专利名称：一种检测核酸点突变的方法
技术领域：
本发明涉及核酸诊断技术领域，具体地涉及一种检测核酸点突变的方法。更具体地，涉及一种利用寡核苷酸探针对PCR产物进行反向杂交以检测核酸点突变的方法，采用本发明方法可以有效提高检测信噪比从而提高检测灵敏度。
背景技术：
反向杂交是进行核酸检测的重要技术方法，广泛用于可进行高通量检测的芯片类技术。
反向杂交的基本原理是首先将寡核苷酸探针共价交链在一定的固相载体表面，如膜条、微球(如不同荧光微球)等；然后将PCR扩增产物和寡核苷酸混和，在一定的杂交体系中，寡核苷酸探针和目标序列按照碱基互补的原则发生特异性的识别和结合；最后经过一定的酶促或荧光等信号放大过程，最终获得检测信号并依次判定被检测的目标产物是否存在及浓度高低。
反向杂交技术应用于点突变检测时遇到的一个最大的难题就是寡核苷酸探针针对突变型和野生型目标序列检测的信号比较接近，因此无法明确或有效地判定检测结果。
因此，本领域迫切需要开发能够更明确地判定核酸点突变的检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种更明确地判定核酸点突变的检测方法。
具体地，本发明提供了一种新的寡核苷酸探针的序列设计方法，使得在反向杂交检测核酸点突变时，探针针对野生型和突变型得检测信号产生明显得区别，从而可以明确判定检测结果。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测核酸点突变的探针，所述探针的结构如式I所示 Z-L-B(式I) 式中， B表示探针与靶核酸结合的核酸结合区； Z表示可有可无的固相载体； L是连接臂；当Z不存在时，L是用于将B连接于Z的连接臂；当Z存在时，L是已经将B与Z相连的连接臂； 并且，所述的探针与靶核酸结合的结合区B具有式II所示的5’-3’结构 S1-P1-S2-P2-S3(式II) 式中， P1和P2分别是一个碱基，其中的一个是针对突变位点的碱基，该碱基与野生型序列互补但与突变型序列不互补，或者该碱基与野生型序列不互补但与突变型序列互补；而另一个是辅助性的不匹配碱基，该碱基既与野生型序列不互补，也与突变型序列不互补； S1是与野生型序列和突变型序列互补的结合区5’端核苷酸序列，其长度为X1个碱基； S2是与野生型序列和突变型序列互补的结合区中部核苷酸序列，其长度为X2个碱基； S3是与野生型序列和突变型序列互补的结合区3’端核苷酸序列，其长度为X3个碱基； 其中，X1、X2和X3的长度差的绝对值同时满足以下条件 |X1-X2|≤4； |X3-X2|≤4； |X1-X3|≤4； 并且|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤8。
在另一优选例中，|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤6，更佳地|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤4，最佳地|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|＝0。
在另一优选例中，X1、X2和X3的长度差的绝对值同时满足以下条件 |X1-X2|≤3； |X3-X2|≤3； |X1-X3|≤3。
在另一优选例中，X1、X2和X3的长度差的绝对值同时满足以下条件 |X1-X2|≤2； |X3-X2|≤2； |X1-X3|≤2。
在另一优选例中，所述的探针与靶核酸结合的结合区B的长度为15-25个碱基，更佳地为16-22个碱基。
在另一优选例中，所述的连接臂的长度为8-30个碱基。
在另一优选例中，连接臂为10～20聚体的polyT。
在另一优选例中，所述的固相载体是荧光编码微球、膜条或玻片。
在另一优选例中，所述的探针的结合区序列如SEQ ID NO7-13所示。
在本发明的第二方面，提供了一种检测核酸样品是否存在点突变的检测方法，包括步骤 将本发明第一方面中所述的探针与待检测核酸样品进行杂交，并检测是否形成“待检测核酸-探针”杂交复合物，其中未形成所述的杂交复合物就表示样品存在所述的点突变，而形成所述的杂交复合物就表示样品存在所述的点突变。
在另一优选例中，该方法还包括将检测结果与阳性对照和阴性对照进行比较。
在另一优选例中，将检测信号值与阴性对照(野生型)的信号值进行比较，并在检测信号值与阴性对照信号值的比值大于1.5(较佳地≥2.0，更佳地≥2.5，最佳地≥3.0)时，判定样品存在所述的点突变。
在本发明的第三方面，提供了一种用于核酸点突变的试剂盒，包括容器以及位于容器中的本发明第一方面中所述的探针。
应理解，在本发明范围内，本申请上述以及下述的各技术特征可以各种方式进行组合，以构成各种优选例。例如，探针与靶核酸结合的结合区B的长度为15-25个碱基，更佳地为16-22个碱基，其中一般范围的下限15个碱基可以与优选范围的上限22个碱基进行组合，从而构成范围15-22个碱基；反之亦然。
图1A和1B显示了现有技术中探针与突变型模板以及与野生型模板的结合示意图。
图2A显示了本发明一个实例中探针的结构示意图。
图2B显示了本发明一个实例中，探针共价交联于固相载体上的示意图。
图3A和3B显示了本发明一个实例中探针与突变型模板以及与野生型模板的结合示意图。
具体实施例方式 本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，通过在探针序列中额外引入一个人工的不匹配位点，在探针结合区与待检测的含点突变的序列之间就可出现了两个不匹配位点(原点突变位点+人工引入的不匹配位点)，从而可以使得在反向杂交检测核酸点突变时，探针针对野生型和突变型得检测信号产生明显的区别，从而可以更明确地判定检测结果。在此基础上完成了本发明。
简而言之，本发明是利用额外引入一个人工的不匹配位点，从而使得探针针对野生型和突变型得检测信号产生明显的区别，进而更明确地判定点突变。
为了便于理解本发明，本发明人提供了以下基本原理。然而，应理解，本发明的保护范围并不受限于本发明的基本原理。
参见图1-3。
传统的方法是将突变位点设计在探针结合区的中间位置，如图1所示。图1A显示的是探针结合区同突变型杂交，探针结合区和模板之间碱基序列完全匹配形成杂交体；图1B显示探针结合区和野生型模板的杂交情况，探针结合区和野生型模板之间有一个碱基不匹配，虽然存在一个碱基的不匹配情况，但探针和野生型模板之间仍然可以形成较稳定的双链杂交体，这是造成探针无法区分突变型和野生型的主要原因之一。
在本发明中，针对核酸点突变的寡核苷酸探针的设计如下寡核苷酸探针包括两个部分如图2A所示探针右边部分(直线所示)为结合区，长度宜为16～22个碱基长度，结合区同检测位点的模板序列互补，用于检测突变序列是否存在。左边部分(波浪线所示)为可有可无的连接臂。当寡核苷酸探针需要与固相载体相连时，通常需要连接臂。
连接臂的长度通常为8-30个碱基(较佳地10～20个碱基)，一般为同聚寡核苷酸(如T)，如连续的10～20个T碱基。连接臂的左端有用于和固相载体共价交链的活性基团，通常是氨基，连接臂的作用是将探针结合区同固相载体间隔开以利于探针和检测模板的充分结合。
在本发明中，可适用的固相载体没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)荧光编码微球、膜条或玻片等。
在本发明中，在探针结合区引入一个人工设计的不匹配碱基序列，这样探针结合区同野生型模板序列之间就出现了两个不匹配位点，一个是人工设计的位点，另一个是突变位点，人工设计的位点可以在突变位点的左侧或右侧。
这样设计的探针同野生型及突变型模板杂交的情况如图3所示，图3A显示探针结合区和突变型模板的杂交情况，探针和模板之间通过人工设计出现了一个碱基不匹配的情况，但两者之间仍可以形成较为稳定的双链杂交体结构；图3B显示的是探针结合区和野生型模板的杂交情况，探针和模板之间出现了两个碱基不匹配的位点，一个是人工设计的位点，另一个是点突变发生的位点，两个不匹配碱基位点将探针结合区间间隔成3段小区间(长度最好大致相等)，从而不能形成较为稳定的双链杂交体结构。
试验结果证明，采用本发明的探针设计，可以使得探针很好的区分突变型模板和野生型模板，两者之间产生的信号有明显的差异，可以明确判定实验结果。
探针设计 在本发明中，人工设计的突变位点可以在检测位点的左侧，也可以在检测位点的右侧，两者产生的效应相同。
在本发明中，人工引入的不匹配位点和检测位点在探针结合区的位置是一个关键因素，实验发现，被间隔的三段碱基数目越接近，效果越好，任何两段的碱基数目相差3及以上时，探针的检测效果就稍差，并随着相差数目的增大而逐渐失去检测功能。
在本发明中，两个不匹配位点将探针结合区间隔为三段序列，三段序列碱基数目自左至右依次为为X1、X2及X3，其中两个不匹配位点不计算在长度范围内。在优选例中，X1、X2和X3的长度差的绝对值宜同时满足以下条件 |X1-X2|≤4； |X3-X2|≤4； |X1-X3|≤4； 并且|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤8。
较佳地，|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤6；更佳地|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤4；最佳地，|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|＝0。
在另一优选例中，X1、X2和X3宜同时满足以下条件 |X1-X2|≤3； |X3-X2|≤3； |X1-X3|≤3。
较佳地，X1、X2和X3宜同时满足以下条件 |X1-X2|≤2； |X3-X2|≤2； |X1-X3|≤2。
在本发明中，探针结合区序列的设计可以针对检测模板两条互补链中的任意一条。
杂交反应和检测 在本发明中，在本发明中，探针与核酸样品的杂交反应以及检测没有特别限制，可按本领域常规的杂交反应方法进行，然后用常规的检测的手段进行检测。换言之，在本发明方法中，杂交反应和检测与常规的一样，无需作特别调整。
本发明的主要优点在于 (a)本发明方法不改变原有的反向杂交进行核酸点突变检测的过程。
(b)本发明方法可以有效提高检测信噪比从而提高检测灵敏度，因而可以广泛应用于点突变(如SNP)的检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 人凝血因子V的Leiden突变体(单突变)的检测 1.探针设计 针对人凝血因子V的Leiden突变设计该突变位点的扩增引物和探针 正向引物5’TCCCAGTGCTTAACAAGACCA3’(SEQ ID NO5) 反向引物5’TGTTATCACACTGGTGCTAA3’(SEQ ID NO6) 该引物对的扩增产物为266bp。
野生型序列AGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGAGGGCAGCAGA(SEQ ID NO3) 突变型序列AGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAGGAATACAGAGGGCAGCAGA(SEQ ID NO4) 按照传统探针设计方法设计的探针 P15’CTGGACAGGCAAGGAATACA(SEQ ID NO14) 按照本发明设计的探针结合区序列 2.引物、探针合成 正向引物序列5’biotin-TCCCAGTGCTTAACAAGACCA 3’(SEQ ID NO5) 反向引物序列5’biotin-TGTTATCACACTGGTGCTAA 3’(SEQ ID NO6) 将探针结合区序列一端加上连接被序列和连接基团 注探针P1-P8的序列为在SEQ ID NO14和SEQ ID NO7-13所示的结合区的5’端添加作为连接臂的10聚体polyT。
3.参考序列的合成 按照以下的序列进行参考序列的全化学合成，并克隆到市售的质粒载体pGEMT中，配制成4×106拷贝/ml作为参考序列模板 野生型序列 ATTCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACAGTAATTGTCAAGTAGTCCTTTTTAGCACCAGTGTGATAACATTTA(SEQ ID NO1，下划线为突变位置) 突变型(Leiden)序列 ATTCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCCAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACAGTAATTGTCAAGTAGTCCTTTTTAGCACCAGTGTGATAACATTTA(SEQ ID NO2，下划线为突变位置) 4.探针与微球的共价交链及微球杂交液的配制 探针与微球的价交链将6.5×105个微球(购置Luminex公司)悬浮于100ul的100mM MES pH＝4.5缓冲溶液中，加入步骤2中合成的探针4ul(浓度为20uM)。
微球种类和加入探针的对应关系如下表 振荡均匀后加入4ul 10mg/ml新鲜配制的EDC(现用现配制)，室温避光反应30分钟；用1ml的TE进行洗涤2次，重新悬浮于100ul的TE溶液中，充分振荡后计数，避光保存于4～8℃备用。
TE溶液的配制 称取Tris碱 1.21g 称取EDTA0.372g 先用800ml纯℃化水充分溶解，并以1M的盐酸将pH值调节至8.0，定容后即可。
微球杂交液的配制 交链有寡核苷酸探针的微球19号微球2000个 22号微球2000个 25号微球2000个 31号微球2000个 32号微球2000个 35号微球2000个 37号微球2000个38号微球2000个 1.5×TMAC溶液17ul TE 补足25ul体积 1.5×TMAC溶液配制 取一定体积TMAC溶液用纯化水稀释至1.5mol/L，即可，保存于4～8℃。
5.PCR对参考序列模板的扩增 采用市售的DNA聚合酶，用步骤2中合成的引物进行PCR 反应体系 PCR反应条件 95℃--2分钟 [95℃--30秒，52℃--30秒，72℃--20秒]30个循环 72℃--1分钟 扩增的模板种类分为3组 a组反应扩增野生型模板 b组反应扩增突变型模板 c组反应扩增是野生型及突变型模板的等比例混和模板。
6.杂交检测 取20ul的微球杂交液置于容量为200ul的薄壁管中并加入3ul的PCR产物；将薄壁管放入PCR仪中，先进行95℃孵育5分钟，接着进行48℃孵育30分钟；加入75ul的荧光素(荧光素为SA-PE，采用TE进行配制，浓度为5.1ug/ml)继续进行48℃孵育15分钟；反应结束后于市售的Luminex200仪上进行读数分析。
7.实验结果 8.结果判定和分析 以突变探针对突变型模板的检测信号值(y)与突变探针对野生型模板的检测信号值(x)的比值y/x作为判定结果的参数，则以上的检测结果如下 采用现有技术的P1探针，其检测信号值(y)与突变探针对野生型模板的检测信号值(即阴性对照信号值)(x)的比值y/x仅为1.1，因此难以明确判定是否存在点突变。
与之相反，本发明的各种探针都可明显提升该比值y/x，该比值分别为1.7-4.1，极其有效地提高检测信噪比从而提高检测灵敏度。即使是最低的P8探针，其比值也高达1.7，足以满足判断是否点突变的要求。当然，通常情况下，在本发明中，如果某探针的检测信号与正常对照信号比值≥2.0(较佳地≥2.5，更佳地≥3.0)，那么这样的探针是优选的，以便更明确地判定检测结果。
综合以上的检测结果，可以得出如下结论 1.以传统方法设计的探针P1不能很好的检测到突变基因； 2.依据本发明设计有两个不匹配位点，且间隔碱基数目符和条件的探针都可极其有效地提高检测信噪比从而提高检测灵敏度。其中，较好的是P2、P3、P4和P6为，而且P2和P3的检测效果优于P4和P6的检测效果； 3.虽然有两个不匹配位点，但间隔碱基数目与优选范围符和度稍差的探针P5、P7和P8虽然能够检测，但检测结果稍为逊色(例如探针P8)。
以上设计中两个不匹配位点间隔探针结合区的情况见下表 实施例2 连接臂对点突变结果的影响 选用探针P3的结合区(SEQ ID NO8)，重复实施例1，不同点在于(a)用12聚体、14聚体、16聚体的polyT连接臂替换10聚体polyT的连接臂。
结果表明，与实施例1中结果类似，对单突变样品的检测信号与对正常对照信号比值为4.0(远大于2.5)，因此可以明确判定检测结果。这提示，连接臂的长度并不会干扰点突变的检测。
实施例3 检测测试 选用探针P3(结合区为SEQ ID NO8；连接臂为10聚体polyT)，对10个核酸样品检测。这些核酸样品是人工制备的，其中包括以下四类样品 1.含有SEQ ID NO3野生型的序列的样品； 2.含有SEQ ID NO4突变型的序列的样品； 3.同时含有SEQ ID NO3野生型的序列和SEQ ID NO4突变型的序列的样品； 4.既不含有SEQ ID NO3野生型的序列也不含SEQ ID NO4突变型的序列的样品。
在未告知样品类型的情况下进行测试(方法同实施例1)，并将测试结果与各样品的类型进行比较。
结果表明，检测结果与各样品的类型完全相符。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海透景生命科技有限公司
<120>一种检测核酸点突变的新方法
<130>088399
<160>14
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>272
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
attcccagtg cttaacaaga ccatactaca gtgacgtgga catcatgaga gacatcgcct 60
ctgggctaat aggactactt ctaatctgta agagcagatc cctggacagg cgaggaatac120
aggtattttg tccttgaagt aacctttcag aaattctgag aatttcttct ggctagaaca180
tgttaggtct cctggctaaa taatggggca tttccttcaa gagaacagta attgtcaagt240
agtccttttt agcaccagtg tgataacatt ta 272
<210>2
<211>272
<212>DNA
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<400>2
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ctgggctaat aggactactt ctaatctgta agagcagatc cctggacagg ccaggaatac120
aggtattttg tccttgaagt aacctttcag aaattctgag aatttcttct ggctagaaca180
tgttaggtct cctggctaaa taatggggca tttccttcaa gagaacagta attgtcaagt240
agtccttttt agcaccagtg tgataacatt ta 272
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<220>
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<223>引物
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<400>14
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权利要求
1.一种用于检测核酸点突变的探针，其特征在于，所述探针的结构如式I所示
Z-L-B(式I)
式中，
B表示探针与靶核酸结合的核酸结合区；
Z表示可有可无的固相载体；
L是连接臂；当Z不存在时，L是用于将B连接于Z的连接臂；当Z存在时，L是已经将B与Z相连的连接臂；
并且，所述的探针与靶核酸结合的结合区B具有式II所示的5’-3’结构
S1-P1-S2-P2-S3(式II)
式中，
P1和P2分别是一个碱基，其中的一个是针对突变位点的碱基，该碱基与野生型序列互补但与突变型序列不互补，或者该碱基与野生型序列不互补但与突变型序列互补；而另一个是辅助性的不匹配碱基，该碱基既与野生型序列不互补，也与突变型序列不互补；
S1是与野生型序列和突变型序列互补的结合区5’端核苷酸序列，其长度为X1个碱基；
S2是与野生型序列和突变型序列互补的结合区中部核苷酸序列，其长度为X2个碱基；
S3是与野生型序列和突变型序列互补的结合区3’端核苷酸序列，其长度为X3个碱基；
其中，X1、X2和X3的长度差的绝对值同时满足以下条件
|X1-X2|≤4；
|X3-X2|≤4；
|X1-X3|≤4；
并且|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤8。
2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤6，更佳地|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤4，最佳地|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|＝0。
3.如权利要求1所述的探针，其特征在于，X1、X2和X3的长度差的绝对值同时满足以下条件
|X1-X2|≤3；
|X3-X2|≤3；
|X1-X3|≤3。
4.如权利要求1所述的探针，其特征在于，X1、X2和X3的长度差的绝对值同时满足以下条件
|X1-X2|≤2；
|X3-X2|≤2；
|X1-X3|≤2。
5.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的探针与靶核酸结合的结合区B的长度为15-25个碱基，更佳地为16-22个碱基。
6.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的连接臂的长度为8-30个碱基。
7.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的固相载体是荧光编码微球、膜条或玻片。
8.一种检测核酸样品是否存在点突变的检测方法，其特征在于，包括步骤
将权利要求1所述的探针与待检测核酸样品进行杂交，并检测是否形成“待检测核酸-探针”杂交复合物，其中未形成所述的杂交复合物就表示样品存在所述的点突变，而形成所述的杂交复合物就表示样品存在所述的点突变。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，该方法还包括将检测结果与阳性对照和阴性对照进行比较。
10.一种用于核酸点突变的试剂盒，其特征在于，包括容器以及位于容器中的权利要求1所述的探针。
全文摘要
本发明提供了一种检测核酸点突变的方法。具体地，本发明方法包括与待检测核酸样品与本发明的探针进行杂交，并检测是否形成“待检测核酸-探针”杂交复合物，其中在本发明的探针序列中额外引入一个人工的不匹配位点，从而在探针结合区与待检测的含点突变的序列之间可出现了两个不匹配位点。使用本发明的探针时，可以在反向杂交检测核酸点突变中，使得探针针对野生型和突变型得检测信号产生明显的区别，从而可以更明确地判定检测结果。试验表明，本发明可有效提高检测信噪比从而提高检测灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK101768628SQ20081020811
公开日2010年7月7日 申请日期2008年12月29日 优先权日2008年12月29日
发明者姚见儿, 白艳军, 谈畅, 李久彤 申请人:上海透景生命科技有限公司