专利名称：一种构建酵母双价通用表达载体的方法
技术领域：
本发明涉及一种构建双价表达载体的方法。
背景技术：
近些年来随着生物技术迅速发展，通过基因工程对生物进行有目的的改造 已经成为了可能，但所报道多是对单个基因操作转化。然而自然界中生物许多 性状往往是由多个基因控制， 一般生化代谢途径需要多种酶催化作用才能完 成，并且有时单个基因转化常表现为超强表达或抑制沉默，同时转入两个或两 个以上起协同作用的基因对于转基因是迫切需要的。将目的基因构建在同一个 表达载体上，多基因表达载体构建完成后，只需要通过一次转化就可方便地获 得多价基因同时表达的转基因产物。现有构建双价载体的方法都是构建固定的 双价载体，不能构建出可以表达任意目的基因的通用载体。
发明内容
本发明是为了解决现有构建载体的方法不能构建出可以表达任意目的基 因的通用载体的问题，而提供一种构建酵母双价通用表达载体的方法。
本发明构建酵母双价通用表达载体的方法按照以下步骤进行 一、根据酵
母表达载体pYES2序列分别设计引物PGAL1-S、 PGAL1-A、 CYC1-S和 CYC1-A，以质粒pYES2为模板、PGAL1-S和PGAL1-A为引物进行PCR扩 增获得基因片段PGAL1，以质粒pYES2为模板、CYC1-S和CYC1-A为引物 进行PCR扩增获得基因片段CYC1; 二、将步骤一获得的基因片段PGAL1采 用TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)连接到pMD18-T载体，得到质粒 pMD18-PGALl;三、将步骤一获得的基因片段CYC1和步骤二得到的质粒 pMD18-PGALl分别进行Bamffl和双酶切后回收目的片段CYC1和质粒 pMD18-PGALl进行连接，获得质粒pMD18-PC;四、以步骤三得到的质粒 pMD18-PC为模板、PGAL1-A和CYC1-S为引物进行PCR扩增，将扩增得到 的目的片段和质粒pYES2分别用^w2ffl和￡coRI进行双酶切，双酶切后回收 目的片段和质粒pYES2并连接；获得酵母双价通用表达载体pYES2-PC;其中步 骤 一 中 引 物 PGAL1-S 的 序 歹(J 为 5'-ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAG-3'，弓I物PGAL1-A的序列 为5'-CCGGAATTCGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3'，引物CYC1-S的序列 为5'-CGCGGATCCATCATGTAATTAGTTATGTCACG-3'，引物CYC1-A的序 列为5 '-TGCTCTAGAAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG-3'。
用本发明的方法构建出的通用双价载体能够准确表达连接的基因，只需要 将目的基因片段直接连接在本发明构建的通用双价表达载体上就可以准确表 达，用本发明的方法构建出的通用双价载体构建表达两个目的基因片段的载体 不需要中间载体，提高了构建双价表达载体的效率，节约了构建双价表达载体 的时间，节约30%~40%的构建时间。
图1为具体实施方式
十中菌株ToplO-pYES2-PC质粒的PCR检测结果图， 图1中M代表DL2000，1 4代表CYC1-S1和PGAL1-A1为引物的扩增产物， 5~8代表CYC1-S1和CYC1-A1为引物的扩增产物，9~12代表PGAL1-S1和 PGAL1-A1为引物的扩增产物；图2为具体实施方式
十中菌株ToplO-pYES2-PC 质粒的反转录鉴定结果图，图2中M代表DL 2000， 1~4代表CYC1-S1和 CYC1-A1为引物的扩增产物，5~8代表PGAL1-S1和PGAL1-A1为引物的扩 增产物；图3为具体实施方式
十菌株ToplO-pYES2-PC质粒的酶切鉴定结果图， 图3中M代表DL2000， 1代表5a;wffl和^fll双酶切产物；图4为具体实施 方式十酵母单双价表达载体pYES2-GST、 pYES2-CS和pYES2-PC-CS-GST的 PCR图谱，图4中M代表DL2000 (至上而下的条带分别为2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp和100bp) ， 1代表S/ W和五coRI酶切质粒 pYES2-PC-CS-GST, 2代表/C; "I酶切质粒pYES2-PC-CS-GST， 3代表CYC-S 和CYC-A为引物的PCR结果，4代表GST-S和GST-A为引物的PCR结果； 图5为具体实施方式
十中转基因酵母菌对CdS04胁迫的耐受性，图5中CK代 表未经胁迫处理，A代表浓度为3mmo1^1的CdS04溶液，B代表浓度为 5匪ol'L"的CdS04溶液，C代表浓度为8mmol'I/'的CdS04溶液，1代表转 GST基因酵母，2代表转CS基因酵母，3代表共转化GST+CS基因酵母，4 代表未转基因酵母；图6为具体实施方式
十中转基因酵母菌对CuS04胁迫的耐受性，图6中CK代表未经胁迫处理，A代表浓度为lmmoWU1的CuS04 溶液，B代表浓度为3mmo1，1/1的CuS04溶液，C代表浓度为5mmol，L—1的 CuS04溶液，1代表转GST基因酵母，2代表转CS基因酵母，3代表共转化 GST+CS基因酵母，4代表未转基因酵母。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式构建酵母双价通用表达载体的方法按照以下 步骤进行 一、根据酵母表达载体pYES2序列分别设计引物PGAL1-S、 PGAL1-A、 CYC1-S和CYC1-A，以质粒pYES2为模板、PGAL1-S和PGAL1-A 为引物进行PCR扩增获得基因片段PGAL1，以质粒pYES2为模板、CYC1-S 和CYC1-A为引物进行PCR扩增获得基因片段CYC1; 二、将步骤一获得的 基因片段PGAL1采用TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)连接到pMD18-T 载体，得到质粒pMD18-PGALl;三、将步骤一获得的基因片段CYC1和步骤 二得到的质粒pMD18-PGALl分别进行&mffl和JK^1双酶切后回收目的片段 CYC1和质粒pMD18-PGALl进行连接，获得质粒pMD18-PC;四、以步骤三 得到的质粒pMD18-PC为模板、PGAL1-A和CYC1-S为引物进行PCR扩增， 将扩增得到的目的片段和质粒pYES2分别用BamHI和五coRI进行双酶切，双 酶切后回收目的片段和质粒pYES2并连接；获得酵母双价通用表达载体 pYES2-PC ; 其中步骤 一 中弓l物 PGAL1-S 的序列为 5'-ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAG-3'，引物PGAL1-A的序列 为5'-CCGGAATTCGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3'，引物CYC1-S的序列 为5'-CGCGGATCCATCATGTAATTAGTTATGTCACG-3'，引物CYC1-A的序 列为5 '-TGCTCTAGAAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG-3'。
本实施方式酵母表达载体pYES2购自于Addgene公司，休哈塔假丝酵母 基因组DNA利用天净沙公司的真菌基因组DNA提取试剂盒得到。本实施方 式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求 则浓度为产品标注浓度。
本实施方式步骤一至四参见试剂盒使用操作手册。本实施方式步骤一至四各步骤得到的质粒经PCR验证后可转化入五.②/z' DH5a中保存和扩增。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中以 质粒pYES2为模板、PGALl-S和PGALl-A为引物进行PCR扩增的体系为20^L 由14mL的去离子水、2^L的10xTaqBuffer、 0.5^L浓度为1Ommol/L的dNTP、 lpL浓度为1Ommol/L的引物PGAL1-S、 lpL浓度为1Ommol/L的引物 PGAL1-A、 0.5pL浓度为2.5U/pL的Taq DNA聚合酶和l^iL的质粒pYES2组 成；PCR反应条件预变性94。C lmin，变性94°C 0.5min、退火57°C 0.5min、 延伸72°C lmin，共38个循环，延伸72°C 7min。其它步骤及参数与具体实 施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中以 质粒pYES2为模板、CYC1-S和CYC1-A为引物进行PCR扩增的体系为20pL 由14^iL的去离子水、2pL的10xTaqBuffer、 0.5|iL浓度为10mmol/L dNTP、 lpL浓度为10mmol/L的引物CYCl-S、liiL浓度为10mmol/L的引物CYC1-A、 0.5pL浓度为2.5U4iL的Taq DNA聚合酶和lpL的质粒pYES2组成；PCR反 应条件预变性94°C lmin，变性94°C 0.5min、退火57°C 0,5min、延伸72 °C lmin，共38个循环，延伸72°C 7min。其它步骤及参数与具体实施方式
一 相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤三中质 粒pMD18-PGALl进行5awffl和双酶切的体系为20pL由lpL的5amHI、 1HL的Wal、 2pL的10xM buffer、 10pL浓度为0.1g/L的质粒pMD18-PGALl 和余量的去离子水组成；双酶切的反应是在37'C的条件下反应10~14小时。 其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤三中基 因片段CYC1进行5amHI和力al双酶切的体系为20|aL由lpL的Bamffl、 l^iL 的WaI、 2pL的10xMbuffer、 10pL浓度为0.1g/L的基因片段CYC1和余量的 去离子水组成；双酶切反应的条件为在37i:的条件下反应10 14小时。其它 步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤三中将回收的目的片段CYC1和质粒pMD18-PGALl用14连接酶进行连接；连接体 系20|iL由2pL的10xT4DNA连接酶Buffer、 ljxL浓度为2.5U/pL的T4DNA 连接酶、4pL浓度为0.1g/L的回收的目的片段CYC1、 4nL浓度为0.1g/L的回 收的质粒pMD18-PGALl和余量的去离子水组成；连接反应条件为在4°C的条 件下反应10~14小时。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤四中以 步骤三得到的质粒pMD18-PC为模板、PGAL1-A和CYC1-S为引物进行PCR 扩增的体系为20(aL由14pL的去离子水、2nL的10xTaqBuffer、 0.5|_iL浓度为 10mmol/L dNTP、 l^L浓度为10mmol/L的引物CYC1-S、 lpL浓度为10mmol/L 的引物PGAL1-A、 0.5pL浓度为2.5U/pL的Taq DNA聚合酶和l^iL的质粒 pMD18-PC组成；PCR反应条件预变性94°C lmin，变性94°C 0.5min、退 火57" 0.5min、延伸72°C lmin，共38个循环，延伸72°C 7min。其它步骤 及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤四中将 扩增得到的目的片段用^mffl和￡mRI进行双酶切的体系为20^由1jiL的 BawHK lpL的￡coRI、 2^iL的10xM buffer、 10|xL浓度为O.lg/L的目的片段 和余量的去离子水组成；双酶切反应的条件为在37'C的条件下反应10~14小 时。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤四中双 酶切后回收的目的片段和质粒pYES2用T4连接酶进行连接；连接体系2(HiL 由2pL的10xT4DNA连接酶Buffer、 lpL浓度为2.5U/pL的T4DNA连接酶、 4piL浓度为O.lg/L的回收的目的片段、4^L浓度为O.lg/L的回收的质粒pYES2 和余量的去离子水组成；连接反应条件为在4t:的条件下反应10 14小时。其 它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十本实施方式构建酵母双价通用表达载体的方法按照以下 步骤进行 一、根据酵母表达载体pYES2序列分别设计引物PGAL1-S、 PGAL1-A、 CYC1-S和CYC1-A，以质粒pYES2为模板、PGAL1-S和PGAL1-A 为引物进行PCR扩增获得基因片段PGAL1，以质粒pYES2为模板、CYC1-S 和CYC1-A为引物进行PCR扩增获得基因片段CYC1; 二、将步骤一获得的基因片段PGAL1采用TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)连接到pMD18-T 载体，得到质粒pMD18-PGALl;三、将步骤一获得的基因片段CYCl和步骤 二得到的质粒pMD18-PGALl分别进行5awffl和^al双酶切后回收目的片段 CYC1和质粒pMD18-PGALl进行连接，获得质粒pMD18-PC;四、以步骤三 得到的质粒pMD18-PC为模板、PGAL1-A禾口 CYC1-S为引物进行PCR扩增， 将扩增得到的目的片段和质粒pYES2分别用^w/HI和五②RI进行双酶切，双 酶切后回收目的片段和质粒pYES2并连接；获得酵母双价通用表达载体 pYES2-PC ; 其中步骤一中引物 PGAL1-S 的序列为 5'画ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAG-3'，引物PGAL1-A的序列 为5'-CCGGAATTCGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3'，引物CYC1-S的序列 为5'-CGCGGATCCATCATGTAATTAGTTATGTCACG-3'，引物CYC1-A的序 列为5'画TGCTCTAGAAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG國3'。
本实施方式步骤一中以质粒pYES2为模板、PGAL1-S和PGAL1-A为引 物进行PCR扩增的体系为20pL由14joL的去离子水、2pL的10xTaqBuffer、 0.5nL浓度为10mmol/L的dNTP、 l(iL浓度为10mmol/L的引物PGAL1-S、 lpL 浓度为10mmol/L的引物PGALl-A、0.5pL浓度为2.5U/pL的Taq DNA聚合酶 和1^iL的质粒pYES2组成；PCR反应条件预变性94°C lmin，变性94°C 0.5min、退火57°C 0.5min、延伸72°C lmin，共38个循环，延伸72°C 7min。
本实施方式步骤一中以质粒pYES2为模板、CYC1-S和CYC1-A为引物 进行PCR扩增的体系为20pL由14^L的去离子水、2pL的10xTaq Buffer、0.5pL 浓度为10mmol/L dNTP、 lpL浓度为10mmol/L的引物CYC1-S、 1^iL浓度为 10mmol/L的引物CYC1-A、 0.5fiL浓度为2.5U/pL的Taq DNA聚合酶和l^iL 的质粒pYES2组成；PCR反应条件预变性94。C lmin，变性94°C 0.5min、 退火57。C 0.5min、延伸72°C lmin，共38个循环，延伸72°C 7min。
本实施方式步骤三中质粒pMD18-PGALl进行^w7ffl和^Z^I双酶切的体 系为20^iL由lnL的5awffl、 的WaI、 2pL的10xMbuffer、 10pL浓度为 0.1g/L的质粒pMD18-PGALl和余量的去离子水组成；双酶切的反应是在37 "C的条件下反应12小时。
本实施方式步骤三中基因片段CYCl进行^m2ffl和^&"I双酶切的体系为20^iL由l^iL的5awHI、 l(jL的WaI、 2jiL的10xMbuffer、 lOpiL浓度为O.lg/L 的基因片段CYC1和余量的去离子水组成；双酶切反应的条件为在37'C的条 件下反应12小时。
本实施方式步骤三中将回收的目的片段CYC1和质粒pMD18-PGALl用 T4连接酶进行连接；连接体系20iiL由2pL的10xT4DNA连接酶Buffer、 lpL 浓度为2.5U4iL的T4DNA连接酶、4pL浓度为0，1g/L的冋收的目的片段 CYC1、 4pL浓度为O.lg/L的回收的质粒pMD18-PGALl和余量的去离子水组 成；连接反应条件为在4-C的条件下反应12小时。
本实施方式步骤四中以步骤三得到的质粒pMD18-PC为模板、PGAL1-A 和CYC1-S为引物进行PCR扩增的体系为20pL由14pL的去离子水、2^L的 10xTaq Buffer、 0.5jiL浓度为10mmol/L dNTP、 lioL浓度为10mmol/L的引物 CYC1-S、 lpL浓度为10mmol/L的引物PGAL1-A、 0.5mL浓度为2.5U4iL的 Taq DNA聚合酶和lpL的质粒pMD18-PC组成；PCR反应条件预变性94°C lmin，变性94。C 0.5min、退火57°C 0.5min、延伸72°C lmin，共38个循环， 延伸72"C 7min。
本实施方式步骤四中将扩增得到的目的片段用Bflmffl和￡^RI进行双酶 切的体系为20^L由lnL的Bawffl、 l|iL的五coRI、 2pL的10xMbuffer、 lO^iL 浓度为O.lg/L的目的片段和余量的去离子水组成；双酶切反应的条件为在37 'C的条件下反应12小时。
本实施方式双酶切后回收的目的片段和质粒pYES2用T4连接酶进行连 接；连接体系20^iL由2^L的10xT4DNA连接酶Buffer、 1^iL浓度为2.5U/(iL 的T4DNA连接酶、4^L浓度为O.lg/L的回收的目的片段、4pL浓度为O.lg/L 的回收的质粒pYES2和余量的去离子水组成；连接反应条件为在4'C的条件 下反应12小时。
对本实施方式构建的载体进行以下检测实验
一、将来自西伯利亚蓼的GST(GenBank: EU597480)和CS(GenBank: EU597481)两个基因连接到本实施方式制备的酵母双价通用表达载体 pYES2-PC，命名为pYES2-PC-CS-GST，再将pYES2-PC-CS-GST转化到酿酒 酵母中，进行PCR检测和酶切鉴定，PCR检测结果如图l所示，酶切鉴定结果如图2所示，从图1和图2可以看出PCR检测和酶切鉴定的结果均为阳性， GST基因和CS基因已经成功的连接到本实施方式制备的酵母双价通用表达载 体pYES2-PC上。将此双价表达载体送上海生工对其进行测序，测序结果表明 连接入载体的外源DNA序列准确，无碱基突变现象发生。同时利用反转录 PCR，反转录PCR结果如图3所示，图3能够看出两个外源基因均能在转录 水平得以表达，进一步证明用此方法构建的双价载体是能够应用于转基因实 践、能快速有效地实现一次转化转入两个基因的目标。
二、将GST(GenBank: EU597480)和CS(GenBank: EU597481)两个基因分 别以GST-S ( 5'-GCTCTAGAACCATGGCAACCACCATAGACAGAG-3')、 GST國A ( 5'-GGGGTACCTCACTTCTTCCCGAAGGCCTTGAAG-3' ) 、 CYC-S (5'-GCTCTAGAACAATGGCGTCTCTGGTCAACTTC國3')和 CYC画A (5'國CGGGATCCTCAAACCTCGGGTTGCATTTTTTCG画3')为引物进行PCR 扩增，其中引物GST-S和GST-A用于扩增GST基因，引物CYC-S和CYC-A 用于扩增CS基因。用限制性内切酶《; 《1和///"(1111双酶切回收产物GST及 质粒pYES2，双酶切后回收目的片段并连接，转化大肠杆菌ToplO感受态， 提取转化子质粒进行酶切和PCR鉴定，得到酵母单价表达载体pYES2-GST; 用限制性内切酶Sp/zl和￡coRI双酶切回收产物CS及质粒pYES2，双酶切后 回收目的片段并连接，转化大肠杆菌ToplO感受态，提取转化子质粒进行酶切 和PCR鉴定，得到酵母单价表达载体pYES2-CS; S/ W和EcoRI双酶切本实 施方式制备的酵母双价通用表达载体pYES2-PC和CS，双酶切后回收目的片 段并连接，得到pYES2-PC-CS，酶切pYES2-PC-CS和GST通过T4DNA 连接获得酵母双价表达载体pYES2-PC-CS-GST。
1、 将表达载体pYES2-GST、 pYES2-CS和pYES2-PC-CS-GST进行PCR 检测和酶切鉴定，酶切检测和PCR检测结果如图4所示，从图4可以看出载 体pYES2-GST、 pYES2-CS和pYES2-PC-CS-GST的检测结果均为阳性。
2、 转基因酵母菌对CdS04胁迫的耐受性将质粒pYES2-GST、 pYES2-CS 和pYES2-PC-CS-GST转入酿酒酵母中，分别命名为TY-GST、TY-CS和TY-GC。 在无菌条件下，分别挑取TY-GST、 TY-CS、 TY-GC和WY酵母接种于SC-U 液体选择培养基中，在3(TC的条件下，以200r/min的速度震荡培养24h，测其OZ)60()值，计算所需的菌液量，调节20mL的诱导培养基中菌液的OZ)6oo值 至0.4，在30'C的条件下诱导表达30h，取诱导的100pL酵母菌体，瞬时离心 10s，弃去上清，菌体分别重悬于CdS04的浓度为3mmol丄"、5mmoW^1和 8mmol'L"的lmL溶液中，置于3(TC下胁迫。胁迫后，用无菌水重悬菌体， 涂布于SC-U培养基中(2。/。葡萄糖为碳源)，以未胁迫的TY-GST、TY-CS、TY-GC 和WY酵母菌体作为对照，3(TC下培养直至长出单菌落，照相记录结果。结 果如图5所示，图5表明，在CdS04胁迫条件6h时，3个转基因酵母菌生长 和对照菌成活率无差异，在12h至24h时3个转基因酵母菌成活率无明显差异， 但在5mmol叱"CdS04胁迫处理后，转基因酵母仍有存活，而对照成活率却为 0，在胁迫处理48h后，在3mmol，L—1 CdS04胁迫下转基因酵母和对照酵母仍 有部分菌落存活，5mmol叱"CdS04胁迫处理后只有转基因酵母TY-GC酵母菌 存活，在8mmol，L"CdSOj办迫处理后，转基因酵母菌和对照酵母的成活率均 为0。说明3个转基因酵母菌的耐重金属CdS04能力均远高于对照WY，其 中转基因酵母TY-GC的耐受CdS04的能力最高。说明GST和CS基因均具有 耐受CdS04的能力，且转双价酵母菌能够起到相互协同作用，进一步说明转 入的两个基因在酵母中均得到了表达。
2、转基因酵母菌对CuS04胁迫的耐受性将质粒pYES2-GST、 pYES2-CS 和pYES2-PC-CS-GST转入酿酒酵母中，分别命名为TY-GST、 TY-CS和 TY-GC。在无菌条件下，分别挑取TY-GST、 TY-CS、 TY-GC和WY酵母接 种于SC-U液体选择培养基中，在30'C的条件下，以200 r/min的速度震荡培 养24h，测其OD^值，计算所需的菌液量，调节20mL的诱导培养基中菌液 的OZ)6oo值至0.4，在3(TC的条件下诱导表达30h，取诱导的100pL酵母菌体， 瞬时离心10s，弃去上清，菌体分别重悬于CuS04浓度为lmmohl^JmmoNL-1 和SmmoHL"的lmL溶液中，置于3(TC下胁迫。胁迫后，用无菌水重悬菌体， 涂布于SC-U培养基中(2%葡萄糖为碳源)，以未胁迫的TY-GST、 TY-CS、 TY-GC和WY酵母菌体作为对照，在30°C的条件下培养直至长出单菌落，照 相记录结果。结果如图6所示，图6表明，在CuS04胁迫条件6h时，3个转 基因酵母菌生长和对照菌差异不显著，在12h至24h时3个转基因酵母菌生长 明显高于对照酵母菌，对照酵母菌的成活率随着CuS04浓度的增高而逐渐降低，在24h的成活率为0，在胁迫处理48h后，转基因酵母菌TY-CS和TY-GC 在ImmoW/1 CuS04的胁迫下仍有存活，而随着CuS04浓度的增高成活率为0。 说明转基因酵母菌TY-CS和TY-GC的耐重金属CuS04能力高于转基因酵母 TY-GST，并且3个转基因酵母菌的耐重金属CuS04能力均远高于对照WY。说 明GST和CS基因均具有耐受CuS04的能力。而转双价酵母菌中CS基因能够 协助GST基因提高转基因酵母的耐受CuS04的作用，进一步说明转入的两个 基因在酵母中均得到了表达。序列表
<110〉东北林业大学
〈120〉 一种构建酵母双价通用表达载体的方法
<160〉 8
〈210> 1 〈211〉 30 <212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220〉
<223>根据酵母表达载体pYES2序列设计的引物PGAL1-S。 <400〉 1
acggattaga agccgccgag cgggtgacag 30
〈210> 2 <211〉 31 <212〉腿 <213>人工序列
<220〉
〈223>根据酵母表达载体pYES2序列设计的引物PGAL1-A。 <400〉 2
ccggaattcg gttttttctc cttgacgtta a 31
<210> 3 <211〉 32 <212> DNA <213>人工序列
<220〉
<223〉根据酵母表达载体pYES2序列设计的引物CYC1-S。 <400〉 3
cgcggatcca tcatgtaatt agttatgtca cg 32
〈210> 4 <211〉 31 <212>腿 <213〉人工序列<formula>formula see original document page 16</formula><220>
〈223〉用于扩增CS基因的引物CYC-A。 <400〉 8
cgggatcctc aaacctcggg ttgcattttt tcg 3权利要求
1、一种构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在于构建酵母双价通用表达载体的方法按照以下步骤进行一、根据酵母表达载体pYES2序列分别设计引物PGAL1-S、PGAL1-A、CYC1-S和CYC1-A，以质粒pYES2为模板、PGAL1-S和PGAL1-A为引物进行PCR扩增获得基因片段PGAL1，以质粒pYES2为模板、CYC1-S和CYC1-A为引物进行PCR扩增获得基因片段CYC1；二、将步骤一获得的基因片段PGAL1采用TA克隆方法连接到pMD18-T载体，得到质粒pMD18-PGAL1；三、将步骤一获得的基因片段CYC1和步骤二得到的质粒pMD18-PGAL1分别进行BamHI和XbaI双酶切后回收目的片段CYC1和质粒pMD18-PGAL1进行连接，获得质粒pMD18-PC；四、以步骤三得到的质粒pMD18-PC为模板、PGAL1-A和CYC1-S为引物进行PCR扩增，将扩增得到的目的片段和质粒pYES2分别用BamHI和EcoRI进行双酶切，双酶切后回收目的片段和质粒pYES2并连接；获得酵母双价通用表达载体pYES2-PC；其中步骤一中引物PGAL1-S 的序列为5′-ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAG-3′，引物PGAL1-A的序列为5′-CCGGAATTCGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3′，引物CYC 1-S的序列为5′-CGCGGATCCATCATGTAATTAGTTATGTCACG-3′，引物CYC 1-A的序列为5′-TGCTCTAGAAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG-3′。
2、 根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在 于步骤一中以质粒pYES2为模板、PGAL1-S和PGAL1-A为引物进行PCR扩 增的体系为20fiL由14pL的去离子水、2^iL的10xTaq Buffer、 0.5^iL浓度为 10mmol/L的dNTP、 l^iL浓度为10mmol/L的引物PGAL1-S、 l^L浓度为 10mmol/L的引物PGAL1-A、 0.5pL浓度为2.5U/^iL的Taq DNA聚合酶和ljxL 的质粒pYES2组成；PCR反应条件预变性94。C lmin，变性94°C 0.5min、 退火57。C 0.5min、延伸72°C lmin，共38个循环，延伸72°C 7min。
3、 根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在 于步骤一中以质粒pYES2为模板、CYC1-S和CYC1-A为引物进行PCR扩增 的体系为20pL由14pL的去离子水、2pL的10xTaq Buffer、 0.5pL浓度为 10mmol/LdNTP、 lpL浓度为10mmol/L的引物CYC1-S、 1^L浓度为10mmol/L的引物CYCl-A、0.5nL浓度为2.5U4iL的TaqDNA聚合酶和l^iL的质粒pYES2 组成；PCR反应条件预变性94。C lmin，变性94。C 0.5min、退火57°C 0.5min、 延伸72-C lmin,共38个循环，延伸72°C 7min。
4、 根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在 于步骤三中质粒pMD18-PGALl进行^wwffl和^Zjal双酶切的体系为2(HiL由 1^iL的5a附ffl、 l(jL的WaI、 2pL的10xMbuffer、 IO^iL浓度为O.lg/L的质粒 pMD18-PGALl和余量的去离子水组成；双酶切的反应是在37'C的条件下反应 10~14小时。
5、 根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在 于步骤三中基因片段CYC1进行5amffl和Wfll双酶切的体系为20pL由lpL 的5awHI、 l^L的力"I、 2piL的10xMbuffer、 10nL浓度为O.lg/L的基因片段 CYC1和余量的去离子水组成；双酶切反应的条件为在37"C的条件下反应 10~14小时。
6、 根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在 于步骤三中将回收的目的片段CYC1和质粒pMD18-PGALl用14连接酶进行 连接；连接体系20^iL由2^L的10xT4DNA连接酶Buffer、 lpL浓度为2.5U/pL 的T4DNA连接酶、4^iL浓度为O.lg/L的回收的目的片段CYC1、 4pL浓度为 O.lg/L的回收的质粒pMD18-PGALl和余量的去离子水组成；连接反应条件为 在4"C的条件下反应10~14小时。
7、 根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在 于步骤四中以步骤三得到的质粒pMD18-PC为模板、PGAL1-A和CYC1-S为 引物进行PCR扩增的体系为20^L由14pL的去离子水、2^L的10xTaq Buffer、 0.5jiL浓度为10mmol/LdNTP、 ljiL浓度为10mmol/L的引物CYC1-S、 lpL浓 度为1Ommol/L的引物PGALl-A、0.5^iL浓度为2.5U/^iL的Taq DNA聚合酶和 l^iL的质粒pMD18-PC组成；PCR反应条件预变性94。C lmin,变性94°C 0.5min、退火57°C 0.5min、延伸72°C lmin，共38个循环，延伸72°C 7min。
8、 根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在 于步骤四中将扩增得到的目的片段用B"mHI和&oRI进行双酶切的体系为 20pL由1^iL的Aamffl、 lpL的五coRI、2^L的10xM buffer、 10pL浓度为O.lg/L的目的片段和余量的去离子水组成；双酶切反应的条件为在37"C的条件下反 应10~14小时。
9、根据权利要求1所述的构建酵母双价通用表达载体的方法，其特征在 于步骤四中双酶切后回收的目的片段和质粒pYES2用T4连接酶进行连接；连 接体系20^l由2kiL的10xT4dna连接酶Buffer、 1^iL浓度为2.5U4iL的 t4dna连接酶、4^L浓度为0.1g/L的回收的目的片段、4pL浓度为O.lg/L的 回收的质粒pYES2和余量的去离子水组成；连接反应条件为在4X:的条件下 反应10~14小时。
全文摘要
一种构建酵母双价通用表达载体的方法，它涉及一种构建双价表达载体的方法。本发明解决了现有构建载体的方法不能构建出可以表达任意目的基因的通用载体的问题。本发明构建酵母双价通用表达载体的方法按照以下步骤进行一、根据酵母表达载体pYES2序列分别设计引物，进行PCR扩增获得目的片段PGAL1和目的片段CYC1；二、得到质粒pMD18-PGAL1；三、获得质粒pMD18-PC；四、双酶切后回收目的片段和质粒pYES2并连接；获得酵母双价通用表达载体pYES2-PC。用本发明的方法构建出的通用双价载体能够准确表达连接的基因，只需要将目的基因片段直接连接在本发明构建的通用双价表达载体上就可以准确表达。
文档编号C12N15/81GK101407823SQ200810209569
公开日2009年4月15日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者刘关君, 刘明坤, 刘桂丰, 杨传平, 王柏臣, 许志茹, 阎秀峰, 魏志刚 申请人:东北林业大学