专利名称：Il1r1基因启动子区的snp位点、其确定法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种SNP(单核苷酸多态性)位点，特别是涉及一种IL1R1基因(IL-1 受体I型)启动子区域中的SNP位点、其确定方法及应用。
背景技术：
IL-1R I (I型)和IL-1R II (II型)是一类细胞膜受体，结构为一种只有一条多 肽链的跨膜蛋白，二者的细胞外部分具有同源性，含有3个免疫球蛋白样结构域，大约325 个氨基酸。其胞浆部分差异较大，IL-1R I由215个氨基酸组成，而IL-1R 1I只有29个氨 基酸。多数细胞同时具有IL-1R I、IL-1R II二种受体。IL-1 a与IL-1RI的结合亲和力 是IL-113与IL-1R I的10倍。IL-1通过与IL-1R I结合发挥其生物活性。IL-1R II也 称为"decoy"受体，IL-1与IL-1R II结合后不具有活性。转导IL_1剌激信号的主要是 IL-1R I/IL-lR-AcP(IL-lR accessory protein)复合物，而IL-1R II通过与IL-1R I竞 争结合IL-1起抑制作用。IL-4(Interleukin 4)通过诱导IL1R2基因的表达和释放，拮抗 IL-1的生物活性。IL1R1基因和IL1R2基因属于IL-1受体家族，与IL1RL1 (interleukin 1 rec印tor-like 1，ST2)禾口 IL1RL2 (inter—leukin 1 rec印tor—like 2)形成一个细胞因子 受体基因簇位于2q12。 对IL1R1基因缺失小鼠的研究发现1)IL1R1—/—小鼠不能应答IL-1的剌激，包括用 IL-1剌激不能诱导IL-6和E-选择素表达等，证实IL-1R I是IL-1 a和IL_1 P唯一的信 号传导受体；2)在感染或高脂饮食情况下，IL-1R I具有促进动脉粥样硬化斑块演变的作 用；3)机体内的IL-lRa表达和IL_1/IL_1R I结合之间存在一种平衡，通过这种平衡机制， 可调节机体对炎症的应答反应。新近发现，脂肪组织亦可表达IL-1R I和IL-lR-AcP。
目前，国内外对ILIRI基因与疾病相关性的研究很少。McCarthy等在一组出现代 谢异常症状的冠心病人群中研究发现，IL1R1基因多态与该人群代谢综合征的发生相关。但 Zee等在一项前瞻性研究中，未发现IL1R1基因多态(EX0N1B， T/C多态)与冠状动脉粥样 硬化的病变程度和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA术)后再狭窄的发生相关。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种IL1R1基因启动子区域中的SNP位点、其 确定方法及应用，为治疗或预防冠心病方面的研究开拓新的途径。 为解决上述技术问题，本发明的IL1R1基因(IL-1受体I型)启动子区域中的SNP 位点，是IL1R1基因启动子区域-1253位的T/C多态(cttttttttt (T/C) cctgtatttg)，具有 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。 本发明的IL1R1基因启动子区域中的SNP位点的确定方法，包括步骤 1)提取宿主细胞的基因组DNA ; 2)将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物纯化； 3)纯化后的PCR产物进行DNA测序，从而确定SNP位点。
3
所述步骤2)中的PCR扩增引物和步骤3)中的测序引物都为上游
3， -gcctggaactggtgattgg-5，，下游3， -cagcctgagtgacagagtgaga-5，。 本发明的IL1R1基因启动子区域中的SNP位点的基因型确定方法，包括步骤 1)提取宿主细胞的基因组DNA ; 2)将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物纯化； 3)纯化后的PCR产物进行PCR延伸反应，树脂纯化； 4)芯片点样后，质谱检测，进行数据分析，从而确定SNP位点的基因型。 所述步骤2)中的PCR扩增的引物是上游3' -acgttggatggtctcgcatggttagaaaat
c-5，，下游3， -acgttggatgccatctcaaaaaaaaaaaagg-5，；步骤3)中的延伸反应的弓l物是下
游3' ltgctttttaaacaaatacagg-5'o 本发明的IL1R1基因启动子区域中的SNP位点(IL1R1基因启动子区域-1253位 的T/C多态)与冠心病、冠脉病变程度(冠状动脉粥样硬化病变程度)和脂代谢异常相关， 因此，通过对该基因多态的研究开发可用于冠心病方面，如控制冠心病发病、冠状动脉粥样 硬化病变程度或脂代谢异常。
图1是PCR扩增反应程序图。
具体实施例方式( — )研究对象 1.侯选基因SNPs检测样本 24个没有亲缘关系的样本，冠心病确诊患者和健康对照各12例。
2.入选SNPs分型样本
1)冠心病组(CAD组) 来自上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科病房，共286例，平均年龄 60. 57± 10. 37岁，冠心病诊断参照1979年WHO颁布的缺血性心脏病诊断标准，均经冠状动 脉造影确诊和/或有明确急性心肌梗死病史者。冠状动脉造影显示冠状动脉管腔狭窄> 70%的，诊断为冠状动脉病变；左主干管腔狭窄> 50%的，诊断为二支冠状动脉病变。排除 糖尿病、脑梗塞、免疫性疾病、神经系统性疾病、恶性肿瘤和肝肾疾患者。
2)正常对照组(CONTROL组) 来自上海交通大学医学院附属瑞金医院内科门诊和体检中心的健康体检，共202 例，平均年龄52. 83 ± 7. 70岁，经病史、体检、心电图等检查排除冠心病、高血压病、糖尿病、 脑梗塞、免疫性疾病、神经系统性疾病、恶性肿瘤和肝肾疾病患者。
3.目的片段PCR扩增 l)PCR反应体系(25ii 1) :10 X Buffer 2. 5 ii 1， dNTPmix (10mM) 0. 75 ii 1， MgCl2(25mM)2iil， Hotsta/ T叫DNA聚合酶(5U/iU， QIAGEN) 0. 3 yl，引物(上游 3， _gcctggaactggtgattgg_5，，下游3， _cagcctgagtgacagagtgaga_5， ， 10 li M) 0. 75 li 1 X 2， DNA模板(20ng/iU，白细胞中提取)1 P l，其余为双蒸水。 2)PCR反应程序95。C变性2min ;94。C变性30sec，62。C退火lmin，72。C延伸40sec，共35个循环；最后72。C延伸5min ;4"①。
4. PCR产物纯化(SAP和Exon I纯化) 纯化体系(7 ii 1) :PCR产物5 iil，虫下碱性磷酸酶(SAP, 7. 633U/ iU， ABI Biosystem)O. 16 ii l，外切酶(Exon I，20U/ii 1， ABI Biosystem)O. 25 ii l，其余为双蒸水。
纯化反应37。C孵育15min，80。C 15min。
5.测序反应(双向直接测序) 1)反应体系测序引物(0.8iiM)、PCR纯化产物和荧光测序MIX各2iil，其中测序 引物序列如同上述PCR扩增1)步骤中的引物序列。
2)PCR扩增反应
如图1所示。
3)乙醇沉淀 4)测序反应产物聚丙烯酰胺凝胶电泳在自动测序仪上进行48道6% (6g/100ml)聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6.确定SNP位点
(二)SNP分型
MALDI-TOF质谱检测 1.引物设计应用MassARRAY Assay Design2. 0软件设计多重PCR引物。
2. PCR扩增反应
1)反应体系(5 ill): 10 XBuffer 0. 625 ii 1， dNTPmix (10mM) 0. 25 ii 1， MgCl2 (25mM) 0. 325 ii 1，引物(上 游3' icgttgg3tggtctcgc3tggtteg朋朋tc-5'，下游3' icgttgg3tgcc3tctc朋333333朋 aagg-5，，10pM)0. 125iUX2， DNA模板(10ng/iU，白细胞中提取)1 iU， Hotsta, Taq DNA 聚合酶(5U/ ii 1 ， QIAGEN) 0. 03 iil ，其余为双蒸水。
2)反应程序95。C变性15min ;95。C变性20sec，56。C退火30sec，72。C延伸lmin，45个循环； 72。C延伸3min ;4。C①。
3. PCR产物纯化
1)反应体系(7 ill):PCR产物5 ii 1 ， SAP混合液(SEQUENOM) 2 ii 1 (SAP 0. 3 ii 1 ， hME Buffer 1. 7 ii 1)。 2)反应程序 37°C 20min ;85。C 5min ;4。C①。 4.延伸反应 1)反应体系(9 ill): SAP纯化产物7 ii 1 ，延伸反应弓I物(下游3' -atgctttttaaacaaatacagg-5'， 50iimol/L)0. 36ii 1， MassEXTEND酶(MassEXTEND Starter Kit, SEQUENOM) 0. 018 ii 1，延 伸混合物0. 2 ii 1 (hME Buffer和50 ii M d/ddNTP混合物，MassEXTEND Mix, SEQUENOM)，其 余为双蒸水。 2)反应程序94。C 2min ;94。C 5min，52。C 5min，72。C 5min，55个循环；72。C 3min ;
5. Resin树脂纯化每个延伸反应产物用3mg Clean Resin树脂(SEQUEN0M)纯化。 6.芯片点样将纯化产物移至384孔Spectro CHIP芯片(SEQUENOM)。 7. MassARRAY Analyzer质谱检测(SEQUENOM)，运行MassARRAY Typer 3. 0. 1软
件进行数据分析。(三)统计方法 应用SPSS 13. 0 for Windows软件进行数据分析和统计组间均数比较采用t检 验；组间频数分布比较采用乂2检验；相关疾病基因型风险率采用比数比(odds ratio,OR) 和95%可信区间(95% CI)表示；多组间均数比较采用单向方差分析(0neiayAN0VA) 。 P < 0. 05为有统计学意义。
(四)结果 1.比较冠心病组和对照组间临床和实验室指标 冠心病组和对照组间临床和实验室指标见表1，由表1可知，冠心病组的年龄、收 縮压(SBP)、舒张压(DBP)、体重指数(BMI)、甘油三脂(TG)、载脂蛋白(APOA)与对照组相比 有显著差异(P < 0. 01) ;二组的载脂蛋白B(APOB)和脂蛋白(a) (LPA)与对照组相比亦有 差异(P < 0. 05)。 表1冠心病组和对照组的临床和生化指标
指标 (Index)
对照组 (CONTROL组)
冠心病组 (CAD组)
性别(男性/女性)
135/67
224/62
SEX(M/F) 年龄AGE 收缩压SBP
117.87±12. 16
52. 83±7. 70
134. 26±20. 82;
60. 57 ±10. 37;
mmHg 舒张压DBP 画Hg 体重指数BMI
kg/m2 空腹血糖GLU
mmol/L 甘油三脂TG
76. 99±8. 18
23. 09±2. 65
4. 88±3. 11
1.39±0. 62
81.76±11.90a
24. 39 ±3. 03'
5.93±1. 02'
1.83±1. 09'
6腿ol/L 胆固醇CH 高密度脂蛋白胆固醇HDL-C
mraol/L 低密度脂蛋白胆固醇LDL-C 隨ol/L 载脂蛋白A AP0A g/L
载脂蛋白B APOB g/L
脂蛋白(a) LPA
__
4. 80±0. 79 1.24±0. 24
2. 74 ±0. 74
1.47±0. 20
0. 87±0. 14
0. 22±0. 14
4. 71 ±1. 09
1. 12±0. 26a
2. 84±1. 15 1. 34±0. 22a 0. 95±0. 32b 0. 28±0. 21b 与对照组比较aP < 0. 01， bP < 0. 05
2. IL1R1基因与冠心病关系 IL1R1基因启动子区域-1253位点T/C多态是首次发现的新SNP位点，具体序列见 SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列(白细胞中抽提的基因组DNA)。 1)冠心病组与对照组在冠心病组中，IL1R1基因T-1253C多态的基因型分布(CC
=12、TC = 12、TT = 262)及其等位基因频率(T = 93. 71%、C = 6. 29% )与对照组(1、5、
196 ;98. 27%、1. 73% )相比均有显著性差异(分别x 2 = 7. 463， P = 0. 024 ; x 2 = 11. 695，
P = 0. 001)。经危险度分析提示，IL1R1基因T-1253C多态是冠心病发病的危险因素，CC纯
合子CAD的发病危险是T等位基因携带者的8. 476倍(表2)。 表2 IL1R1基因T-1253C多态基因型和等位基因频率在各组中的分布
组别 例数.
a:
TT TCCC
尸
等位基因频率(％)
a:
尸
T
C
对照组202 196 5 1 397(98.27) 7(1.73)
冠心病组286 262 12 12 7.463 。.6^4 536(93.71) 36(6.29) 11.695 ft
CC vs TT+TC:0R=8. 476(1. Ill-64. 664) 单支病变131 122 4 5 5.091 ft 7《248 (94.66) 14(5.34) 6.786ft 。09 多支病变146 131 8 7 9.343 ft 270 (92.47) 22(7.53) 14.287 ft
CC vs TT+TC:0R=9. 685(1.205-77.868;) 2)单支病变组和多支病变组IL1R1基因T-1253C多态的基因型分布及其等位基 因频率在多支病变组(CC = 7、 TC = 8、 TT = 131 ;92. 47%、7. 53% )与对照组之间相比有 显著性差异(分别x 2 = 9. 343， P = 0. 009 ; x 2 = 14. 287， P = 0. 000)。经危险度分析提 示，该多态是冠脉发生多支病变的危险因素，CC纯合子多支病变的发病危险性T等位基因 携带者的9. 685倍。 3)冠心病组的血清TG浓度(1. 83±1. 09mmol/L)明显高于对照组(1.39±0. 62mmol/L)，而HDL-C浓度(1. 12±0. 26mmol/L)则明显低于对照组 (1. 24±0. 24,1/L)(表1)。 在冠心病患者中，IL1R1基因T-1253C多态CC纯合子的血清HDL_C浓度 (1. 03±. 020mmol/L)明显低于TC基因型(1. 23±0. 23mmol/L)和TT基因型个体 (1. 12±0. 26mmol/L) (P < 0. 05)。并且，CC纯合子的血清TG浓度(2. 51 ± 1. 97,1/L)明 显高于TC基因型(1. 85±0. 61mmol/L)和TT基因型个体(1. 79±1. 03mmol/L) (P < 0. 01)。
综上所述，IL1R1启动子区域-1253位的T/C多态是冠心病发病的一个危险因素， 尤其是CC纯合子，CC纯合子冠心病的发病风险是T等位基因携带者的8. 476倍；CC纯合子 多支病变的发病风险是T等位基因携带者的9. 685倍；在冠心病患者中，CC纯合子的血清 HDL-C浓度明显低于T等位基因携带者，而血清TG浓度则明显高于T等位基因携带者。
因此，本发明的IL1R1基因T-1253C多态可用于治疗或预防冠心病方面，特别是在 控制冠心病发病、冠状动脉粥样硬化病变程度或脂代谢异常方面能有较好用途。
〈110〉上海交通大学医学院附属瑞金医院
〈120>IL1R1基因启动子区的SNP位点、其确定法及应用
〈130>NP-08-12841
〈160>1 〈170>PatentIn version 3. 3
〈210>1
〈211>300
〈212>DNA 〈213>人属，人禾中(homo sapiens, human)
〈400〉 1 aagggtcaga gttaaaagat attgaaggaa tgcagtttta ctgctctgag gtaggtttca 60
aggcttgagc caggcttaga gatctttgtc ctgatactgg ggataaagtg aagagaatat 120
gaatgggtat gtctcgcatg gttagaaaat cttttttttt (T/C)cctgtatttg tttaaaaagc 180
attttgtaac ttaaaaaaat acctatacac cttttttttt tttgagatgg agtctcactc 240
tgtcactcag gctggagtgc agtggcacca tcttggctca ctgcaacccc cgcctcctgg 300
8
权利要求
一种IL1R1基因启动子区域中的SNP位点，其特征在于是IL1R1基因启动子区域-1253位的T/C多态，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2. 如权利要求1所述的IL1R1基因启动子区域中的SNP位点，其特征在于所述IL1R1 基因启动子区域-1253位的T/C多态，是IL1R1基因T/C多态中的CC基因型多态。
3. —种IL1R1基因启动子区域中的SNP位点的确定方法，包括步骤1) 提取宿主细胞的基因组DNA ;2) 将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物纯化；3) 纯化后的PCR产物进行DNA测序，从而确定SNP位点。
4. 如权利要求3所述的IL1R1基因启动子区域中的SNP位点的确定方法， 其特征在于所述步骤2)中的PCR扩增引物和步骤3)中的测序引物都为上游 3， _gcctggaactggtgattgg_5，，下游3， _cagcctgagtgacagagtgaga_5，。
5. —种IL1R1基因启动子区域中的SNP位点的基因型确定方法，包括步骤1) 提取宿主细胞的基因组DNA ;2) 将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物纯化；3) 纯化后的PCR产物进行PCR延伸反应，树脂纯化；4) 芯片点样后，质谱检测，进行数据分析，从而确定SNP位点的基因型。
6. 如权利要求5所述的IL1R1基因启动子区域中的SNP位点的基因型确定方法，其特 征在于所述步骤2)中的PCR扩增的引物是上游3'-acgttggatggtctcgcatggttagaaaat c-5，，下游3， -acgttggatgccatctcaaaaaaaaaaaagg-5，；步骤3)中的延伸反应的弓l物是下 游3' ltgctttttaaacaaatacagg-5'o
7. —种IL1R1基因启动子区域中的SNP位点在冠心病方面的应用。
8. 如权利要求7所述的IL1R1基因启动子区域中的SNP位点在冠心病方面的应用，其 特征在于所述冠心病方面是控制冠心病发病、冠状动脉粥样硬化病变程度或脂代谢异常 方面。
全文摘要
本发明公开了一种IL1R1基因启动子区域中的SNP位点、其确定方法及应用，该SNP位点是首次发现的新位点，为IL1R1基因T/C多态，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，位于IL1R1基因启动子区域-1253位；其确定方法提取宿主细胞的基因组DNA；将模板DNA进行PCR扩增，产物纯化；纯化后的PCR产物进行DNA测序，从而确定SNP位点；其基因型确定法提取宿主细胞的基因组DNA；将模板DNA进行PCR扩增，产物纯化；纯化后的PCR产物进行PCR延伸反应，树脂纯化；芯片点样后，质谱检测，进行数据分析，从而确定SNP位点的基因型。本发明的SNP位点可应用于冠心病方面。
文档编号C12Q1/68GK101768631SQ20081020825
公开日2010年7月7日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者刘艳, 金玮 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院