玉米事件mon 87411的制作方法
【专利摘要】本发明提供了玉米事件MON 87411，和包含事件MON 87411的植物、植物细胞、种子、植物部分和商品。本发明还提供了对于事件MON 87411特异性的多核苷酸，和包含对于事件MON 87411特异性的多核苷酸的植物、植物细胞、种子、植物部分和商品。本发明还提供与事件MON 87411相关的方法。PTA-1266920120314
【专利说明】玉米事件MON 87411
[0001] 参考相关申请
[0002] 本申请要求保护2012年5月8日提交的美国临时申请No. 61/644,368的权益，其 通过引用整体并入本文。
[0003] 序列表的并入
[0004] 文件中包含的命名为"MON S308W0_ST25. txt"的序列表（其具有230千字节 (Microsoft Windows?中测量的大小）并且创建于2013年5月6日）随同电子投稿一 起提交并且通过引用并入本文。 发明领域
[0005] 本发明涉及转基因玉米事件MON 87411。所述事件提供了对玉米根虫侵染的抗性 和对除草剂草甘膦耐受性的双重作用模式。本发明还涉及与事件MON 87411相关的植物、 植物部分、植物种子、植物细胞、农产品和方法，并提供了所述事件独有的并与转基因DNA 插入玉米植物的基因组中相关联而产生的核苷酸分子。
【背景技术】
[0006] 玉米（Zea mays)在世界上许多地区是重要的作物，并且为了生产具有所需性状 的玉米，已将生物技术方法应用于这种作物。昆虫抗性或除草剂耐受性转基因在植物中的 表达能够赋予植物所需的昆虫抗性和/或除草剂耐受性的性状，但是此类转基因的表达可 能受到许多不同因素的影响，包括驱动转入植物染色体的单个基因的表达的盒的方向和组 成，以及转基因插入的染色体位置和基因组结果的影响。例如，除了在转基因的染色体插入 位点方面不同但在其它方面都相同的单个事件之间，可能存在转基因表达水平和模式的变 异。在一些事件之间还可能存在不想要的表型或农学差异。因此，为了选择相对于所需形 状的优异特性和使其适合于商业目的所需的最佳表型和农业特性的事件，通常必需产生并 分析大量单个植物转化事件。此类选择通常需要经过多年、在多个地点并在多种条件下广 泛的分子表征以及对许多事件进行温室和田间试验，以便可以收集到大量农艺学、表型和 分子数据。然后必须由科学家和农学家对得到的数据和观察进行分析，其目的是选择商业 上适合的事件。一旦被选择，此类事件随后可能用于使用植物育种方法将所需性状渗入到 其它遗传背景中，并由此产生含有所需性状并适当地适应于特定当地生长条件的大量不同 作物品种。
[0007] 为了制备包含单一转化事件的转基因植物，将一部分重组DNA构建体转入玉米细 胞的基因组，且使玉米细胞随后生长成植物。使事件初始转移入其中的玉米细胞再生以产 生R0代。可以测试Rtl植物和来自Rtl植物的后代植物中任何期望的性状，但事件的有效性 可以受相对于转化事件中整合位点的顺式和/或反式因子的影响。事件所赋予的表型也可 以受DNA构建体的尺寸和设计的影响，其可以通过表达盒中的遗传元件、转基因的数量、表 达盒的数量和此类元件和此类盒的配置的组合而变化。鉴定具有所需性状的事件可以通过 因素诸如转基因表达的植物发育、昼夜、时间或空间模式或通过外在因素，例如，环境植物 生长条件、水可得性、氮可得性、热或胁迫而进一步复杂化。因此，获得赋予所需组的表型性 状的事件的能力是不容易预测的。
[0008] 发明简述
[0009] 本发明人已经鉴定了转基因玉米事件MON 87411，其表现出与现有转基因玉米植 物和平行构建的新事件相比优异的特性和表现。玉米事件MON 87411包含三个连锁的表 达盒，其共同为包含转基因事件MON 87411的玉米细胞、玉米组织、玉米种子和玉米植物 赋予玉米根虫抗性和草甘膦除草剂耐受性的性状。玉米事件MON 87411提供了两种针对 玉米根虫害虫物种（包括根萤叶甲属（Diabrotica spp.),特别是当害虫是玉米根萤叶甲 (Diabrotica virgifera virgifera)(西方玉米根虫，WCR)、巴氏根萤叶甲（Diabrotica barberi)(北方玉米根虫，NCR)、玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera zeae)(墨西哥 玉米根虫，MCR)、带斑黄瓜叶甲（Diabrotica balteata)(巴西玉米根虫（BZR)或由叶甲 赌（Diabrotica viridula)和叶甲桐（Diabrotica speciosa)组成的巴西玉米根虫复合 群（BCR))或黄瓜十一星叶甲（Diabrotica undecimpunctata howardii)(南部玉米根虫， SCR))的作用模式。双重作用模式提供了冗余度且显著降低了发展对害虫控制性状的抗性 的可能性。
[0010] 事件MON 87411的特征在于可用于检测样品中该事件的存在的特定独特的DNA片 段。样品意指基本上纯玉米DNA的组合物或包含玉米DNA的组合物。在任一种情况下，样品 是生物样品，即，其包含生物材料，包括但不限于从玉米事件MON 87411的基因组直接或间 接获得或衍生的DNA。"直接"是指技术人员通过粉碎玉米细胞（或通过获得包含破碎玉米 细胞的玉米样品）且为检测目的暴露基因组DNA而从玉米基因组直接获得DNA的能力。"间 接"是指技术人员通过除了通过经由破碎玉米细胞或获得包含破碎玉米细胞的玉米样品以 外的方式而获得目标或特定参考DNA(即本文中描述为诊断特定样品中事件M0N87411的存 在的新型且独特的连接片段）的能力。此类直接方式包括但不限于扩增包含被设计为与目 标序列特异性结合的特定探针靶向的DNA序列的DNA片段，或扩增以下DNA片段，所述DNA 片段可以测量和表征，即通过一些有效基质诸如琼脂糖或丙烯酰胺凝胶等从其它DNA片段 分离来测量，或通过直接序列分析扩增子或将扩增子克隆至载体中或直接测序此类载体内 存在的插入的扩增子来表征。或者，对应于转基因DNA被插入玉米染色体且可以用于定义 事件MON 87411的玉米染色体内的位置的DNA片段可以通过各种方式克隆，然后鉴定和表 征其在特定样品中或特定玉米基因组中的存在。此类DNA片段被称为连接片段或序列，并 且可以是任何长度的插入DNA和相邻（侧接）玉米染色体DNA，只要插入的DNA与玉米基因 组之间的连接点被包括在该片段中。SEQ ID NO :12和SEQ ID NO :21和这些中每个的反向 互补序列代表此类片段。
[0011] 本文鉴定的特异性序列可以独特存在于事件MON 87411或其中包含的构建体中， 并且这些序列的鉴定，无论通过直接序列分析，通过检测结合此类序列的探针，或通过观察 本文描述的特定扩增子的大小和可能组成，当存在于特定玉米种质或基因组中和/或存在 于包含玉米DNA的特定生物样品时，是此类样品中事件MON 87411或其中包含的构建体的 存在的诊断。已知侧翼基因组片段（即，邻近于插入的转基因DNA的DNA序列的玉米基因 组片段）经历轻微变异，因此，关于玉米基因组间此类异常或多态性为至少99%或更大一 致性的限制。相比于本文引用的特定诊断序列在其长度完全互补的核苷酸片段意欲在本发 明的范围之内。
[0012] 本发明的核苷酸片段相对于彼此和玉米基因组内的位置显示在图3中，且每个核 苷酸序列显示在SEQ ID N0:1中。表征事件MON 87411且诊断出样品中事件MON 87411 或其中包含的构建体的存在的核苷酸片段包括SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO : 19、 SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、and SEQ ID NO :25 ;SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、或 SEQ ID NO :52。这些样品中这些核苷酸序列 中的一个、或两个或更多个的存在，当此类样品包含玉米组织和因此玉米DNA时，诊断出事 件MON 87411或其中包含的构建体的存在。
[0013] 使用词语"衍生"意指，即特定DNA分子在玉米植物基因组中，或者能够在玉米植 物DNA中被检测到。"能够被检测到"是指特定DNA片段被扩增和其大小和或序列通过DNA 序列分析表征或阐明的能力，而且还可以指探针特异性结合特定DNA片段（即目标DNA片 段）的能力，和随后检测探针结合目标的能力。本发明的特定DNA片段或目标DNA片段是 存在于包含插入事件MON 87411的玉米之内。
[0014] 提及玉米，意欲指玉米细胞、玉米种子、玉米植物部分和玉米植物均在本发明 的范围之内，只要每个实施方案包含可检测量的对应于本文描述为诊断出玉米事件MON 87411DNA的存在的片段中的任何一个、两个或更多个的DNA。玉米植物部分包括细胞；花 粉；胚珠荚；花和花部分，诸如棒、丝和穗须；根组织；茎组织；和叶组织。从其中可检测量 的本文描述为诊断出事件MON 87411的存在的DNA片段的玉米制成的商品在本发明的范围 之内。此类商品可以包括整个或加工的玉米种子、包含玉米或玉米副产物的动物饲料、玉米 油、玉米餐、玉米粉、玉米淀粉、玉米片、玉米糠、玉米生物量和秸杆，和从玉米或玉米植物和 植物部分制成的燃料产品和燃料副产物。
[0015] 玉米事件MON 87411的DNA通常存在于包含该事件的玉米植物、玉米种子和玉米 组织的每个细胞中和每个染色体中。由于玉米基因组被孟德尔方式传给后代，所以如果玉 米植物是纯合的，则每个后代玉米植物和细胞在从亲本生成后代的每个亲本染色体上将包 含该事件DNA。然而，如果包含事件MON 8741IDNA的玉米基因组是杂合的或杂交亲本，则参 与从杂交亲本交配的只有50%花粉和50%胚珠将包含玉米事件MON 87411DNA，产生混合 群体的包含事件MON 87411DNA的后代，且从此类与杂合体的杂交产生的此类后代的百分 比可以在约50到约75%的具有传给此类后代的事件MON 8741IDNA的任何范围内。
[0016] 本发明的DNA分子对于玉米事件MON 87411插入的DNA或转基因插入的DNA和邻 近于插入的DNA的任一端的玉米基因组DNA之间的两个连接可以是独特的。这些分子，当 存在于通过本文所述的使用探针、引物和在一些情况下使用DNA序列分析的方法分析的特 定样品中时，可用于诊断该样品中一定量事件MON 87411玉米的存在。对于玉米事件MON 87411DNA独特的此类DNA分子可以以多种方法鉴定和表征，包括使用设计为特异性结合独 特DNA分子的探针核酸分子，随后检测此类探针与独特DNA的结合，和通过使用至少两种不 同的充当探针的DNA分子，但此类分子的序列可以比上述探针特异性稍少的热扩增方法。 技术人员理解，在适当杂交条件下使特定目标DNA与探针或引物接触将导致所述探针或 引物与目标DNA片段的结合。
[0017] 作为DNA的目标片段的本发明的DNA分子能够扩增，并且当作为通过特定样品的 扩增方法获得的代表长度的一个或多个扩增子进行检测时，可以诊断此类样品中事件MON 87411或其中包含的构建体的存在。此类DNA分子或多核苷酸片段具有SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、和 SEQ ID NO :52 中每个所示的 核苷酸序列，并且在本文中和下文实施例中进一步定义。引物分子和/或探针可以连同必 需试剂，包括对照以试剂盒形式提供，并且与使用说明书一起包装。
[0018] 当存在于微生物之内或源自微生物时，本发明的重组DNA分子被认为是在本发明 的范围之内。微生物意欲包括任何微小细胞，无论是原核生物或真核生物或以其它方式包 含基因组或染色体内的DNA或更通常被称为质粒或载体的染色体外DNA结构。微小生物体 包括细菌（原核生物）和对应于更高生命形式的细胞（真核生物），其在平均人类视觉范围 以下，通常在50立方微米以下，且更通常在10立方微米以下。细菌是常见的微小微生物，其 较有可能可以包含载体或质粒，所述载体或质粒包含一个或多个或所有本发明新型DNA片 段，包括如SEQ ID NO :1所示存在的每个相应的表达盒。当植物细胞，特别是玉米植物细胞 包含任何一个、两个或更多个或所有本发明的新型DNA片段时，这些在本发明的范围之内。 [0019] 本文中使用的探针被典型表征为在本文定义的严格杂交条件下长度足以发挥作 用以便与特定目标DNA片段（S卩，样品中事件MON 87741DNA内存在且诊断出样品中事件 MON 87741DNA的存在的DNA的独特片段）结合的DNA分子或多核苷酸片段。此类探针可 以设计为仅结合只存在于玉米事件MON 8741IDNA中的单一连接或其它新型序列，或两个 或更多个此类单一连接片段。在任何情况下，此类探针与特定样品中怀疑包含玉米DNA的 DNA分子的结合的检测诊断出样品中玉米事件MON 87411的存在。
[0020] 引物通常作为不同寡核苷酸或多核苷酸片段的配对提供，其用于扩增特定DNA目 标片段的热扩增反应中。配对中的每个引物设计成结合用于扩增的目标DNA的片段内或附 近的特定DNA片段。引物以此类方式结合，所述方式使得这些然后充当核酸序列聚合中的 定位区域，导致一个或多个扩增子（DNA的扩增目标片段）的产生。在本发明中，使用经设 计以结合特定生物样品中的玉米事件MON 8741IDNA的独特片段且扩增包含一个或多个本 文所述的连接片段的特定扩增子的引物和在聚合酶反应完成或终止后检测和或表征此类 扩增子，从而诊断出特定样品中玉米事件MON 87411的存在。技术人员非常熟悉这种扩增 方法，且此处不必叙述扩增的细节。
[0021] 玉米植物、玉米植物细胞、玉米植物组织和玉米种子由于SEQ ID NO :1所示的 3'远端处的表达盒中从水稻Rcc3启动子表达草甘膦不敏感的CP4EPSPS酶而对草甘膦 除草剂应用不敏感。可以将此类种子播种到田间。发芽和枝条出现后几天，可以应用杂 草控制有效量的草甘膦除草剂，这将基本上消除田间的所有杂草，但将允许包含玉米事件 MON 87411DNA的玉米植物的持续生长和发育。所述植物还对所有已知的根虫叶甲属种的 玉米根虫的侵染耐受，所述叶甲属包括但不限于玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera virgifera)(西方玉米根虫，WCR)、北美玉米根叶甲（Diabrotica barberi)(北方玉米根 虫，NCR)、玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera zeae)(墨西哥玉米根虫，MCR)、带斑黄瓜 叶甲（Diabrotica balteata)(巴西玉米根虫（BZR)或由叶甲赌（Diabrotica viridula) 和叶甲桐（Diabrotica speciosa)组成的巴西玉米根虫复合群（BCR))，和黄瓜^--星叶甲 (Diabrotica undecimpunctata howardii)(南部玉米根虫，SCR))。对叶甲属种的抗性的 产生与可操作地且共价地连接在插入的转基因DNA内的两个不同的DNA片段的表达有关： dsRNA从SEQ ID NO :1所示和图1中[G] SEQ ID NO : 12的位置所示的插入的转基因DNA的 5'近端的表达盒转录，且靶向抑制玉米根虫中的必需基因；且鞘翅目毒性Cry3Bb蛋白从 SEQ ID N0:1(图1中由[I]SEQ ID N0:16所示的草甘膦耐受性表达盒）所示的插入的转 基因DNA的表达dsRNA[G]的盒和3'远端的盒之间居中的表达盒（约居中于图1中[H] SEQ ID NO :14的位置所示的SEQ ID NO :1中）表达。所述dsRNA靶向抑制被称为snf7的 酵母直向同源基因，且从CAMV e35S启动子表达，而Cry3Bb蛋白从玉米PIIG启动子表达。 dsRNA和Cry3Bb蛋白是对玉米根虫种有毒的试剂。
[0022] 驱动dsRNA和Cry3Bb毒性剂的表达的启动子发散定位，从而使得各自毒性剂从每 种启动子的表达远离两个启动子之间居中的点，即，每个表达盒的转录以相反方向进行，并 且不汇聚。草甘膦耐受性CP4EPSPS表达盒在下游，即靠近SEQ ID NO :1所示的3'端和驱 动Cry3Bb蛋白表达的盒的3'远端。驱动Cry3Bb和EPSPS表达的盒使用转录的串联方向 (Cry3Bb在EPSPS的上游）产生各自的蛋白，且以相同方向转录，但各自来自它们的各自独 立的启动子。使dsRNA表达盒和早甘勝耐受性盒完整且定位于意在插入玉米基因组中的 DNA片段的远端，产生其它变体构建体，其中将Cry3Bb盒的方向相对于事件MON 8741IDNA 中存在的设计反转或颠倒。这些变体构建体利用玉米PIIG启动子或水稻Rcc3启动子来驱 动Cry3Bb的表达。
[0023] 将仅包含这些变体构建体/Cry3Bb表达盒的方向的转基因事件与事件MON 87411 和与当前可用的商业事件MON 863 (仅包含Cry3Bb表达盒）、MON 88017(包含可操作连接 至CP4EPSPS表达盒的Cry3Bb表达盒）和DAS-59122-7 (包含三个可操作连接的表达盒，两 个串联表达双重Bt毒素组分Cry34和Cry35,连同赋予草铵膦耐受性的基因）进行比较。 如下文实施例中示出的结果表明，事件MON 87411表现出用于Cry3Bb蛋白的根引导表达的 优异特性，且使用用于生成事件MON 87411的构建体产生的多个转基因事件比用其它构建 体产生的其它事件各自更可能表现出玉米根虫的有效控制。
[0024] 本发明的玉米植物及其部分（包括种子，每个都包含对应于事件MON 87411的 DNA)在本发明的范围之内。此类植物对玉米根虫侵袭耐受，且对除草剂草甘膦的应用不 敏感。此类植物包括只包含M0N87411等位基因的杂合体，即表征为关于对应于事件MON 8741IDNA的基因座是杂合的基因组。此类杂合体通过与所需种质一起育种来产生，以确保 玉米的杂合体优势和其它农业上所需特性。杂合体可以通过多种方法来生产，但优选的方 法利用第一近交系（纯合的）亲本，其在插入事件MON 87411DNA的基因座的两个染色体上 包含事件M0N87411特异性等位基因，并且将第一近交系与不包含MON 8741IDNA的第二近 交系一起育种。两种亲本近交品种将具有后代种子（即杂合种子）中所需一种或多种有利 特性。
[0025] 为包含事件MON 87411DNA的植物赋予一些额外性状的转基因特性或等位基因是 特别理想的。此类转基因等位基因包括赋予玉米根虫抗性的其它的转基因事件，包括但不 限于诸如DAS-59122-7 ;MIR604 ;和5307的事件。这些事件中的每一个提供了补充的玉 米根虫毒性剂（DAS-59122-7提供了表现出根虫毒性特性和对草铵膦的除草剂耐受性的 PS149B1 (Cry34/Cry35) ;MIR604提供了表现出根虫毒性特性的修饰的Cry3Aa ;事件5307 提供了表现出根虫毒性特性的FRSa基因）。提供额外的玉米根虫抗性性状诸如这些可以 降低发展对提供的任一种玉米根虫毒性剂的抗性的可能性。其它所需性状包括产量和胁 迫抗性或耐受性性状、固氮性状、调节使用水的性状、对真菌侵染的抗性、对除草剂诸如麦 草畏（MON 87427)、草铵膦等的抗性，以及对鳞翅目侵染的抗性。鳞翅目侵染抗性已经在 本领域中提供，并且包括转基因玉米事件（和各自的鳞翅目活性蛋白）MON 810(CrylAb)、 MON 89034(CrylA. 105 和 Cry2Ab) ;TC1507(CrylAc 和 CrylFa) ;DAS-06275-8，也称为 TC-6275 (CrylFa 和 bar (提供草铵膦耐受性））；MIR162 (Vip3Aa)、BT176 (CrylAb);和 BTll (CrylAb)。提供单一植物中这些性状的任何组合或所有这些性状，特别是对应于事件 MON 87411性状的昆虫抗性性状，其它列举的玉米根虫抗性性状，或鳞翅目抗性性状的替代 方案将在种子共混物的各种组合中提供这些,其中共混物中的某些种子包含MON 87411性 状和仅列举的鞘翅目抗性性状的一些组合，且在地下一起作用以预防玉米根虫的侵染，而 共混物中的其它种子仅包含鳞翅目抗性性状且赋予对地上玉米的鳞翅目侵染的抗性。以这 种方式，共混物中的种子为彼此提供避难所，即鞘翅目保护的种子和植物充当赋予鳞翅目 抗性的植物的避难所，反之亦然。然而，通常，将以一些性状组合或包装提供这些性状，其中 MON 87411性状将通过与一种或多种鳞翅目抗性性状一起育种而在单一植物中一起提供， 以便为田间作物提供提供害虫抗性的完整包装，且小百分比的种子（可能在1和20%之间， 或之间的任何数，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19%)将只具 有对除草剂耐受性的性状，且缺乏任何害虫保护性状，且将与具有害虫抗性性状的种子随 机在混合物中或作为作物的结构（分开）支架种植入田间，所述作物将充当攻击地上玉米 植物的害虫和攻击地下玉米植物的害虫两者的避难所。
[0026] 插入事件MON 87411的构建体提供了相对于EPSPS表达盒的特别优点。首先，该 盒的存在提供了选择已经插入构建体的转基因事件的简易性。其次，该盒提供了对已经种 植对应于事件MON 87411的种子的田间杂草的控制。包含此类MON 87411植物的田间可以 用有效量的草甘膦喷洒，以控制易受草甘膦影响的田间杂草的生长。对于不易受草甘膦影 响的杂草。如上面所指出，可以将提供对其它除草剂诸如麦草畏或草铵膦的耐受性的其它 转基因事件育种为具有事件MON 87411的单一杂合体，因此通过应用除草剂草甘膦、麦草 畏或草铵膦中的两种或更多种而控制田间杂草的有效手段，因为将存在表现出对这些除草 剂中的两种或更多种的耐受性的杂草的可能性将是不可能的，并且在此类情况下，玉米作 物将由对此类除草剂组合的应用表现出抗性的杂合体组成。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1是玉米事件MON 87411的基因组中转基因插入物的图示：[A]表示SEQ ID NO : 1，其是整合入玉米LH244的基因组的转基因DNA插入物和侧接插入的DNA的5'和3'基 因组DNA的连续序列；[B]和[C]对应于SEQ ID NOs :2和3的相对位置，其分别形成事件 MON 87411的5'和3'转基因/基因组DNA连接序列；[D]表示SEQ ID NO :4,其是整合入 产生事件MON 87411的基因组的转基因DNA插入物的序列；[E]对应于SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7的相对位置，每个跨越转基因插入的DNA的末端和侧翼基因组DNA 之间的Y连接；[F]对应于SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9和SEQ ID NO : 10的相对位置，每 个跨越转基因插入的DNA的末端和侧翼基因组DNA之间的3'连接；[G]、[H]和[I]分别表 示对应于插入产生事件MON 87411的玉米植物基因组的转基因DNA构建体的三个不同的表 达盒；[J]和[K]表示对应于事件MON 87411的连接的寡核苷酸引物、寡核苷酸探针和DNA 扩增子。
[0028] 图 2 表示^-一种不同的 DNA 构建体（417、416、418、419、402、403、404、423、405、 406、和890)，其经工程改造以表达多达三个独特的盒，包括两个植物并入的保护剂（PIP) 盒，其祀向西方玉米根虫（WCR)，和一个单一除草剂耐受性盒。两个PIP盒包括（a) Dv_Snf7o 240-mer反向重复序列的表达盒，和（b)Cry3Bb蛋白的表达盒。每个描述的构建体包含不 同顺序和方向的这些表达盒。构建体405和406不包含除草剂耐受性盒，且构建体890仅 包含Dv_Snf7o 240-mer反向重复序列的单一表达盒。三个构建体包含从左边界（LB)至右 边界（RB)的总共十六个遗传元件：[1]LB ; [2]Ps. RbcS2-E93' UTR ; [3]240-mer Dv_Snf7o 反向重复基因；[4]玉米DnaK内含子；[5]CaMV 35S前导序列；[6]eCaMV 35S启动子；[7] 玉米PIIG启动子；[8]小麦Lhcbl前导序列；[9]水稻Actl内含子；[10] cry3Bb ORF ; [11] 小麦 Hspl73' UTR;[12]水稻 TubA(启动子、前导序列、内含子）；[13]CTP;[14]CP4EPSPS;
[15]水稻 TubA 3' UTR ;和[16] RB。
[0029] 图3[A]_[N]和[aa]_[mm]说明了可操作连接的元件和侧翼玉米基因组和当这些 存在于玉米事件MON 87411基因组中的转基因DNA插入位置内时它们相对于彼此的位置。 以下描述标识SEQ ID NO :1所示的每个元件的组成、功能和位置。
[0030] [A] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置1-500对应于与玉米事件MON 87411中转基因 插入DNA相邻的玉米基因组DNA，其在这种情况下被任意地指定为转基因插入DNA的5' 末端。
[0031] [B] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置807-1439对应于豌豆（Pisum sativum)核酮 糖二磷酸羧化酶小亚基E93'转录终止和聚腺苷酸化信号的反向互补序列。
[0032] [C]SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置1469-2098对应于设计成表达为RNA分子的反 向互补序列，所述RNA分子折叠为240个核苷酸dsRNA和150个核苷酸发夹结构，所述结构 被设计为当在叶甲属种膳食中提供时靶向抑制编码Snf7蛋白的酵母基因的叶甲属种直向 同源物。对应于叶甲属snf7直系同源基因的部分的第一 240个核苷酸片段在SEQ ID NO: 1所示的核苷酸位置1469-1708提供，对应于第一片段的反向互补序列的第二240个核苷酸 片段在SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置1850-2098列出，并且所述第一和第二片段通过在 SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置1709-1858的150个核苷酸间隔子可操作连接。
[0033] [D] SEQ ID NO: 1所示的核苷酸位置2135-2938对应于源自玉米dnaK基因的内含 子的反向互补序列。
[0034] [E] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置2839-3298对应于花椰菜花叶病毒增强的35S 启动子序列和非翻译的5'前导序列的反向互补序列。该启动子、相关的非翻译前导序列、 内含子元件[D]和转录终止和聚腺苷酸化元件[B]调控玉米植物细胞中元件[C]的表达。
[0035] [F] SEQ ID NO: 1所示的核苷酸位置3586-4534对应于源自玉米物理阻抗诱导蛋 白基因（Zm. PIIG)的启动子序列。该启动子、相关的非翻译前导序列[G]、内含子元件[H] 和转录终止和聚腺苷酸化元件[J]调控元件[I]的表达。该启动子相对于启动子[E]定 向，从而使得每个启动子（[E]和[F])将驱动它们各自元件（[C]和[I])的发散表达（参 见图2中的方框箭头，其中箭头代表从各自启动子表达的所示方向的各自的启动子（[E]和 [F]))。
[0036] [G] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置4541-4601对应于源自普通小麦（Triticum aestivum)捕光复合物bl基因（Ta. Lhcbl)的非翻译5'前导序列。
[0037] [H] SEQ ID NO: 1所示的核苷酸位置4618-5097对应于源自水稻（Oryza sativa) 肌动蛋白1基因（Os. Actl)的内含子序列。
[0038] [I] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置5107-7068对应于编码Cry3Bb玉米根虫毒性 蛋白（cry3Bb)的核苷酸序列。当在叶甲属（玉米根虫）种的膳食中提供时，编码的Cry3Bb 蛋白是杀虫的。
[0039] [J] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置7088-7297对应于普通小麦热休克蛋白 17(HSP17)转录终止和聚腺苷酸化信号的序列。
[0040] [K] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置7346-9526对应于源自水稻a微管蛋白-3基 因（TubA-3)的连续启动子-前导序列-内含子序列。该启动子与相关的前导序列和内含 子，以及转录终止和聚腺苷酸化元件[M]调控元件[L]的表达。
[0041] [L]SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置9531-11126对应于拟南芥（Arabidopsis thaliana)胞质靶向肽的序列（CTP ;从核苷酸位置9531-9758)，和源自农杆菌 (Agrobacterium) CP4的EPSPS的序列（从核苷酸位置9759-11126)。当该序列在玉米植物 细胞中被转录并翻译成蛋白时，CTP可操作地连接至EPSPS。当在包含事件MON 87411的玉 米植物细胞中表达时，该CTP-EPSPS提供对除草剂草甘膦的耐受性。
[0042] [M] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置11134-11715对应于水稻a微管蛋白-3基 因（TubA-3)转录终止和聚腺苷酸化信号的序列。
[0043] [N] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置11749-12248对应于与玉米事件MON 87411中 的转基因插入DNA相邻的玉米基因组DNA，其在这种情况下被任意地指定为转基因插入DNA 的3'末端。
[0044] [aa] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置501-806对应于在插入玉米基因组以形成事 件MON 87411的转基因DNA的任意指定的5'末端邻近于基因组的417构建体的根癌农杆 菌（Agrobacterium tumefaciens)章鱼碱左边界序列的部分。SEQ ID NO :1所示的[aa]的 5'末端连接至元件[A]的3'末端以形成由SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7和 SEQ ID NO :21涵盖的独特5'转基因插入的DNA/玉米基因组连接。元件[aa]的3'末端 连接至元件[B]的5'末端以形成由SEQ ID NO :41涵盖的转基因插入DNA内的独特连接。
[0045] [bb] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置1440-1468对应于元件[B]和[C]之间的插 入序列。SEQ ID NO :1所示的[bb]的5'末端连接至元件[B]的3'末端,且元件[bb]的 3'末端连接至元件[C]的5'末端以形成插入玉米基因组中以形成事件MON 87411的转基 因DNA内由SEQ ID NO :42涵盖的独特连接。
[0046] [cc] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置2099-2134对应于元件[C]和[D]之间的插 入序列。SEQ ID NO :1所示的[cc]的5'末端连接至元件[C]的3'末端,且元件[cc]的 3'末端连接至元件[D]的5'末端以形成插入玉米基因组中以形成事件MON 87411的转基 因DNA内由SEQ ID NO :43涵盖的独特连接。
[0047] [ee] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置3299-3585对应于元件[E]和[F]之间的插 入序列。SEQ ID NO :1所示的[ee]的5'末端连接至元件[E]的3'末端,且元件[ee]的 3'末端连接至元件[F]的5'末端以形成插入玉米基因组中以形成事件MON 87411的转基 因DNA内由SEQ ID NO :44涵盖的独特连接。
[0048] [ff] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置4535-4540对应于元件[F]和[G]之间的插 入序列。SEQ ID NO :1所示的[ff]的5'末端连接至元件[F]的3'末端，且元件[ff]的 3'末端连接至元件[G]的5'末端以形成插入玉米基因组中以形成事件MON 87411的转基 因DNA内由SEQ ID NO :45涵盖的独特连接。
[0049] [gg] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置4602-4617对应于元件[G]和[H]之间的插 入序列。SEQ ID NO :1所示的[gg]的5'末端连接至元件[G]的3'末端,且元件[gg]的 3'末端连接至元件[H]的5'末端以形成插入玉米基因组中以形成事件MON 87411的转基 因DNA内由SEQ ID NO :46涵盖的连接，但其对于事件MON 87411不是独特的。
[0050] [hh] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置5098-5106对应于元件[H]和[I]之间的插 入序列。SEQ ID NO :1所示的[hh]的5'末端连接至元件[H]的3'末端,且元件[hh]的 3'末端连接至元件[I]的5'末端以形成插入玉米基因组中以形成事件MON 87411的转基 因DNA内由SEQ ID NO :47涵盖的连接，但其对于事件MON 87411不是独特的。
[0051] [ii]SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置7069-7087对应于元件[I]和[J]之间的插 入序列。SEQ ID NO :1所示的[ii]的5'末端连接至元件[I]的3'末端,且元件[ii]的 3'末端连接至元件[J]的5'末端以形成插入玉米基因组中以形成事件MON 87411的转基 因DNA内由SEQ ID NO :48涵盖的连接，但其对于事件MON 87411不是独特的。
[0052] [jj] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置7298-7345对应于元件[J]和[K]之间的插 入序列。SEQ ID NO :1所示的[jj]的5'末端连接至元件[J]的3'末端,且元件[jj]的 3'末端连接至元件[K]的5'末端以形成插入玉米基因组中以形成事件MON 87411的转基 因DNA内由SEQ ID NO :49涵盖的独特连接。
[0053] [kk] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置9527-9530对应于元件[K]和[L]之间的插 入序列。SEQ ID NO :1所示的[kk]的5'末端连接至元件[K]的3'末端,且元件[kk]的 3'末端连接至元件[L]的5'末端以形成插入玉米基因组中以形成事件MON 87411的转基 因DNA内由SEQ ID NO :50涵盖的独特连接。
[0054] [11] SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置11127-11133对应于元件[L]和[M]之间的 插入序列。SEQ ID NO :1所示的[11]的5'末端连接至元件[L]的3'末端,且元件[11]的 3'末端连接至元件[M]的5'末端以形成插入玉米基因组中以形成事件MON 87411的转基 因DNA内由SEQ ID NO :51涵盖的独特连接。
[0055] [mm]SEQ ID NO :1所示的核苷酸位置11716-11748对应于在插入玉米基因组以形 成事件MON 87411的转基因DNA的任意指定的3'末端邻近于基因组的417构建体的根癌 农杆菌胭脂氨酸右边界序列的部分。SEQ ID NO :1所示的[mm]的5'末端连接至元件[M] 的3'末端，且元件[mm]的3'末端连接至元件[N]的5'末端以形成由SEQ ID NO :52涵盖 的独特的转基因插入DNA/玉米基因组连接。
[0056] 图4与具有串联方向的驱动玉米根虫毒性剂的表达的启动子的载体相比，经测 试显示发散启动子驱动玉米根虫毒性剂的表达的更高功效的载体的盒方向的图。
[0057] 序列简述
[0058] SEQ ID NO :1是事件MON 87411的核苷酸序列，且从5'至3'代表事件MON 87411 中侧接（邻近）插入的转基因DNA的5'基因组DNA的片段（500个核苷酸）、插入的转基因 DNA(11，248个核苷酸），和侧接（邻近）插入的转基因DNA的3'基因组DNA的片段（500 个核苷酸）。
[0059] SEQ ID NO :2是事件MON 87411的核苷酸连接序列，且从5'至3'代表事件MON 87411的邻近插入的转基因DNA的5'基因组DNA的片段（500个核苷酸）和插入的转基因 DNA边界残余（263个核苷酸）。
[0060] SEQ ID NO :3是事件MON 87411的核苷酸连接序列，且从5'至3'代表事件MON 87411的插入的转基因DNA边界残余（15个核苷酸）和邻近插入的转基因DNA的3'基因 组DNA的片段（500个核苷酸）。
[0061] SEQ ID NO :4是事件MON 87411的核苷酸序列，且代表事件M0N87411的插入的基 因组DNA (11248个核苷酸）。
[0062] SEQ ID NO :5是事件MON 87411的核苷酸连接序列，且从5'至3'代表事件MON 87411的邻近插入的转基因DNA的5'基因组DNA的片段（50个核苷酸）和插入的转基因 DNA边界残余（263个核苷酸）。
[0063] SEQ ID NO :6是事件MON 87411的核苷酸连接序列，且从5'至3'代表事件MON 87411的邻近插入的转基因DNA的5'基因组DNA的片段（110个核苷酸）和插入的转基因 DNA边界残余（263个核苷酸）。
[0064] SEQ ID NO :7是事件MON 87411的核苷酸连接序列，且从5'至3'代表事件MON 87411的邻近插入的转基因DNA的5'基因组DNA的片段（145个核苷酸）和插入的转基因 DNA边界残余（263个核苷酸）。
[0065] SEQ ID NO :8是事件MON 87411的核苷酸连接序列，且从5'至3'代表事件MON 87411的插入的转基因DNA的片段（83个核苷酸）和邻近插入的转基因DNA的3'基因组 DNA的片段（34个核苷酸）。
[0066] SEQ ID NO :9是事件MON 87411的核苷酸连接序列，且从5'至3'代表事件MON 87411的插入的转基因DNA的片段（83个核苷酸）和邻近插入的转基因DNA的3'基因组 DNA的片段（90个核苷酸）。
[0067] SEQ ID NO : 10是事件MON 87411的核苷酸连接序列，且从5'至3'代表事件MON 87411的插入的转基因DNA的片段（83个核苷酸）和邻近插入的转基因DNA的3'基因组 DNA的片段（255个核苷酸）。
[0068] SEQ ID NO : 11 是来自玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera virgifera)(西方 玉米根虫）的编码与酵母Snf7直向同源的ESCRT-III复合体亚基的cDNA序列的核苷酸序 列。
[0069] SEQ ID NO :12是代表包括经工程改造以表达反向重复RNA分子的重组基因的DNA 表达盒的反义链的核苷酸序列。反向重复DNA片段对应于位置663至902和位置1292至 1053。反向重复DNA序列对应于SEQ ID NO :11的核苷酸序列的核苷酸位置151-390。
[0070] SEQ ID NO : 13是从SEQ ID NO : 12所示的DNA转录的核糖核苷酸序列。
[0071] SEQ ID NO : 14是代表包括经工程改造以编码和表达玉米根虫毒性Cry3Bb蛋白的 DNA表达盒的有义链的核苷酸序列。
[0072] SEQ ID NO : 15是对应于SEQ ID NO : 14的位置1522-3480且代表玉米根虫毒性 Cry3Bb蛋白的多核苷酸的氨基酸序列翻译。
[0073] SEQ ID NO : 16是代表包括经工程改造以编码和表达5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷 酸合酶（EPSPS)蛋白的DNA表达盒的有义链的核苷酸序列。
[0074] SEQ ID NO : 17是对应于SEQ ID NO : 16的位置2186至3781且代表表现出对除草 剂草甘膦的不敏感性的EPSPS蛋白的多核苷酸的氨基酸序列翻译。
[0075] SEQ ID NO :18是被称为SQ27011的合成寡核苷酸的核苷酸序列，并且与对应于 SEQ ID NO :1的位置462-490的核苷酸序列相同。
[0076] SEQ ID NO : 19是被称为PB3552的合成寡核苷酸的核苷酸序列，并且与对应于SEQ ID NO :1的位置502-515的核苷酸序列的反向互补序列相同。PB3552可以用6-羧基荧光 素部分出-FAM?)进行5'标记且用淬灭剂部分进行3'标记，其用于与一对热扩增引物 (例如，SQ27011和SQ9085)组合使用，并且能够用于TAQMAN? DNA扩增方法中以检 测包含玉米事件MON 87411DNA的生物样品中事件MON 87411DNA的存在。
[0077] SEQ ID NO :20是被称为SQ9085的合成寡核苷酸的核苷酸序列，并且与对应于SEQ ID NO :1的位置516-541的核苷酸序列的反向互补序列相同。
[0078] SEQ ID NO :21是事件MON 87411的核苷酸序列，且对应于SEQ ID NO :1的位置 462-541。表现出该序列的扩增子可以用一对热扩增引物（例如，SQ27011和SQ9085)来产 生。
[0079] SEQ ID NO :22是被称为SQ27066的合成寡核苷酸的核苷酸序列，并且与对应于 SEQ ID NO :1的位置11710-11728的核苷酸序列相同。
[0080] SEQ ID NO :23是被称为PB11300的合成寡核苷酸的核苷酸序列，并且与对应于 SEQ ID NO :1的位置11731-11755的核苷酸序列相同。PB 11300可以用6-羧基荧光素部 分（6-FAM?)进行5'标记，且可以用淬灭剂部分进行3'标记。以这种方式标记，PB 11300 可以与一对PCR引物（例如，SQ27066和SQ26977)组合使用，以便在TAQMAN?测定中 检测事件MON 87411。
[0081] SEQ ID NO :24是被称为SQ26977的合成寡核苷酸的核苷酸序列，并且与对应于 SEQ ID NO :1的位置11756-11784的核苷酸序列的反向互补序列相同。
[0082] SEQ ID NO :25是事件MON 87411的核苷酸序列，且对应于SEQ ID NO :1的位置 11710-11784。表现出该序列的扩增子可以用一对引物（例如，SQ27066和SQ26977)来扩 增，并且诊断出事件MON 87411。
[0083] SEQ ID NO :26是代表DNA构建体#417的核苷酸序列。
[0084] SEQ ID NO :27是代表DNA构建体#416的核苷酸序列。
[0085] SEQ ID NO :28是代表DNA构建体#418的核苷酸序列。
[0086] SEQ ID NO :29是代表DNA构建体#419的核苷酸序列。
[0087] SEQ ID NO :30是代表DNA构建体#402的核苷酸序列。
[0088] SEQ ID NO :31是代表DNA构建体#403的核苷酸序列。
[0089] SEQ ID NO :32是代表DNA构建体#404的核苷酸序列。
[0090] SEQ ID NO :33是代表DNA构建体#423的核苷酸序列。
[0091] SEQ ID NO :34是代表DNA构建体#405的核苷酸序列。
[0092] SEQ ID NO :35是代表DNA构建体#406的核苷酸序列。
[0093] SEQ ID NO :36是代表DNA构建体#890的核苷酸序列。
[0094] SEQ ID NO :37是代表事件MON 87411的野生型等位基因的LH244玉米植物的核苷 酸序列。表现出该核苷酸序列的扩增子可以用一对PCR引物（例如，SQ27011和SQ26977) 来产生并且诊断出事件MON 87411的野生型等位基因。
[0095] SEQ ID NO :38是被称为SQ20221的合成寡核苷酸的核苷酸序列。
[0096] SEQ ID NO :39是被称为PB10065的合成寡核苷酸的核苷酸序列。PB 10065可以 用VICtm进行5'标记，且可以用淬灭剂部分进行3'标记。以这种方式标记，PB 10065可 以与一对PCR引物（例如，SQ 10065和SQ20222)组合使用，以便在TAQMAN?测定中 检测玉米的内源基因片段的存在。
[0097] SEQ ID NO :40是被称为SQ20222的合成寡核苷酸的核苷酸序列。
[0098] SEQ ID NOs :41-52是SEQ ID NO :1区域的核苷酸序列，其中每个SEQ ID NO :涵 盖图3简述中详述的由插入序列和表达盒元件形成的连接。
[0099] 详述
[0100] 本发明人已经鉴定了转基因玉米事件MON 87411，其表现出与现有转基因玉米植 物相比优异的特性和表现。玉米事件MON 87411包含三个可操作连锁的表达盒，其共同为 包含转基因事件MON 87411的玉米细胞、玉米组织、玉米种子和玉米植物赋予玉米根虫抗 性和草甘膦除草剂耐受性的性状。玉米事件MON 87411提供了两种针对玉米根虫害虫物种 (包括叶甲属（Diabrotica spp.)，特别是当害虫是玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera virgifera)(西方玉米根虫，WCR)、北美玉米根叶甲（Diabrotica barberi)(北方玉米根 虫，NCR)、玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera zeae)(墨西哥玉米根虫，MCR)、带斑黄瓜 叶甲（Diabrotica balteata)(巴西玉米根虫（BZR)或由叶甲赌（Diabrotica viridula) 和叶甲桐（Diabrotica speciosa)组成的巴西玉米根虫复合群（BCR))，或黄瓜^--星叶甲 (Diabrotica undecimpunctata howardii)(南部玉米根虫，SCR))的作用模式。其它转基因 玉米事件已经在现有技术中引用，其提供单独赋予的各个实施方案，诸如MON 863 (通过表 达Cry3Bb杀虫毒素蛋白而赋予对玉米根虫的抗性的性状），或提供两种或更多种性状的转 基因玉米事件，诸如在玉米事件MON 88017 (通过表达Cry3Bb杀虫毒素蛋白而赋予对玉米 根虫的抗性的性状和通过表达草甘膦不敏感的EPSPS而赋予对草甘膦除草剂的抗性的性 状）和玉米事件DAS 59122-7(通过表达二元苏云金芽孢杆菌毒素PS149B1(也称为Cry34/ Cry35)而赋予对玉米根虫的抗性的性状和对除草剂草铵膦的耐受性的性状）。其它现有技 术公开了通过将由玉米事件MON 88017或DAS 59122-7赋予的性状与由靶向抑制对于根虫 存活关键的玉米根虫基因的dsRNA的表达导致的赋予玉米根虫抗性的性状的转基因玉米 事件一起育种的组合（US 7,943,819)。此类组合中固有的是与将玉米基因组内位于多个 不同基因座和多个染色体上的这些多种性状一起育种为单一玉米植物并保持这些性状作 为许多杂合体（如果不是数百种不同的玉米种质品种）相关的问题。对于此类问题的解决 方案将是在单一基因座中包括这些性状一起的组合。本发明人在本文中提供了一种玉米事 件MON 87411形式的此类问题的解决方案，其将三个共价连锁的表达盒一起组合在玉米基 因组内的单一基因座中，这些表达盒为包含转基因事件MON 87411的玉米细胞、玉米组织、 玉米种子和玉米植物赋予玉米根虫抗性和草甘膦除草剂耐受性的性状。使用玉米事件MON 87411为玉米种植者提供了主要优点：a)通过提供两种不同的玉米根虫抗性作用模式而保 护免于由于玉米根虫幼虫造成的经济损失，和b)将包含草甘膦的农业除草剂应用于玉米 作物而用于广谱杂草控制的能力。此外，编码玉米根虫和草甘膦耐受性状的转基因连锁在 相同的DNA片段上，并出现在MON 87411的基因组中的单一基因座，从而提供了增强的育种 效率并使得能够使用分子标记物以在育种群体及其后代中追踪转基因插入物。
[0101] 玉米事件MON 87411由具有质粒构建体pMON 120417的近交玉米系的农杆菌介导 的转化方法产生。当包含玉米事件MON 87411的玉米细胞在此类玉米根虫的膳食中提供 时，该质粒构建体包含与对于CP4EPSPS蛋白以及Cry3Bb蛋白和靶向抑制玉米根虫细胞中 必要基因的dsRNA在玉米植物细胞中的表达所必需的调控遗传元件连锁的植物表达盒。将 玉米细胞再生为完整的玉米植物，且单个植物选自显示植物表达盒的完整性和对草甘膦的 抗性和玉米根虫幼虫采食损害的植物群体。在其基因组中包含玉米事件MON 87411中存在 的连锁的植物表达盒的玉米植物是本发明的一个方面。
[0102] 插入玉米事件MON 87411的基因组的质粒DNA通过详细的分子分析来表征。这些 分析包括：转基因插入DNA的插入物数量（玉米基因组内整合位点的数量）、拷贝数（一个 基因座内T-DNA的拷贝数）和完整性。包含插入产生事件MON 87411的玉米基因组的三 个连锁的表达盒的质粒构建体包含未知天然出现在玉米基因组中或玉米的其它载体或转 基因事件或其它中的多个片段（用于建立或构建几个表达盒的元件之间的连接序列）（例 如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10 ;SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、 SEQ ID N0：16,SEQ ID N0：2USEQ ID N0：25,SEQ ID NO ：4U SEQ ID N0：42,SEQ ID NO： 43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、和SEQ ID NO :52所示的序列）。此外，产生事件MON 87411中的插入的转基因DNA的转化事件在本文 中被表征为插入玉米基因组中单一基因座,从而导致插入的DNA与玉米基因组DNA之间的 两个新基因座或连接序列（额外连接序列），其长度足以仅对包含事件MON 87411的玉米基 因组而言是独特的。这些连接序列可用于检测玉米细胞、组织、种子和植物或植物产品（商 品）中事件MON 87411DNA的存在。DNA分子探针和引物对在本文中描述，其已经开发用于 鉴定含有或疑似含有包含事件MON 87411DNA的玉米细胞、种子、植物部分或植物组织的 生物样品中这些各种连接片段的存在。数据显示，事件MON 87411包含具有一个拷贝插入 的转基因DNA的单一 T-DNA插入。除了用于将转基因DNA从植物转化质粒转移到玉米基因 组的根癌农杆菌左和右边界区域的部分以外，没有在事件MON 87411中鉴定到来自转化载 体pMON 120714的额外元件。最后，进行产生诊断出样品中此类事件MON 87411DNA的存在 的特异性扩增子的热扩增和DNA序列分析，以测定任意指定的5'和3'插入物至植物基因 组连接，确认插入物内元件的组织，并测定玉米植物事件MON 87411 (SEQ ID NO :1)中插入 的转基因DNA的完整DNA序列。
[0103] 数十个转基因事件使用用于产生转基因事件MON 87411的构建体产生，且产生不 同的构建体并用于产生数十个其它转基因玉米事件，将其与MON 87411和类似事件进行比 较。均在膳食生物测定中测试这些事件对于控制玉米根虫的功效，其中转基因玉米植物事 件组织提供于玉米根虫幼虫的膳食中。经测定，当表达这些抗性性状的玉米事件细胞提供 于玉米根虫幼虫的膳食中时，负责为各种事件赋予玉米根虫抗性性状的两种不同的表达盒 的表达方向对于所述事件提供玉米根虫控制的功效是关键的。观察到两个不同的启动子 CAMV e35S和Zm. PIIG提供了包含从e35S启动子表达dsRNA玉米根虫保护剂和从邻近于 e35S启动子并从其发散的Zm. PIIG启动子表达Cry3Bb玉米根虫毒性蛋白的表达盒的玉米 事件的令人惊讶且优异的功效。当这些启动子处于这种特定方向时，获得了表现出功效的 转基因事件的显著改善的比率。
[0104] 除非本文另有说明，可以根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解术 语。分子生物学中的常用术语的定义也可以在以下文献中找到：Rieger等人，Glossary of Genetics !Classical and Molecular,第 5版，Springer-Verlag :New York,1991 ;和 Lewin，Genes V，Oxford University Press :New York，1994。如本文中所用，术语"玉米" 是指玉米（Zea mays)，其包括可用包含MON 87411的玉米植物育种的所有植物品种。如本 文中所用，术语"包含"意指"包括但不限于"。
[0105] 本发明提供了已经用DNA构建体转化的转基因植物，所述转基因植物包含至少 三个表达盒；表达玉米根虫毒性量的经设计以抑制与酵母snf7基因直向同源的玉米根虫 必需基因的dsRNA的第一表达盒，第二表达盒表达玉米根虫毒性量的Cry3Bb S -内毒素，且 表达对草甘膦抑制不敏感的草甘膦耐受酶CP4EPSPS的第三表达盒。根据所述方法且用本 文公开的DNA构建体转化的玉米植物抵抗CRW且对草甘膦除草剂的应用耐受。连锁的农艺 性状提供了在育种群体中一起维持这些性状的简易性，并表现出比仅含单一玉米根虫抑制 基因或包含相同的玉米根虫抑制基因（Cry3Bb和dsRNA，其作为育种堆栈组合）的植物更大 的玉米根虫功效。
[0106] 转基因"植物"是如下产生的：用异源DNA(即，包括目标转基因的多核酸构建体） 转化植物细胞，再生由向植物细胞基因组中插入转基因而产生的植物群体，和选择以插入 特定基因组位置为特征的特定植物。术语"事件"是指包含异源DNA的原始转化体植物和 该转化体的后代。术语"事件"也包括通过事件和另一植物之间的有性远交产生的后代，其 中所述后代包括异源DNA。甚至在与回交亲本（recurrent parent)反复回交后，来自转化 的亲本事件的插入DNA和侧翼基因组DNA存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语"事 件"也指来自包含插入DNA和紧邻该插入DNA的侧翼基因组序列的原始转化体的DNA，预期 其由于包含插入DNA的一个亲本系（例如，原始转化体和由自交产生的后代）和不包含插 入DNA的亲本系的有性杂交而转移到接受了包含目标转基因的插入DNA的后代中。本发明 涉及转基因事件、包含MON 87411的玉米植物、其后代和其中包含的DNA组成。
[0107] "探针"是其上附有常规可检测的标记或报告分子（例如放射性同位素、配体、化学 发光剂或酶）的分离的核酸。此类探针与目标核酸的链互补，在本发明的情况下与来自MON 87411的基因组DNA的链互补，不论其来自MON 87411植物还是来自包含MON 87411DNA的 样品。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特异性结合目标DNA序 列的聚酰胺和其它探针材料，并且可用于检测目标DNA序列的存在。
[0108] DNA引物是分离的多核酸，其通过核酸杂交与互补的目标DNA链退火以形成引物 和目标DNA链之间的杂合体，然后通过聚合酶（例如，DNA聚合酶）沿着目标DNA链延伸。 本发明的DNA引物对或DNA引物组是指两种DNA引物可用于目标核酸序列的扩增，例如，通 过聚合酶链反应（PCR)或其它常规多核酸扩增方法。
[0109] DNA探针和DNA引物的长度一般为11个或更多个多核苷酸，通常为18个或更多个 多核苷酸、24个或更多个多核苷酸、或30个或更多个多核苷酸。此类探针和引物选择为长 度足以在高严格杂交条件下特异性地与目标序列杂交。优选地，本发明的探针和引物具有 与目标序列的完全序列相似性，尽管可以通过传统方法设计不同于目标序列而保留与目标 序列杂交的能力的探针。
[0110] 本文公开的基于侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以用于通过常规方 法（例如，通过再克隆和测序这种DNA分子）确认（及如果必要，校正）公开的DNA序列。
[0111] 本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA分子杂交。任何常规的核酸 杂交或扩增方法可以用于鉴定样品中来自转基因植物的DNA的存在。多核酸分子（也称 为核酸片段）或其片段在某些情况下能够特异性地与其它核酸分子杂交。如本文所用，如 果两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，那么这两个分子被认为能够特异性地彼此 杂交。如果核酸分子显示完全互补性，则它们被认为是另一个核酸分子的"互补序列"。如 本文中所用，当分子之一的每一个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，则分子被认为显 示"完全互补性"。如果两个分子能够以足够的稳定性互相杂交从而允许它们在至少常规 的"低严格性"条件下保持彼此退火，那么这两个分子被认为是"最低限度互补的"。类似 地，如果分子以足够的稳定性互相杂交从而允许它们在常规的"高严格性"条件下保持彼此 退火，那么分子被认为是"互补的"。Sambrook等人，1989,和Haymes等人：Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)描述了常规的 严格性条件，因此偏离完全互补性是允许的，只要这种偏离没有完全消除该分子形成双链 结构的能力。为了使核酸分子用作引物或探针，只需要在序列中充分互补以能够在所采用 的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
[0112] 如本文所用，基本上同源的序列是将在高严格性条件下与所比较的核酸序列的互 补序列特异性杂交的核酸序列。促进DNA杂交的合适的严格性条件，例如，约45°C下6. Ox 氯化钠/柠檬酸钠（SSC)，然后在50°C下2. Ox SSC洗涤，是本领域的技术人员已知的， 或可以在 Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y. (1989)， 6. 3. 1-6. 3. 6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从50°C下约2. Ox SSC的低严格性到 50°C下约0.2x SSC的高严格性中选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温（约22°C)的 低严格性条件增加到约65°C的高严格性条件。温度和盐都可以变化，或者温度或盐浓度中 的一个可以保持恒定，而另一个变量发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的多核酸 将在中等严格条件（例如，约2.(^33(：和约65°〇下特异性地与3￡0 10勵8:1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、12、14、16、21、25、41、42、43、44、45、49、50、51、或 52 所示的核酸分子或其互 补序列或其中任何片段中的一个或多个杂交。在一个特别优选的实施方案中，本发明的核 酸将在高严格性条件下特异性地与SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、21、25、 41、42、43、44、45、49、50、51、或52所示的核酸分子或互补序列或其中任何片段中的一个或 多个杂交。在本发明的一方面，本发明优选的标记物核酸分子具有SEQ ID NO :1、或SEQ ID NO :2、或SEQ ID NO :3、或SEQ ID NO :4、或SEQ ID NO :5、或SEQ ID NO :6、或SEQ ID NO :7、 或 SEQ ID NO :8、或 SEQ ID NO :9、或 SEQ ID NO :10;或 SEQ ID NO :12、或 SEQ ID NO :14、 *SEQIDN0:16、*SEQIDN0:21、*SEQIDN0:25、*SEQIDN0 :41、*SEQIDN0:42、 *SEQIDN0:43、*SEQIDN0:44、*SEQIDN0:45、*SEQIDN0 :49、*SEQIDN0:50、 或SEQ ID NO :51、或SEQ ID NO :52所示的核酸序列或其互补序列或其中任何片段。可以 通过本领域的技术人员已知的多种方法检测探针与目标DNA分子的杂交，这些方法可以包 括但不限于，突光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
[0113] 关于使用特定扩增引物对进行目标核酸序列的扩增（例如，通过PCR)，"严格条 件"是使得引物对仅与具有相应野生型序列（或其互补序列）的引物与之结合的目标核酸 酸序列杂交的条件，并优选地在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物，扩增子。
[0114] 术语"对于（目标序列）特异性的"表示探针或引物在严格杂交条件下仅与包含 目标序列的样品中的目标序列杂受。
[0115] 如本文所用，"扩增的DNA"或"扩增子"是指针对作为多核酸模板的部分的目标多 核酸分子的多核酸扩增方法的产物。例如，为了确定有性杂交产生的玉米植物是否包含来 自包含本发明的MON 87411的玉米植物的转基因植物基因组DNA，从玉米植物组织样品中 提取的DNA可以使用引物对（该引物对包含源自与插入的异源DNA(转基因DNA)的插入位 点邻近的包含植物的MON 87411基因组的DNA序列的引物，和源自插入的异源DNA的第二 引物）进行多核酸扩增方法，以产生可诊断MON 87411植物DNA的存在的扩增子。诊断性 扩增子具有一定长度，且具有也可诊断植物基因组DNA的DNA序列。扩增子的长度范围可 为引物对加上1个核苷酸碱基对的组合长度，优选加上约50个核苷酸碱基对，更优选加上 约250个核苷酸碱基对，甚至更优选加上约450个核苷酸碱基对或更多个。或者，引物对可 以源自位于插入的异源DNA两侧的基因组序列，从而产生包含完整的插入物多核苷酸序列 的扩增子（例如，分离自SEQ ID NO :1的基因组部分的正向引物和分离自SEQ ID NO :1的 基因组部分的反向引物，后者扩增在事件MON 87411基因组中包含本文中鉴定的连接序列 的DNA分子）。源自邻近于插入的转基因DNA的植物基因组序列的引物对的成员位于距离 插入的DNA序列一定距离的位置，该距离可以从1个核苷酸碱基对直到高达约两万个核苷 酸碱基对。术语"扩增子"的使用明确排除可能在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
[0116] 可以通过本领域已知的各种多核酸扩增方法中的任何一种，包括聚合酶链式反应 (PCR)，来实现多核酸扩增。扩增方法是本领域已知的且特别在美国专利号4, 683, 195和 4, 683, 202 及 PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications，Innis 等人（编）， Academic Press，San Diego, 1990中描述。已经开发了 PCR扩增方法以扩增高达22kb (千 喊基）的基因组DNA和高达42kb的噬菌体DNA (Cheng等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 5695-5699,1994)。这些方法以及DNA扩增领域内已知的其它方法可以用于本发明实践中。 使用源于本文中提供的序列的引物，通过扩增来自事件MON 87411的这种DNA分子（包含 种子或由保存于ATCC并具有保藏号PTA-12669的种子发育的植物），随后对PCR扩增子或 其克隆的DNA片断进行标准DNA测序，可验证异源DNA插入物的序列或来自MON 87411的 侧翼基因组DNA序列（且如果需要进行校正）。
[0117] 基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒包含与目标DNA特异性杂交且在适当的反应 条件下扩增诊断性扩增子的DNA引物分子。该试剂盒可提供基于检测方法的、或任何本领 域已知的检测诊断性扩增子的方法的琼脂糖凝胶。包含与SEQ ID NO :1所示的玉米基因组 区域的任何部分和与SEQ ID NO :1所示的插入的转基因DNA的任何部分同源或互补的DNA 引物的试剂盒是本发明的一个目标。可用作DNA引物的DNA分子可以由DNA扩增领域中的 那些技术人员选自公开的MON 87411(SEQ ID N0:1)的转基因/基因组DNA序列。
[0118] 可以通过多种技术检测由这些方法产生的诊断性扩增子。一种这样的方法为遗传 位点分析（Genetic Bit Analysis) (Nikiforov，等人 Nucleic Acid Res. 22:4167-4175， 1994)，其中设计了与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列部分重叠的DNA寡核苷 酸。将寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在PCR目标区域（使用插入的序列中的一个引物和 相邻侧翼基因组序列中的一个引物）后，可将单链PCR产物与固定的寡核苷酸杂交，并将其 用作模板、使用DNA聚合酶和对于预期的下一个碱基是特异性的标记的双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)进行单碱基延伸反应。读出可以是基于荧光或ELISA的。由于成功的扩增、杂交和 单喊基延伸，彳目号表不转基因/基因组序列的存在。
[0119] 另一个方法为由 Winge (Innov. Pharma. Tech. 00 :18_24, 2000)描述的焦磷酸测序 技术。在该方法中，设计与相邻基因组DNA和插入物DNA连接部分重叠的寡核苷酸。将寡 核苷酸与来自目标区域（一个引物在插入的序列中以及一个引物在侧翼基因组序列中）的 单链PCR产物杂交，在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5' 磷酸硫酸和萤光素存在下进行孵育。单独地添加DNTP，掺入导致被测量的光信号。光信号 表明由于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸而存在转基因/基因组序列。
[0120] 由Chen等人，（Genome Res. 9 :492-498,1999)描述的突光偏振为可用于检测本发 明扩增子的方法。通过使用该方法，设计与基因组侧翼和插入的DNA连接部分重叠的寡核 苷酸。将寡核苷酸与来自目标区域（一个引物在插入的DNA中并且一个引物在侧翼基因组 DNA序列中）的单链PCR产物杂交，并且在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP存在下进行孵 育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。掺入可使用荧光计测量为偏振的改变。由于成功的扩 增、杂交和单碱基延伸，偏振的改变表示转基因/基因组序列的存在。
[0121] Tacjman? (PE Applied Biosystems，Foster City，CA)被描述为一种检测和定 量DNA序列的存在的方法，且根据制造商提供的说明书可以完全理解。简而言之，设计与基 因组侧翼和插入DNA连接部分重叠的FRET寡核苷酸探针。在热稳定聚合酶和dNTP存在下 循环FRET探针和PCR引物（一个引物在插入物DNA序列中和一个引物在侧翼基因组序列 中）。FRET探针的杂交导致荧光部分从FRET探针上的猝灭部分切割和释放。荧光信号表 明由于成功的扩增和杂交而存在转基因/基因组序列。
[0122] 已描述了分子信标在序列检测中的用途，如Tyangi等人（Nature Biotech. 14 : 303-308,1996)中所描述的。简而言之，设计与侧翼基因组和插入DNA连接部分重叠的FRET 寡核苷酸探针。RRET探针的独特结构导致其包含使荧光与猝灭部分保持紧密靠近的二级 结构。在热稳定聚合酶和dNTP存在下循环FRET探针和PCR引物（一个引物在插入物DNA 序列中并且一个引物在侧翼基因组序列中）。在成功的PCR扩增后，FRET探针与目标序列 的杂交导致探针二级结构的去除以及荧光与猝灭部分的空间分离。荧光信号产生。由于成 功的扩增和杂交，突光信号表不侧翼/转基因插入物序列的存在。
[0123] 可以使用本文公开的组合物和DNA检测领域众所周知的方法开发DNA检测试 剂盒。该试剂盒可用于鉴定样品中的玉米事件MON 87411DNA，并可应用于育种包含MON 87411DNA的玉米植物的方法。试剂盒包含可用作引物或探针且与本文所述的SEQ ID NO: 1的至少适用部分同源或互补的DNA分子。DNA分子可用于DNA扩增方法（PCR)，或用作多 核酸杂交方法即Southern分析、northern分析中的探针。
[0124] 连接序列可以由选自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、 SEQ ID N0：7,SEQ ID N0：8,SEQ ID N0：9,SEQ ID NO ： 10 ；SEQ ID N0：2USEQ ID NO ：25, SEQ ID N0:41、SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID NO: 49、 SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、和SEQ ID NO :52的序列表示。例如，连接序列可以由 作为SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :8提供的核苷酸序列任意表示。或者，连接序列可以由作 为SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :9提供的核苷酸序列任意表示。或者，连接序列可以由作为 SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :10提供的核苷酸序列任意表示。这些核苷酸通过磷酸二酯键 连接，并且在玉米事件MON 87411中作为重组植物细胞基因组的部分存在。在源于玉米植 物、种子或植物部分的样品中 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO ：2,SEQ ID NO ：25,SEQ ID NO ：4USEQ ID NO ：42,SEQ ID NO ：43,SEQ ID NO ：44,SEQ ID 勵：45、5￡〇10勵：49、5￡〇10勵：50、5￡〇10勵 ：51、或5￡〇10勵：52中的一个或多个的 鉴定能够确定所述DNA是从玉米事件MON 87411获得，并且能够诊断样品中来自玉米事件 MON 87411的DNA的存在。因此，本发明提供了包含至少一个以SEQ ID NO :1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、 SEQ ID NO ：9, SEQ ID NO ：10, SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：25, SEQ ID NO ：4U SEQ ID NO ： 42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、或SEQ ID NO :52提供的核苷酸序列的DNA分子。足以包含至少一个以SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、 SEQ ID N0：8,SEQ ID NO ：9,SEQ ID NO ： 10,SEQ ID NO ：2USEQ ID NO ：25,SEQ ID NO ：4U SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:49、SEQ ID NO: 50、 SEQ ID NO :51、或SEQ ID NO :52提供的序列的来源于转基因玉米事件MON 87411的任 何DNA片段在本发明的范围之内。此外，包含与本段落中描述的任何序列互补的序列的任 何多核苷酸在本发明的范围之内。
[0125] 本发明提供了可用作用于检测样品中来源于玉米植物的包含事件MON 87411DNA 的DNA的存在的引物或探针的示例性DNA分子。此类引物或探针对于目标核酸序列是特异 性的，因此可用于通过本文中描述的本发明方法鉴定玉米事件MON 87411核酸序列。
[0126] "引物"通常是高度纯化的分离的多核苷酸，其被设计用于涉及热扩增的特异性退 火或杂交法。可将一对引物与模板DNA诸如玉米基因组DNA的样品一起用于热扩增，诸如 聚合酶链式反应（PCR)，以产生扩增子，其中从这种反应产生的扩增子将具有对应于位于其 中引物与模板杂交的两个位点之间的模板DNA的序列的DNA序列。如本文中所用，"扩增 子"为一条或一段已使用扩增技术合成的DNA。本发明的扩增子包含以SEQ ID NO :21或 SEQ ID NO :25提供的至少一个序列。引物通常被设计来与互补目标DNA链杂交以形成引 物与目标DNA链之间的杂合体，并且引物的存在是被聚合酶识别以开始使用目标DNA链作 为模板来延伸引物（即，另外的核苷酸聚合为延长的核苷酸分子）的点。如本发明中所用， 引物对意指为了线性扩增被引物对的单个成员靶向结合的位置之间的多核苷酸片段，通常 在热扩增反应或其它常规核酸扩增法中使用两个结合双链核苷酸片段的相反链的引物。可 用于这种应用的引物对应包含第一 DNA分子和与第一 DNA分子不同的第二DNA分子，其中 两者具有充分长度的DNA序列的连续核苷酸以用作DNA引物，其当在热扩增反应中与来源 于玉米事件MON 87411的模板DNA-起使用时，产生诊断样品中玉米事件MON 87411DNA的 扩增子。用作引物的示例性DNA分子以SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、或 SEQ ID NO : 24 提供。
[0127] "探针"为与目标核酸的链互补的分离核酸。探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核 酸，而且还包括特异性结合目标DNA序列的聚酰胺和其它探针材料，并且这种结合的检测 可用于诊断、鉴别、确定、检测或确认特定样品中该目标DNA序列的存在。可将探针连接于 常规可检测标记或报道分子例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。用作探针的示例性 DNA 分子以 SEQ ID NO : 19 和 SEQ ID NO : 23 提供。
[0128] 探针和引物可与目标序列具有完全的序列一致性，虽然可通过常规方法设计与目 标序列不同的保持优先与目标序列杂交的能力的引物和探针。为使核酸分子能够用作引 物或探针，其仅需在序列上充分互补以能够在所使用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双 链结构。任何常规的核酸杂交或扩增方法可用于鉴定样品中来自玉米事件MON 87411的转 基因DNA的存在。探针和引物在长度上通常为至少约11个核苷酸、至少约18个核苷酸、至 少约24个核苷酸或至少约30个核苷酸或更多个核苷酸。此类探针和引物在严格杂交条 件下与目标DNA序列特异性杂交。常规的严格性条件由Sambrook等人，1989和由Haymes 等人在：Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC(1985)中描述。
[0129] 本领域技术人员众所周知的许多方法可用于分离和操作本发明中公开的DNA分 子或其片段，包括热扩增方法。DNA分子或其片段还可通过其它技术诸如通过利用化学方法 直接合成片段（这通常通过使用自动寡核苷酸合成仪来实施）来获得。
[0130] 因此本文中提供的DNA分子和相应的核苷酸序列尤其可用于鉴定玉米事件MON 87411，选择包含玉米事件MON 87411的植物品种或杂合体，检测样品中来源于转基因玉米 事件MON 87411的DNA的存在，和监测样品的玉米事件MON 87411或来源于包含事件MON 87411的玉米植物的植物部分的存在和/或不存在。
[0131] 本发明提供了玉米植物、后代、种子、植物细胞、植物部分（诸如花粉、胚珠、穗或 丝组织、穗须组织、根组织、茎组织和叶组织）以及商品。这些植物、后代、种子、植物细胞、 植物部分和商品包含可检测量的本发明的多核苷酸，即诸如具有以SEQ ID NO :1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID 勵：45、5￡〇10勵：49、5￡〇10勵：50、5￡〇10勵 ：51、或5￡〇10勵：52提供的至少一个序 列的多核苷酸。本发明的植物、后代、种子、植物细胞和植物部分还可包含一个或多个另外 的转基因。这种另外的转基因可以是编码赋予期望的性状（包括但不限于增强的昆虫抗 性、增加的水利用效率、增加的产量性能、增强的抗旱性、增强的种子质量、改良的营养质量 和/或增强的除草剂耐受性）的蛋白或RNA分子的任何核苷酸序列，其中相对于缺乏这种 另外的转基因的玉米植物测量期望的性状。
[0132] 本发明提供了来源于包含玉米事件MON 87411的转基因植物的玉米植物、后代、 种子、植物细胞和植物部分，诸如花粉、胚珠、穗或丝组织、穗须组织、根或茎组织以及叶。已 根据布达佩斯条约在美国典型培养物保藏中心（ATCC)保藏了包含事件MON 87411的玉米 种子的代表性样品。ATCC保藏机构已将专利保藏号PTA-12669指派给包含事件MON 88741 的种子。
[0133] 本发明提供了包含存在于其基因组中的具有至少一个选自SEQ ID NO :1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、和 SEQ ID NO :52 的序列的 DNA 分 子的微生物。这种微生物的实例为转基因植物细胞。微生物诸如本发明的植物细胞在许多 工业应用中是有用的，所述工业应用包括但不限于：（i)用作用于科学调查或工业研究的 研究工具；（ii)用于产生可用于随后的科学研究或用作工业产品的内源或重组碳水化合 物、脂质、核酸或蛋白产物或小分子的培养；和（iii)与现代植物组织培养技术一起使用以 产生随后可用于农业研究或生产的转基因植物或植物组织培养物。微生物例如转基因植物 细胞的产生和使用利用现代微生物学技术和人干预来产生人造的独特的微生物。在该方法 中，将重组DNA插入植物细胞的基因组以产生与天然存在的植物细胞分离且独特的转基因 植物细胞。然后该转基因植物细胞可使用现代微生物技术进行培养（与细菌和酵母细胞非 常相似），并且可以以未分化的单细胞状态存在。转基因植物细胞的新的或改变的遗传组 成和表型为通过将异源DNA整合入细胞的基因组产生的技术效果。本发明的微生物诸如转 基因植物细胞包括（i)通过将重组DNA整合入细胞的基因组，随后使用该细胞衍生具有相 同异源DNA的另外的细胞来产生转基因细胞的方法；（ii)使用现代微生物技术培养包含重 组DNA的细胞的方法；（iii)从培养细胞产生并且纯化内源或重组碳水化合物、脂质、核酸 或蛋白质产物的方法；和（iv)使用现代植物组织培养技术利用转基因植物细胞产生转基 因植物或转基因植物组织培养物的方法。
[0134] 本发明的植物可以将事件DNA(包括转基因）传递给后代。当在本文中使用时，"后 代"包括包含来源于祖先植物的事件DNA和/或包含具有选自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :25 ;SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、 SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、和 SEQ ID NO :52 的至少一个序列的 DNA 分 子的任何植物、种子、植物细胞和/或可再生植物部分。植物、后代和种子对于转基因可以 是纯合的或杂合的。后代可从由包含玉米事件MON 87411的植物产生的种子和/或从由 利用包含玉米事件MON 87411的植物的花粉授精的植物产生的种子生长而来。
[0135] 可将后代植物自花受粉（也称为"自交"）以产生植物的纯育品系，即对于转基因 是纯合的植物。适当的后代的自交可产生对于两个添加的外源基因是纯合的植物。
[0136] 或者，可将后代植物与另一种不相关的植物异型杂交例如育种，以产生品种或杂 合体种子或植物。另一种不相关的植物可以为转基因或非转基因的。因此本发明的品种 或杂合体种子或植物可通过如下步骤来衍生：将缺乏玉米事件MON 87411的特异性和独 特的DNA的第一亲本与包含玉米事件MON 87411的第二亲本杂交，从而形成包含玉米事件 M0N87411的特异性和独特的DNA的杂合体。每一个亲本可以为杂合体或近交系（inbred)/ 变种，只要杂交或育种导致本发明的植物或种子，即具有至少一个包含玉米事件MON 87411 的 DNA 和 / 或具有至少一个选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO : 4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、 SEQ ID NO ：12, SEQ ID N0：14,SEQ ID N0：16,SEQ ID N0：2USEQ ID NO ： 25 ； SEQ ID NO： 41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、和SEQ ID NO :52的序列的DNA分子的等位基因的种子。因此可将 两种不同的转基因植物杂交以产生包含两个独立地分离的额外的外源基因的杂合体后代。 例如，可将包含玉米根虫侵染抗性和草甘膦耐受性的事件MON 87411玉米与不同的转基因 玉米植物杂交以产生具有两个转基因亲本的特征的杂合体或近交植物。该方法的一个实例 为包含玉米根虫侵染抗性和草甘膦耐受性的事件MON 87411玉米与具有一个或多个另外 的性状（诸如除草剂耐受性和/或昆虫控制）杂交，从而导致抵抗玉米根虫侵染且对草甘 膦耐受并且具有至少一种或多种另外性状的后代植物或种子。还预期对亲本植物的回交和 与非转基因植物的异型杂交，同样地预期无性繁殖。通常用于不同性状和作物的其它育种 方法的描述可见于几篇参考文献之一，例如，Fehr,参见Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J.编辑，American Society of Agronomy, Madison WI (1987)中。
[0137] 本发明提供了来源于包含事件MON 87411的玉米植物的植物部分。如本文中所 用，"植物部分"是指由从包含事件MON 87411的玉米植物衍生的材料组成的植物的任何部 分。植物部分包括但不限于花粉、胚珠、穗或丝、穗须、根或茎组织、纤维及叶。植物部分可 以是能活的、不能存活的、可再生的和/或非可再生的。
[0138] 本发明提供了从包含事件MON 87411的玉米植物衍生且包含可检测量的对于事 件MON 87411特异性的核酸的商品。如本文中所用，"商品"是指包含从包含玉米事件MON 87411的玉米植物、完整或经加工的玉米种子、一种或多种细胞和/或植物部分衍生的材料 的任何组合物或产品。商品可向消费者出售并且可以是能活的或不能存活的。不能存活 的商品包括但不限于不能存活的玉米种子；经加工的玉米种子、玉米种子部分和玉米植物 部分；经加工用于饲料或食物、油、膳食、面粉、薄片、糠、生物质及燃料产品的玉米种子和玉 米植物部分。能活的商品包括但不限于玉米种子、玉米植物和玉米植物细胞。因此，包含 事件MON 87411的玉米植物可用于制造通常从玉米获得的任何商品。从包含玉米事件MON 8741IDNA (其包含至少可检测量的一种或多种特异性且独特的DNA分子）的玉米植物衍生 的任何此类商品，其存在可测定玉米事件MON 87411，并且特别地可包含可检测量的包含 DNA分子的多核苷酸，所述DNA分子具有至少一个选自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :25 ;SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、和 SEQ ID NO :52 的序列。可使用检测核苷酸分 子的任何标准方法，包括本文中公开的检测方法。如果在商品中存在任何可检测量的具有 至少一个选自 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :25 ;SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、 SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID NO: 51、和SEQ ID NO :52的诊断性序列的DNA分子，那么商品在本发明的范围内。
[0139] 因此本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分（诸如花粉、胚珠、穗或丝、穗 须、根或茎组织及叶）以及商品尤其可用于生长植物以产生用于农业目的的包含玉米事 件MON 87411的种子和/或植物部分、产生用于植物育种和研究目的的包含玉米事件MON 87411的后代，可与用于工业和研究应用的微生物学技术一起使用和向消费者出售。
[0140] 本发明提供了用于控制杂草的方法和使用草甘膦除草剂和玉米事件MON 87411 生产植物的方法。提供了一种用于控制田间杂草的方法，其由下述步骤构成：将包含玉米事 件MON 87411的品种或杂合植物种植在田间，并且向所述田间施用除草有效剂量的草甘膦 以实现控制田间杂草而不损伤包含MON 87411的植物的目的。草甘膦除草剂的这种施用可 以在发芽前，即在包含MON 87411的种子种植之后和在包含MON 87411的植物发芽之前的 任何时间，或者在发芽后，即在包含MON 87411的植物发芽之后的任何时间。还提供了用于 控制田间杂草的另一种方法，其由下述步骤构成：施用有效剂量的草甘膦除草剂以控制田 间杂草，然后将包含事件MON 87411的玉米植物种植在田间。草甘膦除草剂的这种施用将 在种植前，即在包含MON 87411的种子种植之前，并且可以在种植之前的任何时间进行，包 括但不限于种植之前约14天至种植之前约1天。本发明还提供了用于生产基本上不含杂 草种子的玉米种子的方法，所述方法包括将包含MON 87411的草甘膦耐受性玉米植物的种 子种植在田间，向所述田间施加足以杀死杂草的发芽后有效剂量的草甘膦除草剂，以及从 所述田间收获种子。在田间使用的除草有效剂量的草甘膦应由在生长季内约〇. 125磅每英 亩至约6. 4磅每英亩的草甘膦的范围构成。在一个实施方案中，在生长季中施用总共约1. 5 磅每英亩的草甘膦。可以在生长季内采用草甘膦的多次施用，例如两次施用（诸如种植前 施用和发芽后施用，或发芽前施用和发芽后施用）或三次施用（诸如种植前施用、发芽前 施用和发芽后施用）。
[0141] 提供了用于生产包含对于本发明的事件MON 87411来说特异性的且独特的DNA序 列的昆虫和除草剂耐受的玉米植物的方法。在这些方法中使用的转基因植物对于所述转 基因来说可以是纯合的或杂合的。通过这些方法产生的后代植物可以是变种或杂合植物， 可以从由包含玉米事件MON 87411的植物产生的种子和/或从由来自包含玉米事件MON 87411的植物的花粉授粉的植物所产生的种子生长，并且对于所述转基因来说可以是纯合 的或杂合的。后代植物随后可以自花授粉以产生植物的纯育种系，即对转基因纯合的植物， 或者可以异交，例如与另一种无关植物育种，以产生变种或杂合种子或植物。
[0142] 提供了检测样品中来源于包含玉米事件MON 87411的玉米细胞、组织、种子或植 物的DNA的存在的方法。一种方法由下述步骤构成：（i)从至少一个玉米细胞、组织、种子 或植物提取DNA样品，（ii)将所述DNA样品与能够在适合于DNA测序的条件下产生对于事 件MON 87411DNA特异性的DNA序列的至少一个引物接触，（iii)进行DNA测序反应，和然 后（iv)证实所述核苷酸序列包含对于事件MON 87411特异性的核苷酸序列，或其中包含的 构建体，诸如选自 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 12、 SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、和SEQ ID NO :52的一个核苷酸序列。另一种方法由下述步骤构成：（i)从至少一个 玉米细胞、组织、种子或植物提取DNA样品，（ii)将所述DNA样品与能够在适合于DNA扩增 的条件下产生来自事件MON 87411DNA的扩增子的引物对接触，（iii)进行DNA扩增反应， 和然后（iv)检测所述扩增子分子和/或证实所述扩增子的核苷酸序列包含对于事件MON 87411特异性的核苷酸序列，诸如选自SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :25的一个核苷酸序列。 扩增子应是对于事件MON 87411特异性的扩增子，诸如包含SEQ ID NO :21或SEQ ID NO: 25的扩增子。扩增子中对于事件MON 87411特异性的核苷酸序列的检测对于样品中玉米事 件MON 87411特异性DNA的存在是确定性的和/或诊断性的。能够在适合于DNA扩增的条 件下产生来自事件MON 87411DNA的扩增子的引物对的实例以SEQ ID NO :18、SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO :20、和SEQ ID NO :22提供。其它引物对可以由本领域技术人员容易地设计， 并且将产生包含SEQ ID NO :21或SEQ ID NO :25的扩增子，其中此类引物对包含侧接插入 物的基因组区域内的至少一个引物和插入物内的第二引物。检测样品中来源于包含玉米事 件MON 87411的玉米细胞、组织、种子或植物的DNA的存在的另一种方法由下述步骤构成： (i)从至少一个玉米细胞、组织、种子或植物提取DNA样品，（ii)将所述DNA样品与对于事 件MON 87411DNA特异性的DNA探针接触，（iii)允许所述探针和DNA样品在严格杂交条件 下杂交，和然后（iv)检测所述探针与目标DNA样品之间的杂交。对于事件MON 87411DNA 特异性的DNA探针的序列的实例以SEQ ID NO :19或SEQ ID NO :23提供。其它探针可以由 本领域技术人员容易地设计，并且将包含侧接插入物的基因组DNA的至少一个片段和插入 DNA的至少一个片段，诸如但不限于以下提供的序列：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 21、和SEO ID NO :25。检测到探针与DNA样品的杂交对样品中玉米事件MON 87411特异性 DNA的存在是诊断性的。或者，不存在杂交对样品中玉米事件MON 87411特异性DNA的不存 在是诊断性的。
[0143] 提供了 DNA检测试剂盒，其可用于鉴定样品中的玉米事件M0N87411DNA，并且也可 以应用于育种包含适当事件DNA的玉米植物的方法。这种试剂盒含有包含SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、 5￡〇10吣：45、5￡〇10吣：49、5￡〇10吣：50、5￡〇10吣 ：51、和5￡〇10吣：52的片段的 DNA引物和/或探针。这种试剂盒的一个实例包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO ：4, SEQ ID NO ：5, SEQ ID NO ：6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO ：9, SEQ ID NO :10、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、和SEQ ID NO :52的足够长度的连续核苷酸的至少 一个DNA分子，以起到可用于检测样品中来源于包含事件MON 87411的转基因玉米植物的 DNA的存在和/或不存在的DNA探针的作用。所述来源于包含事件MON 87411的转基因玉 米植物的 DNA 包含具有选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO ：12, SEQ ID NO ：14, SEQ ID N0：16,SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：25, SEQ ID NO ：4U SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、 SEQ ID NO :51、和SEQ ID NO :52的至少一个序列的DNA分子。提供了足以用作DNA探针的 DNA分子，其可用于确定、检测或诊断样品中玉米事件MON 874IlDNA的存在和/或不存在， 并以SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :23提供。其它探针可以由本领域技术人员容易地设计， 并且应包含足够数量的连续核酸，包括SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、和 SEQ ID NO :52 的至少 15 个、至少 16 个、至少 17 个、至少 18 个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少 26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至 少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个连续核苷酸 和对于玉米事件MON 87411DNA足够独特，以便鉴定来源于所述事件的DNA。另一种类型的 试剂盒包含可用于产生扩增子的引物对，所述扩增子可用于检测样品中来源于转基因玉米 事件MON 87411的DNA的存在和/或不存在。这种试剂盒将利用包含下列步骤的方法：将 目标DNA样品与本文中所描述的引物对接触，然后进行足以产生包含具有选自SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO :25的至少一个序列的DNA分子的扩增子的核酸扩增反应，然后检测所述 扩增子的存在和/或不存在。这种方法还可以包括对扩增子或其片段进行测序，其对于目 标DNA样品中玉米事件MON 87411特异性DNA的存在是确定性的，即诊断目标DNA样品中 玉米事件MON 87411特异性DNA的存在。其它引物对可以由本领域技术人员容易地设计， 并且应包含足够数量的连续核酸，包括所提供的序列但不限于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO ：3, SEQ ID NO ：5, SEQ ID NO ：6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO ：9, or SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、和SEQ ID NO :52的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少 20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至 少28个、至少29个、至少30个连续核苷酸和对玉米事件MON 8741IDNA足够独特以便鉴定 来源于所述事件的DNA。
[0144] 本发明的试剂盒和检测方法尤其可用于鉴定玉米事件MON 87411，选择包含玉米 事件MON 87411的植物品种或杂合体，检测样品中来源于包含事件MON 87411的转基因玉 米植物的DNA的存在，以及监测样品中包含事件MON 87411的玉米植物或来源于包含事件 MON 87411的玉米植物的植物部分的存在和/或不存在。
[0145] 可通过使用来源于本文中提供的序列的引物扩增此类来自所述事件的序列，然后 进行扩增子或克隆的DNA的标准DNA测序来验证（和必要时校正）来自玉米事件MON 87411 的异源DNA插入物的序列、连接序列或侧翼序列。
[0146] 包括下列实施例来举例说明本发明的某些优选实施方案的实例。本领域技术人员 应当理解，下列实施例中公开的技术代表本发明人已发现非常适合于本发明的实施，从而 被认为构成用于其实施的优选模式的实例的方法。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员 应当理解可在不背离本发明的精神和范围的情况下在公开的特定实施方案中进行许多改 变，并且获得类似或相似的结果。
[0147] 保藏信息
[0148] 包含事件MON 87411的玉米种子的代表性样品的保藏已经根据布达佩斯条约在 美国典型培养物保藏中心（ATCC)于2012年3月14日进行，ATCC的地址为10801University Boulevard，Manassas，Virginia USA，邮编 20110,并且指定 ATCC 登录号 PTA-12669。在本 申请未定期间，专利和商标局局长和要求后由局长授权确定的人员将可获得该保藏物。授 予专利之后，可对公众获得的所有限制将不可逆地予以撤消。将保藏物在最近的请求后在 贮藏所维持30年或5年的时期，或维持专利的有效期（以更长的时间为准），并且在该期间 必要时可替换保藏物。
【具体实施方式】
[0149] 实施例1
[0150] 本实施例描述了命名为417的构建体的设计和选择以及不同DNA构建体的工程改 造和评估。表1通过测试标准和结果将这些DNA构建体列为表格。
[0151] DNA构建体被工程改造以便在玉米中表达靶向西方玉米根虫（WCR)的基于RNA的 植物引入保护剂（PIP)。针对WCR的不同目标基因（第1组）、RNA的不同长度（第2组）， 有或没有中性RNA载体（第2组）、不同二级结构（第4组）、和Dv_Snf7o的不同目标片 段（第2和3组）测试RNA转录物的变化。还测试多个转基因上的变化，例如，RNA转录物 +WCR活性蛋白（第3和5组），和靶向2个WCR目标的两种RNA转录物（第1和4组）。还 测试使用的表达盒和元件的数量和配置的变化（所有组）。
[0152] 表1.将四十五种DNA构建体稳定地转化至玉米植物中。评估每种DNA构建体来 自多个转化事件的后代植物。
[0153]
【权利要求】
1. 在包含玉米DNA的样品中可检测出来的重组DNA分子，其中所述分子的核苷酸序列 为： (a) 选自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:21、和 SEQ ID N0:25 ;或 (b) 与（a)完全互补的核苷酸序列， 其中此类DNA分子的存在诊断出所述样品中的玉米事件M0N87411 DNA。
2. 在包含玉米DNA的样品中可检测出来的重组DNA分子，其中所述分子的核苷酸序列 是与SEQ ID NO: 1或其完全互补序列具有至少99%-致性的核苷酸序列，其中此类DNA分 子的存在诊断出所述样品中的玉米事件M0N 87411DNA。
3. 在包含玉米DNA的样品中可检测出来的重组DNA分子，其中所述分子的核苷酸序列 为： (a) 选自 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:41、SEQ ID N0:42、 SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、 和 SEQ ID NO :52 ; (b) 与（a)完全互补的核苷酸序列， 其中此类DNA分子的存在诊断出所述样品中玉米事件MON 87411DNA内包含的构建体。
4. 权利要求1、权利要求2或权利要求3的重组DNA分子，其中所述DNA分子衍生 自玉米事件M0N 87411、包含玉米事件M0N 87411的种子的代表性样品，其已以登记号 PTA-12669 保藏于 ATCC。
5. 权利要求1，权利要求2或权利要求3的重组DNA分子，其中所述样品包含玉米植物、 玉米植物细胞、玉米种子、后代玉米植物、玉米植物部分或玉米商品。 6. DNA分子，其包含长度足以作为在严格杂交条件下与样品中的玉米事件M0N 87411DNA或其中包含的构建体杂交的DNA探针的多核苷酸片段，其中所述探针在所述条件 下与诊断出SEQ ID NO: 1所示的玉米事件M0N 87411或其中包含的构建体的一个或多个连 接片段特异性杂交，并且其中检测所述DNA探针在所述杂交条件下的杂交诊断出所述样品 中的玉米事件MON 87411DNA或其中包含的构建体。
7. -对DNA分子，其包含第一 DNA分子和与所述第一 DNA分子不同的第二DNA分子，其 中所述第一和第二DNA分子各自包含SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的足够长的连续核苷酸的多核苷酸片段，当与包含玉米事件MON 87411模板DNA的 样品一起用于扩增反应中时，所述多核苷酸片段长度足够长以作为DNA引物以产生诊断出 所述样品中所述玉米事件MON 87411DNA的扩增子，其中所述扩增子包含选自SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:21、和 SEQ ID N0:25 的核苷酸序列。
8. -对DNA分子，其包含第一 DNA分子和与所述第一 DNA分子不同的第二DNA分子，其 中所述第一和第二DNA分子各自包含SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的足够长的连续核苷酸的多核苷酸片段，当与含有玉米事件MON 87411模板DNA的 样品一起用于扩增反应中时，所述多核苷酸片段长度足够长以作为DNA引物以产生诊断出 所述样品中包含所述构建体的DNA的扩增子，其中所述扩增子包含选自SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:41、SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、和 SEQ ID N0:52 的核苷酸序列。
9. 检测样品中诊断出玉米事件MON 87411的DNA片段的存在的方法，所述方法包括： (a) 将所述样品与权利要求6的DNA分子接触； (b) 使所述样品和所述DNA分子经历严格杂交条件；以及 (c) 检测所述DNA分子与所述诊断出玉米事件M0N 87411的DNA片段的杂交， 其中所述检测步骤诊断出所述样品中所述玉米事件M0N 87411分子的存在。
10. 检测样品中作为玉米事件M0N 87411的诊断特征的DNA片段的存在的方法，所述方 法包括： (a) 将所述样品与权利要求7的DNA分子对接触； (b) 进行足以产生DNA扩增子的扩增反应；以及 (c) 检测所述反应中所述DNA扩增子的存在， 其中所述DNA扩增子包含选自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID N0:21和SEQ ID N0:25的核苷酸序列，且其中所述检测所述扩增子的存在诊断出所述样 品中玉米事件MON 87411DNA的存在。
11. 检测样品中作为玉米事件M0N 87411内包含的构建体的诊断特征的DNA片段的存 在的方法，所述方法包括： (a) 将所述样品与权利要求8的DNA分子对接触； (b) 进行足以产生DNA扩增子的扩增反应；以及 (c) 检测所述反应中所述DNA扩增子的存在， 其中所述 DNA 扩增子包含选自 SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:41、SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、和SEQ ID N0:52的核苷酸序列，且其中所述检测所述扩增子的存在 诊断出所述样品中玉米事件MON 87311DNA内包含的所述构建体的存在。
12. 玉米植物或其玉米植物部分，其包含含有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的重组多核苷 酸分子。
13. 权利要求12的玉米植物或其玉米植物部分，其中所述玉米植物或其玉米植物部分 对草甘膦除草剂的处理具有耐受性。
14. 权利要求12的玉米植物或其玉米植物部分，其中所述玉米植物或玉米植物部分当 在根萤叶甲属昆虫膳食中提供时是杀昆虫的。
15. 权利要求14的玉米植物或其玉米植物部分，其中所述根萤叶甲属昆虫选自玉 米根萤叶甲（Diabrotica virgifera virgifera)(西方玉米根虫，WCR)、巴氏根萤叶甲 (Diabrotica barberi)(北方玉米根虫，NCR)、玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera zeae)(墨西哥玉米根虫，MCR)、带斑黄瓜叶甲（Diabrotica balteata)(巴西玉米根虫， BZR)、带斑黄瓜叶甲（巴西玉米根虫复合群，BCR，由叶甲蝽（Diabrotica viridula)和叶 甲桐（Diabrotica speciosa)组成）和黄瓜十一星叶甲（Diabrotica undecimpunctata howardii)(南部玉米根虫，SCR)。
16. 权利要求12的玉米植物或其玉米植物部分，其中所述玉米植物被进一步定义为包 含所述事件MON 87411的玉米植物的任一代的后代植物。
17. 权利要求16的玉米植物或其玉米植物部分，其中所述玉米植物是从至少一个包含 事件M0N 87411的亲本育种的杂合体。
18. 权利要求12的玉米植物或其玉米植物部分，其中所述玉米植物进一步包含选自 DAS-59122-7 ；M0N 89034 ；M0N 88017 ；MIR604 ；M0N 87427 ；TC1507 ；5307 ；DAS-〇6275-8 ； BT176 ;BT11 ;和MIR162的转基因事件。
19. 玉米种子，其包含含有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的重组多核苷酸分子。
20. 玉米商品，其包含可检测量的对于事件M0N 87411独特的DNA分子或其中包含的构 建体，其中所述分子包含权利要求1、权利要求2或权利要求3的重组DNA分子。
21. 权利要求20的玉米商品，进一步定义为选自以下的商品：完整或经加工的玉米种 子、包含玉米的动物饲料、玉米油、玉米餐、玉米粉、玉米片、玉米糠、玉米生物量和使用玉米 和玉米部分产生的燃料产品。
22. 玉米植物或玉米植物部分，其包含当在DNA扩增方法中测试时作为模板的DNA，其 中使用所述模板进行所述DNA扩增方法产生诊断出事件MON 87411DNA或其中包含的构建 体的存在的扩增子。
23. 产生对草甘膦除草剂耐受的玉米植物的方法，其包括在所述玉米植物的基因组中 提供玉米事件M0N 87411，其中所述玉米植物是对于事件M0N 87411纯合的近交系玉米植 物或者是至少一种包含事件M0N 87411的亲本玉米植物的F1杂合后代。
24. 产生玉米商品的方法，其包括： (a) 获得权利要求12的玉米植物或其玉米植物部分；和 (b) 从重组玉米植物或其玉米植物部分产生玉米商品。
25. 用于控制田间杂草的生长的方法，其包括使包含事件M0N87411的玉米植物在田间 生长，和用有效量的草甘膦处理所述田间，以控制杂草的生长。
26. 权利要求25的方法，其中所述有效量的草甘膦为约0. 125磅至约6. 4磅每英亩。
27. 无生命的植物材料，其包含可检测量的权利要求1、权利要求2或权利要求3的重 组DNA分子。
28. 微生物，其包含可检测量的权利要求1、权利要求2或权利要求3的重组DNA分子。
29. 权利要求28的微生物，其中所述微生物选自细菌和植物细胞。 30. DNA分子，其包含： (a) SEQ ID NO: 12所示的重组多核苷酸；和 (b) SEQ ID NO: 14所示的重组多核苷酸；和 (c) SEQ ID NO: 16所示的重组多核苷酸， 其中所述重组多核苷酸序列通过磷酸二酯连接在一起。
31. 权利要求30的DNA分子，其定义为包含SEQ ID NO:4。
32. 保护玉米植物的田间的方法，其包括栽培由约50至约100%的包含玉米事件MON 87411的玉米植物构成的玉米植物的田间。
【文档编号】C12N15/82GK104427861SQ201380033654
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年5月8日 优先权日:2012年5月8日
【发明者】W·C·伯恩斯, C·A·蔡, C·L·克洛宁格, 邓明奇, S·弗拉辛斯基, 吴坤生 申请人:孟山都技术公司