目标核酸的检测方法

目标核酸的检测方法
【专利摘要】本发明公开了即使减少检测探针的使用量，也不降低检测灵敏度(S/N比)，能够高灵敏度地检测目标核酸的目标核酸的检测方法。通过使用与目标核酸杂交的检测探针以及固定于支持体的捕捉探针的夹心杂交法来进行的目标核酸的检测方法中，检测探针和/或捕捉探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团，具有对目标核酸与检测探针和/或捕捉探针杂交而形成的复合体进行光照射，从而在光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键的工序。
【专利说明】目标核酸的检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用夹心杂交法的目标核酸的检测方法。

【背景技术】
[0002] 各种生物的遗传信息分析的研究已经开始，关于以人类基因为首的大量基因及其 碱基序列、还有由基因序列所编码的蛋白质和由这些蛋白质二次加工成的糖链的信息正在 迅速被阐明。对于序列被阐明的基因、蛋白质、糖链等高分子体的功能，可以通过各种方法 来调查。作为主要的方法，对于核酸，可以利用RNA印迹（northernbloting)、或者DNA印 迹（southernbloting)这样的各种核酸/核酸间的互补性来调查各种基因与其生物体功 能表达的关系。对于蛋白质，可以利用以蛋白质印迹（westernbloting)为代表的蛋白质 /蛋白质间的反应来调查蛋白质的功能和表达。
[0003] 作为核酸检测方法之一，已知夹心杂交法。夹心杂交法使用被固定于过滤器上的 捕捉探针。捕捉探针与目标核酸的第1部分互补。在一个阶段中，使结合于过滤器的捕捉 探针暴露于应对于目标核酸序列进行调查的样品，进一步暴露于与目标核酸的第2部分互 补的带有标记的检测探针，但前述的第2部分与第1探针所互补的目标部分不同（S卩，与它 们不重复）（专利文献1、2、非专利文献1)。该方法消除了在过滤器上固定化样品所需的工 夫，另外可以选择第1探针使其适合支持体。
[0004] 现有技术文献
[0005] 专利文献
[0006] 专利文献1 :美国专利第4, 486, 539号
[0007] 专利文献2 :日本特开平7-75600号公报
[0008] 非专利文献
[0009] 非专利文献I:Sinikka Parkkinen et al.，Journal of Medical Virology20:279-288 (1986)


【发明内容】

[0010] 发明要解决的课题
[0011]目前，在捕捉探针固定化支持体上使用夹心杂交法来检测目标核酸时，为了提高 检测灵敏度，必须使用相对于目标核酸量为过量的检测探针。例如，根据文献（日本特开 2001-69997号公报），相对于目标核酸量，需要25万倍当量的检测探针。但是，如果使用过 量的检测探针，则剩余的检测探针与用于捕捉其他目标核酸的捕捉探针交叉杂交（非特异 性吸附），其结果存在检测灵敏度（S/N比）降低这样的课题。
[0012] 本发明的目的是提供即使减小检测探针的使用量，也不降低检测灵敏度（S/N 比），能够高灵敏度地检测目标核酸的目标核酸的检测方法。
[0013] 用于解决课题的方法
[0014] 本申请
【发明者】们进行深入研究的结果发现，在夹心杂交法中，通过在目标核酸与 检测探针和/或捕捉探针杂交而形成的复合体中，在检测探针和/或捕捉探针中替换了核 酸碱基的光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间通过光照射而形成共价键，从而不使 用过量的检测探针也能够高灵敏度地检测目标核酸，于是完成了本发明。
[0015] 即，本发明提供以下（1)?（4)。
[0016] (1)目标核酸的检测方法，是通过夹心杂交法来检测目标核酸的方法，所述夹心杂 交法使用与目标核酸杂交的检测探针以及固定于支持体的捕捉探针，
[0017] 检测探针和/或捕捉探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性 基团，
[0018] 该检测方法具有对目标核酸与检测探针和/或捕捉探针杂交而形成的复合体进 行光照射，从而在光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键的工序。
[0019] (2)根据（1)所述的检测方法，检测探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替 换为光反应性基团。
[0020] (3)根据（2)所述的检测方法，捕捉探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替 换为光反应性基团。
[0021] (4)根据（1)?（3)的任一项所述的检测方法，光反应性基团是选自3-氰基乙烯 基咔唑基、对氨基甲酰基乙烯基苯酚基、4, 5'，8-三甲基补骨脂素基以及N3-甲基-5-氰基 乙烯基尿嘧啶基中的至少1种。
[0022] 发明的效果
[0023] 根据本发明，能够降低使用的检测探针的量，因而能够抑制与捕捉探针的交叉杂 交（非特异性吸附）。其结果能够提高检测灵敏度（S/N比），所以能够高灵敏度地检测微 量的目标核酸。

【具体实施方式】
[0024] 作为供于本发明的检测方法的目标核酸，可列举例如，病原菌和/或病毒等的基 因、遗传病的病原基因等及其一部分等，但不限于这些。另外，作为包含这些目标核酸的样 本，可列举血液、血清、血浆、尿、粪便、脑脊液、唾液、粘液、各种组织液等体液、和/或各种 组织、石蜡包埋样本（FFPE)及其切片、各种饮食物以及它们的稀释物等，但不限于这些。另 夕卜，成为被检物质的目标核酸可以是从血液和/或细胞通过常规方法提取的样本核酸，也 可以使用从样本提取的DNA和/或RNA等。作为DNA，可以使用染色体DNA、病毒DNA、细菌、 霉等的DNA、将RNA进行逆转录而得的cDNA、作为它们的一部分的片段等，但不限于这些。作 为RNA，可以使用信使RNA、核糖体RNA、小RNA(smallRNA)和/或作为它们的一部分的片段 等，但不限于这些。另外，化学合成的DNA或者RNA等也可以作为目标核酸使用。
[0025] 所述样本核酸有时还包含除了作为测定对象的目标核酸以外的核酸成分（非目 标核酸）。这些非目标核酸既可以考虑与目标核酸的性状的差而除去，也可以不除去地作为 被检物质使用。
[0026] 目标核酸也可以是以该目标核酸作为模板通过PCR等核酸扩增法进行扩增而得 的，这种情况下，可以大幅提高测定灵敏度。在以核酸扩增产物作为目标核酸的情况下， 通过在用荧光物质等进行了标记的核苷三磷酸的存在下进行扩增，可以将扩增核酸进行标 记。
[0027] 本发明的方法可以在区别目标核酸的有无、病毒的基因型、细菌的种和株、霉的种 和株等的检测、SNP(单碱基多态性）的检测、信使RNA的检测、miRNA的检测、CGH、拷贝数 变化、基因组DNA序列的缺失?重复?融合、或者转录产物的缺失?重复?融合的检测中使 用。另外，通过测定来自检测探针的信号强度，还可以应用于目标核酸的定量。此外，如果 进行目标核酸的定量，则必然要进行目标核酸的检测，因此本发明的"检测方法"也包含伴 随定量的情况。
[0028] 本发明的方法中可以直接应用目标核酸，也可以应用目标核酸的片段化处理物。 对于目标核酸的长度，只要捕捉探针、检测探针能杂交就不特别限制，在目标核酸较长的情 况（1500个碱基以上、特别是4000个碱基以上的情况）下，优选应用通过片段化处理而片 段化成如后述那样适当的长度而得的片段化处理物。片段化处理物不需要从产生的核酸片 段中选择特定的核酸片段，可以将片段化处理物直接供于本发明的方法，从而可以提高检 测灵敏度。
[0029] 作为为了片段化而将目标核酸切断的方法，可以使用照射超声波而切断的方法、 用酶切断的方法、用限制性酶切断的方法、使用雾化器的方法、用酸和/或碱切断的方法 等。在用超声波切断的方法的情况下，可以通过控制照射于目标核酸的超声波的输出强度 和照射时间来切断成所期望的长度。
[0030] 支持体可以使用载玻片、膜、珠等。对支持体的材质不特别限定，可列举玻璃、陶 瓷、硅等无机材料、聚对苯二甲酸乙二醇酯、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯 酸甲酯、硅胶等聚合物等。通过使用将多种捕捉探针固定于支持体上而成的微阵列，能够同 时检测多种目标核酸。
[0031] 本发明的目标核酸的检测方法优选应用夹心杂交法。在夹心杂交法中，使用固定 于支持体的捕捉探针、以及检测探针。捕捉探针、检测探针是通常分别具有与目标核酸的不 同部分互补的碱基序列，能与目标核酸杂交而选择性地结合的物质。目标核酸与检测探针 和/或捕捉探针杂交，形成复合体。通过检测（测定）与该复合体中的检测探针结合的标 记体，能够检测目标核酸。
[0032] 在本发明中，作为捕捉探针，具体可以使用DNA、RNA、PNA(肽核酸）、LNA(锁核酸， LockedNucleicAcid)等的核酸衍生物。这里衍生物在核酸的情况下，是指利用突光基团 等形成的标识化衍生物、包含修饰核苷酸（例如受到了包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷 氧基、硫代、竣甲基等基团的核昔酸和喊基的再构成、双键的饱和、脱氣基化、氧分子向硫分 子的替换等的核苷酸等）的衍生物等化学修饰衍生物。
[0033] 具有特定碱基序列的单链核酸，与具有与该碱基序列或其一部分互补的碱基序列 的单链核酸选择性地杂交而结合，因此相当于本发明中所说的捕捉探针。本发明中使用捕 捉探针可以是市售的，另外，也可以是从活细胞等得到的。作为捕捉探针，特别优选的是核 酸。该核酸中，被称为寡核酸的长度为200个碱基以下的核酸可以用合成仪容易地人工合 成。
[0034]捕捉探针可以含有与目标核酸序列互补的序列，也可以选择任何区域。优选与以 下所述的检测探针的序列不重复。另外，还可以使用与目标核酸的不同区域杂交的多种捕 捉探针。
[0035]在目标核酸是双链DNA或双链RNA的情况下，可以选择与正义链、反义链的任一链 互补的序列作为捕捉探针。这种情况下，以下所述的检测探针与捕捉探针优选选择同一链 的序列。
[0036] 在将样本核酸所含的不同目标核酸进行区别检测的情况下，例如，将感染患者的 病毒的型进行区别检测等，优选从样本核酸所能包含的核酸序列中选择特异性高的序列区 域。即，是指，选作捕捉探针的序列，在样本核酸所含的全部序列中，在除了该区域以外不存 在同源性高的序列。
[0037] 本发明中使用的检测探针、捕捉探针中的任一核酸分子中的至少一个核酸碱基被 替换为光反应性基团，或者检测探针、捕捉探针两者的核酸分子中的各有至少一个核酸碱 基被替换为光反应性基团。
[0038] 这里，光反应性基团是通过特定波长的光照射而有机合成反应中的反应性被激活 的有机基团（光反应性部位）。探针中的核酸碱基被替换为光反应性基团后的探针，能够与 替换前的核酸碱基同样地与目标核酸杂交而形成复合体。对核酸碱基被替换为光反应性基 团后的捕捉探针和/或检测探针与目标核酸杂交而形成的复合体照射能激活该光反应性 基团的光反应性部位的波长的光，则该光反应性部位被激活，在该光反应性基团与目标核 酸中的核酸碱基之间形成共价键。
[0039] 作为这样的光反应性基团，可列举3_氰基乙烯基咔唑基及其衍生物 (W02009/066447(EP2216338,US2010-274000A),YoshinagaYoshimuraetal. ,Organic Letters10:3227-3230(2008))、对氨基甲酰基乙烯基苯酚基（TakehiroAmiet al. ,Organic&BiomolecularChemistry5:2583-2586 (2007))、4, 5'，8-三甲基补骨脂素基 (AkioKoborietal·,ChemistryLetters38:272-273(2009))以及N3-甲基 _5_ 氰基 乙烯基尿啼陡基（KenzoFujimotoetal·,ChemicalCommunications:3177_3179(2005) 等。这些文献通过参照而被引入本说明书中。其中，优选3-氰基乙烯基咔唑基及其衍生物 (W02009/066447)，特别优选3-氰基乙烯基咔唑基。
[0040] 这里，3-氰基乙烯基咔唑基及其衍生物如W02009/066447所记载的那样，是下述 式⑴所示的基团。
[0041]

【权利要求】
1. 目标核酸的检测方法，是通过夹心杂交法来检测目标核酸的方法，所述夹心杂交法 使用与目标核酸杂交的检测探针以及固定于支持体的捕捉探针， 检测探针和/或捕捉探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替换为光反应性基团， 该检测方法具有对目标核酸与检测探针和/或捕捉探针杂交而形成的复合体进行光 照射，从而在光反应性基团与目标核酸中的核酸碱基之间形成共价键的工序。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，检测探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替 换为光反应性基团。
3. 根据权利要求2所述的检测方法，捕捉探针的核酸分子中的至少一个核酸碱基被替 换为光反应性基团。
4. 根据权利要求1?3的任一项所述的检测方法，光反应性基团是选自3-氰基乙烯基 咔唑基、对氨基甲酰基乙烯基苯酚基、4, 5'，8-三甲基补骨脂素基以及N3-甲基-5-氰基乙 烯基尿嘧啶基中的至少1种。
【文档编号】C12N15/09GK104428424SQ201380034120
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2012年8月31日
【发明者】平野泰亮, 中村史夫, 上田洋二, 藤本健造 申请人:东丽株式会社