称取 YPDA 粉 50g,量取 0.2% (w/v) Adenine hemisulfate 15ml,琼脂粉20 g，加蒸馏水定容至I L，高压灭菌(121 0C 0.1 MPa 20 min)后备用；
SD/_ura液体培养基:称取酵母无氨基氮源6.7 g, DO Supplement 0.60g,加水950ml，高压灭菌(121°C 0.1 MPa 20 min)，待冷却至55 °C左右时加入50 ml过滤除菌的40%(w/v)的葡萄糖；
SD/-ura固体培养基:称取酵母无氨基氮源6.7 g, DO Supplement 0.60g,琼脂粉20g,加水950 ml，高压灭菌(121°C 0.1 MPa 20 min)，待冷却至55 °C左右时加入50 ml过滤除菌的40% (w/v)的葡萄糖；
4.实施例所述涉及溶液配制
10XTE buffer:0.1 M Tris-HCI, 10 mM EDTA，pH 7.5，过滤除菌后备用。1XLiAcbuffer:IM LiAc, pH 7.5,过滤除菌后备用；lXTE/LiAc buffer:1 ml 10XTE、Iml1XLiAc 与 8 ml 无菌水混合,现用现配。PEG / LiAc buffer:1ml 10XTE Buffer、l ml1XLiAc与8 ml PEG 4000 (50% w/v)混合，此溶液现用现配。
[0022]实施例1 pYES2-GFP载体的构建
(I)利用HindIim 双酶切pJITI66-GFP瞬时表达载体，酶切体系为: 120ng/uL-150ng/uL 的 pJITI66_GFP 瞬时表达载体 6 μ 1，1U ul/1 的 EcoR I 内切酶
1.5 μ I, 1U ul/1 的 Hind III 内切酶 1.5 μ I, 1X buffer Tango ?3 μ l,ddH20 18 μ I。
[0023]酶切反应条件为:根据Fermentas限制性内切酶手册进行酶切。
[0024]对酶切产物进1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图4所示，其中M泳道为DL2000分子量Marker,泳道I为没有酶切的pJITI66_GFP瞬时表达载体对照电泳，泳道2为酶切后的载体片段，大小为980bP，该片段包含GFP基因和NOS终止子序列，按照琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒说明书要求纯化回收该片段，即为纯化的HindII1-GFP+NOS-EcoRI。
[0025](2)利用HindIim 双酶切pYES2载体，酶切体系为: 120ng/uL-150ng/uLpYES2 载体 6μ 1，10U ul/1 的 EcoR I 内切酶 1.5 μ 1，1U uL I勺
Hind III 内切酶 1.5 μ 1，1X buffer Tango?3 μ 1，ddH20 18 μ I ；
酶切反应条件为:根据Fermentas限制性内切酶手册进行酶切。
[0026]对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图5所示，其中M泳道为DL2000分子量Marker,泳道I为没有进行酶切的pYES2载体对照电泳，泳道2、3均为酶切后载体片段，大小为5.9kb，依据琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒说明书回收纯化被切开后的载体片段，该片段即为纯化的HindII1-pYES2-EcoRI。
[0027](3)利用T4DNA连接酶把步骤I获得的HindII1-GFP+NOS-EcoRI构建到步骤2获得的HindII1-pYES2-EcoRI中，连接反应体系为:
纯化的 HindiΙΙ-GFP+NOS-EcoRI 和 HindiI1-pYES2_EcoRI 各 50ng，3U ul/1 的 T4DNA 连接酶 I μ 1，10ΧΤ4 buffer 2.5μ I, ddH20 补足至 25 μ I。
[0028]连接反应条件为:根据Fermentas公司手册进行连接，同时将连接终产物自命名为pYES2-GFP表达载体，其结构如图3所示。
[0029](4)取步骤3获得的连接产物pYES2-GFP表达载体以EcoR M Hind JJJ进行双酶切，酶切体系为:
120ng/uL-150ng/uL 的 pYES2-GFP 表达载体 6 μ I, 1U ul/1 的 EcoR I 内切酶 1.5μ1，1U ul/1 的 Hind III 内切酶 1.5 μ I, 1X buffer Tango ?3 μ 1，ddH20 18 μ I。
[0030]反应条件为:根据Fermentas限制性内切酶手册进行酶切。
取酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图6所示，图6中M泳道为DL2000分子量Marker，泳道I为步骤3获得的pYES2_GFP载体，泳道2、3均为经双酶切后的PYES2-GFP片段，该片段大小约为5.9kb，GFP+N0S片段理论大小约为980bp可见，GFP+N0S确实连接入PYES2载体中，与目前商用载体pYES2-EGFP (如图1所示)比较而言，增加了Hindlll, NcoI , Sail, XbaM BamH 厕个酶切位点，但由于 NcoI 和 Xball pYES2 载体上还有另外一个切点，因此相比较PYES2-EGFP载体而言增加了 5^7及卩历两个新的、有效酶切位点。
[0031]对pYES2载体的区段进行测序，其中多克隆位点(MCS)序列如SEQ ID N0.1所示，GFP和NOS序列分别如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示:
SEQ ID N0.1:
AAGCTTCCACCATGGCGTGCAGGTCGACTCTAGAG