赤桉木虱防治剂的制作方法

赤桉木虱防治剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及昆虫物种中RNA介导基因沉默的领域。本发明部分地基于发明人的桉树入侵物种Gb害虫赤桉木虱(Glycaspis brimblecombei)的基因测序。在某些方面，本发明提供Gb核酸、其衍生物，以及此类核酸和衍生物作为Gb防治剂的用途。
【专利说明】赤桉木虱防治剂
[0001] 序列表
[0002] 本申请包含以ASCII格式经电子存档提交的序列表，在此将其全部内容引入以作 参考。将2013年4月18日制作的所述ASCII副本命名为30407-0004W01_SL.txt，其大小 为50, 196字节。

【技术领域】
[0003] 本发明涉及昆虫物种中双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默领域。

【背景技术】
[0004] 赤按木風（redgumlerppsyllid,Glycaspisbrimblecombei,Gb)为仅发现于按 树上的吸汁害虫（sap-suckingpest)(半翅目（OrderHemiptera):木虱科（Psyllidae))。 Gb侵扰已发生于许多国家，并对非洲、南北美洲、印度、澳大利亚以及地中海地区的自然种 群和商业桉树种植构成威胁。桉树物种在它们对受到Gb攻击的敏感性方面存在不同。赤 桉（E.camaldulensis)和细叶桉（E.tereticornis)高度易感，而巨桉（E.grandis)更加耐 受。Gb为迅速传播的侵略性害虫。Gb侵扰的症状包括叶片损失和主根（leadshoots)的 干枯。严重的侵扰可引起完全脱叶和树木死亡。
[0005] 雌性Gb每个生命周期产下45-700个之间的卵。卵在10至20天内孵化，并且出 现的蛹用它们的口针（stylet) (口器）刺入桉树组织中，在木质部和韧皮部上进食。随着 蛹以来自叶片的植物糖类为食，它们分泌蜜露，借此它们在其自身周围构建了蜡状保护盖 ("昆虫蜜（lerp)"）。昆虫蜜带白色的，且形状为圆锥形，并且在发育期间庇护昆虫，直至 它们达到成虫期。在澳大利亚，典型地每年有2至4个Gb世代。
[0006] 对防治桉树的Gb感染所做的努力已包括尝试将天然抗性植物与天然捕食者隔 离。然而，这种努力已遇到限制或不成功。
[0007] Gb的化学杀虫剂防治昂贵且环境不友好。化学杀虫剂可能不利于环境，不是选择 性的，且可能对非目标作物和动物群有害。化学杀虫剂存留于环境中并通常代谢缓慢，或根 本不代谢。化学杀虫剂在食物链中，特别是在较高的捕食者物种内积累，它们可在较高的捕 食者物种中充当诱变剂和/或致癌物以引起不可逆且有害的遗传修饰。此外，由于重复使 用相同的杀虫剂或具有相同作用模式的杀虫剂可使作物害虫发展出对化学杀虫剂的抗性。
[0008] RNA干扰或"RNAi"为由与要下调的靶基因区序列互补的双链RNA(dsRNA)引发的 序列特异性下调基因表达的过程（还称作"基因沉默"或"RNA介导的基因沉默"）。多细胞 生物中借助RNA干扰（RNAi)的靶基因下调已成为行之有效的技术。美国专利申请公布US 2009/0285784A1和US2009/0298787涉及dsRNA作为昆虫防治剂，并在此将其各自的全部 内容引入于此以作参考。美国专利6, 506, 559号、美国专利申请公布2003/00150017A1、国 际公布WO00/01846、W0 01/37654、W0 2005/019408、W0 2005/049841、W0 05/047300 涉及 RNAi保护植物抵抗昆虫的用途。2012年3月30日提交的国际申请PCT/US12/31423涉及 青铜蝽（GallWasp)家族中桉树害虫的RNA-介导的防治。在此将前述专利和公布的申请 的全部内容分别引入于此以作参考。


【发明内容】

[0009] 本发明部分地基于发明人的桉树的赤桉木虱入侵物种，赤桉木虱（Glycaspis brimblecombei,Gb)的基因测序。在某些方面，本发明由此提供Gb核酸、其衍生物和此类核 酸和衍生物作为Gb防治剂的用途。
[0010] 在某些方面，本发明提供分离的核酸，所述核酸在高严格杂交条件下与SEQID NO: 1-56和71-80中示出的序列及其互补序列选择性杂交。
[0011] 在某些方面，本发明提供分离的核酸，所述核酸与SEQIDNO: 1-56和71-80中示 出的序列及其互补序列的同一性为90-99. 99%。
[0012] 在某些方面，本发明提供分离的核酸，所述核酸包括SEQIDNO: 1-56和71-80中 示出的序列及其互补序列的至少17个邻接核苷酸。
[0013] 在某些方面，本发明提供来自Gb的核酸，所述核酸包括与所述核酸的蜜蜂直向同 源物（ortholog)的同一,性为约80%以下的上述所示的核酸。
[0014] 在某些方面，本发明提供包括可操作地连接至表达控制序列（expression controlsequence)的来自Gb的核酸或此类序列的反向互补体的载体。
[0015] 在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有包括可操作地连接至表达控制序列 的来自Gb的核酸或此类序列的反向互补体的载体的宿主细胞。
[0016] 在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有包括可操作地连接至表达控制序列 的来自Gb的核酸的载体的植物组织，例如叶组织和种子。
[0017] 在某些方面，本发明提供抑制Gb核酸表达的分离的小抑制性核糖核酸（siRNA)分 子。
[0018] 在某些方面，本发明提供分离的双链核糖核酸（dsRNA)分子，所述分子包括与SEQ IDNO: 1-56和71-80中的至少17个邻接核苷酸基本上同一的第一链核苷酸和与第一链核 苷酸基本上互补的第二链核苷酸。
[0019] 在某些方面，本发明提供双链核糖核酸（dsRNA)分子，其与来自Gb的mRNA(Gb的 靶向dsRNA)高度同源（大于80%)，包括与dsRNA的蜜蜂直向同源物的同一性为约80%以 下的上述所示的dsRNA分子。
[0020] 在某些方面，本发明提供包括可操作地连接至作为来自Gb的dsRNA的一条链或两 条链的模板的核苷酸序列的表达控制序列的载体。
[0021] 在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有载体的宿主细胞，所述载体包括可 操作地连接至作为来自Gb的dsRNA的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达控制序 列。
[0022] 在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有载体的植物组织，所述载体包括可 操作地连接至作为来自Gb的dsRNA的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达控制序 列。
[0023] 在某些方面，本发明提供抑制Gb的必需基因的表达的分离的小抑制性核糖核酸 (siRNA)分子。
[0024] 在某些方面，本发明提供通过在植物中或者在植物的繁殖或生殖材料中表达Gb 的dsRNA来生产抗害虫植物的方法。
[0025] 在某些方面，本发明提供通过在桉树中或者在桉树的繁殖或生殖材料中表达Gb 的RNA来生产抗害虫桉树的方法。
[0026] 在某些方面，本发明提供通过在桉树中或者在桉树的繁殖或生殖材料中表达Gb 的靶向dsRNA来生产抗Gb感染和/或侵扰的桉树的方法。
[0027] 在某些方面，本发明提供抗植物病原害虫的植物的生产方法，所述方法用表达 dsRNA的重组DNA构建体或构建体的组合来转化植物细胞；由转化的植物细胞再生植物；和 在适于所述重组DNA构建体表达的条件下使转化的植物细胞生长。
[0028] 本发明的一个或多个实施方案的细节将于下述附图和说明书中示出。从说明书和 附图以及从权利要求来看，本发明的其他特征、目的和优势将显而易见。

【专利附图】

【附图说明】
[0029] 图1示意性描述了某些根据本发明的非限制性核酸。（A)使用来自三个Gb基 因的序列构建沉默构建体的示意图。转基因Pl(启动子1)至T1(终止序列1)编码发夹 RNA(hpRNA)用于沉默Gb，其通过将来自三个不同Gb基因（Gbl、Gb2和Gb3)的每个100bp融 合，通过合成所得序列为反向重复，并将环序列插入相应的正义和反向重复序列之间来构 建。转基因P2(启动子2)至T2(终止序列2)编码具有来自三个Gb基因的相应融合100bp 序列的mRNA。由转基因P2至T2转录的mRNA为沉默信号胞质增强用模板。（B)通过转基因 P1至T1的转录产生的hpRNA分子的示意图。（C)通过转基因P2至T2的转录产生的mRNA 的示意图。
[0030] 图2示意性描述了某些根据本发明的非限制性核酸。（A)根据图1所示的总体 方案由来自三个Gb基因的序列构建的沉默构建体#1的示意图。（B)通过转基因P1至T1 的转录产生的hpRNA分子的示意图。（C)通过转基因P2至T2的转录产生的mRNA的示 意图。定义：Pl_CaMV35S启动子（SEQIDN0:57) ;P2-sgFMV启动子（SEQIDN0:58); Tl-AtActin7Terminator(SEQIDN0:59) ;T2-Nos终止子（SEQIDN0:60) ;Gbl2-SEQID N0:13;Gbl3-SEQIDN0:15;Gb29-SEQIDN0:27;L-环序列位点（SEQIDN0:61)。
[0031] 图3示意性描述某些根据本发明的非限制性核酸。（A)根据图1所示的总体方案 由来自三个Gb基因的序列构建的沉默构建体#2的示意图。（B)通过转基因P1至T1的转 录产生的hpRNA分子的示意图。（C)通过转基因P2至T2的转录产生的mRNA的示意图。定 义：Pl-CaMV35S启动子（SEQIDN0:57) ;P2-sgFMV启动子（SEQIDN0:58) ;Tl-AtActin7 终止子（SEQIDN0:59) ;T2-Nos终止子（SEQIDN0:60) ;Gb31-SEQIDN0:32;Gb35-SEQ IDNO: 38 ;Gb56-SEQIDNO: 56 ;L-环序列位点（SEQIDNO:61)。
[0032] 图4示意性描述了某些根据本发明的非限制性核酸。（A)根据图1所示的总体方 案由来自三个Gb基因的序列构建的沉默构建体#3示意图。（B)通过转基因P1至T1的转 录产生的hpRNA分子的示意图。（C)通过转基因P2至T2的转录产生的mRNA的示意图。定 义：Pl-CaMV35S启动子（SEQIDN0:57) ;P2-sgFMV启动子（SEQIDN0:58) ;Tl-AtActin7 终止子（SEQIDN0:59) ;T2-Nos终止子（SEQIDN0:60) ;Gb41-SEQIDN0:44;Gb53-SEQ IDNO: 50 ;Gb54-SEQIDNO: 52 ;L-环序列位点（SEQIDNO:61)。
[0033] 图5示意性描述了某些根据本发明的非限制性核酸。（A)使用来自单一Gb基因的 序列构建的沉默构建体的示意图。转基因P1至T1编码发夹RNA(hpRNA)用于沉默Gb，其由lOObpGb基因通过合成该序列为反向重复并将环序列插入相应的正义和反向重复序列之间 来构建。转基因P2至T2编码具有来自Gb基因的lOObp序列的mRNA。由转基因P2至T2 转录的mRNA为沉默信号胞质增强用模板。（B)通过转基因P1至T1的转录产生的hpRNA分 子的示意图。（C)通过转基因P2至T2的转录产生的mRNA的示意图。
[0034] 图6示意性描述了某些根据本发明的非限制性核酸。（A)使用来自两种Gb基因的 序列构建的沉默构建体的示意图。转基因P1至T1编码发夹RNA(hpRNA)用于沉默Gb，其由 来自两种不同Gb基因的每个100bp，通过合成所得序列为反向重复，并将环序列插入相应 的正义和反向重复序列之间来构建。转基因P2至T2编码具有相应的来自Gb基因的融合 的lOObp序列的mRNA。由转基因P2至T2转录的mRNA为沉默信号胞质增强用模板。（B) 通过转基因P1至T1的转录产生的hpRNA分子的示意图。（C)通过转基因P2至T2的转录 产生的mRNA的示意图。
[0035] 各图中相似的参考符号表示相似的元件。

【具体实施方式】
[0036] 本发明人已进行了天然桉树害虫Gb青铜蝽（Thaumastocorisperegrinus,Tp)的 转录组测序，并发掘各自的转录组来鉴定对应于GbmRNA的Gb基因的开放阅读框。GbRNA 的鉴定允许设计介导Gb基因下调（沉默）的siRNA和dsRNA。因此，将此类siRNA和dsRNA 用作生物防治剂来杀灭或抑制Gb的进展，并抑制植物的Gb感染。
[0037] 因此，本发明描述基于核酸来防治Gb害虫的方法。此类基于核酸的方法包括，但 不限于，基于Gb双链（dsRNA)、反义RNA和mRNA表达的方法。
[0038] 本发明的方法发现在期望抑制Gb的活力、生长、发育或生殖，或者降低昆虫的病 原性或感染性的任何【技术领域】实际应用。本发明的方法进一步发现在期望具体下调Gb昆 虫中的一种或多种靶基因表达的情况中实际应用。特别有用的实际应用包括，但不限于保 护植物抵抗Gb害虫侵扰（pestinfestation)。
[0039] 在某些方面，防治Gb侵扰的活性成分为双链RNA(dsRNA)或可促进或导致产生 dsRNA的核酸，可将其用作杀虫制剂。dsRNA可在宿主植物、植物部分（plantpart)、植物 细胞或种子中表达以保护植物抵抗Gb。dsRNA的序列对应于Gb必需基因的部分或全部， 并经RNA干扰（RNAi)引起昆虫靶基因的下调。作为mRNA下调的结果，dsRNA阻止昆虫靶 蛋白的表达并引起昆虫的死亡、生长停滞或不育。在该方面，用于防止昆虫侵扰对昆虫感染 敏感的细胞或植物的siRNA防治昆虫生长通过使昆虫与借助退火互补链产生的dsRNA接触 来起作用，所述互补链之一具有与昆虫靶基因的至少部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。 dsRNA在被昆虫摄食然后由昆虫经肠吸收的植物组织中表达，从而控制生长或防止侵扰。参 见Huvenne等，2010,JInsectPhysiol56:227-35。
[0040] 用于siRNA介导的干扰的Gb革El基因包括优选非冗余的活力基因（vitalgene)。 活力靶基因可为当被抑制时干扰昆虫生长或存活或病原性或感染性的任何基因。此类活 力靶基因对于昆虫的活力、生长、发育或生殖是必需的，或者是参与昆虫病原性或感染性， 以致特异性抑制靶基因导致致死表型或降低或停止昆虫侵扰的任何基因。此类活力靶基 因的下调（其活性不能由其他相关基因补充）导致害虫幼虫的严重损伤并提供针对无柄 (SeSSile)Gb害虫的有效的害虫防治系统。靶基因可为在此所述的任何靶基因，例如害虫活 力、生长、发育或生殖所必需的靶基因。靶基因的实例包括，例如参与蛋白质合成和/或新 陈代谢和/或RNA合成和代谢和/或细胞进程的基因。这些靶基因的微小敲除将对许多其 它基因和进程产生影响，最终导致对靶害虫的致死效应。此类下调靶基因将导致昆虫的死 亡，或停止或延迟昆虫的生殖或生长。此类靶基因对于昆虫活力是至关重要的并称为活力 基因。
[0041] 潜在的靶基因可基于与其它昆虫物种基因的同源性来鉴定。公布的全基因组RNAi 介导的基因干扰库（15, 16)可用于鉴定当基于这些基因的RNAi表达并通过摄食或任何其 它手段引入靶害虫有机体时使其它有机体致死的基因。因此，果蝇中鉴定为RNAi-致死的 基因可用于筛选膜翅目物种的直向同源物。此类膜翅目直向同源物可进一步用于筛选用于 潜在靶标的Gb物种。
[0042]Gb靶基因的核苷酸序列包括，例如SEQIDNO: 1-56和71-80中示出的序列、该序 列的互补体、该序列的反向互补体和与该序列和互补体在高严格杂交条件下选择性杂交的 序列。靶基因的实例包括，但不限于编码EQIDN0:ll、14、26、30、37、55、43、49和51的基 因。
[0043] 用于dsRNA-介导的Gb靶基因下调的核苷酸序列包括，例如，⑴SEQIDN0:l-56 和71-80中示出的序列及该序列的互补体；（ii)与SEQIDNO: 1-56和71-80中示出的序 列的同一性为至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%的 序列，及该序列的互补体；（iii)包括SEQIDNO: 1-56和71-80的至少17个邻接核苷酸， 及该序列的互补体；和（iv)与该序列和互补体在高严格杂交条件下选择性杂交的序列。 [0044] 本文所使用的"分离的"核酸为已从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收 的核酸。
[0045] 本文所使用的"防治害虫"是指杀死害虫，或防止害虫发育或生长，或防止害虫感 染或侵扰。本文所使用的防治害虫还包括防治害虫的后代（发育的卵）。本文所使用的防 治害虫还包括抑制害虫活力、生长、发育或生殖，或降低害虫的病原性或感染性。本文所使 用的化合物和/或组合物可用于保持有机体健康并可治疗性、预防性或系统性地用于防治 害虫或避免生长或发育或感染或侵扰。
[0046] 特别地，设想的通过本文所述方法防治的害虫为植物病原性有害昆虫。因此本文 所使用的"防治昆虫"包括防治昆虫后代（例如发育中的卵）。本文所使用的防治昆虫包 括抑制昆虫的活力、生长、发育或生殖，或降低昆虫的病原性或感染性。如本文所使用的，防 治昆虫可指抑制昆虫的生物学活性，产生一种或多种下列属性：昆虫进食减少、昆虫活力减 少、昆虫死亡、昆虫的分化和发育抑制、昆虫有性生殖能力的缺失或降低。
[0047] 本文所述的化合物和/或组合物可用于保持有机体健康并可治疗性、预防性或系 统性地用于防治昆虫或避免昆虫生长或发育或感染或侵扰。因此，本发明可允许之前易感 的有机体发育出抵抗昆虫有机体侵扰的抗性。
[0048] 术语"与……的至少部分互补"是指在超过10个核苷酸上，例如在至少15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24或更多个邻接核苷酸上与靶标核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。 尽管如此，"与……的至少部分互补"还可包括在超过20个核苷酸的长度上，例如在至少 20、21、22、23、24或更多个邻接核苷酸长度上与靶标序列的核苷酸序列的互补大于80%的 互补序列[13, 14]。
[0049] 在某些方面，本发明提供下调昆虫中靶基因表达的方法，所述方法包括使昆虫与 dsRNA接触，其中，dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与要下调的昆虫靶基因的核苷 酸序列至少部分互补的核苷酸序列，从而使dsRNA摄入昆虫内，进而下调昆虫靶基因的表 达。
[0050] 术语"昆虫"包括所有类型和处于包括卵、幼虫或稚虫、蛹和成虫阶段的所有发育 阶段的昆虫。
[0051] 如本文所使用的，术语"植物"包括期望治疗以预防或降低昆虫生长和/或昆虫侵 扰的任何植物材料。其包括尤其是整株植物、秧苗、繁殖或生殖材料如种子、插条、接枝、夕卜 植体等，以及植物细胞和组织培养物。植物材料应表达或具有表达RNA分子的能力，所述 RNA分子包括为害虫有机体的至少一种靶基因的正义链的至少部分核苷酸序列的RNA互补 体或表示其RNA等同物（equivalent)的至少一种核苷酸序列，以使RNA分子在植物-害虫 相互作用时被害虫摄取，所述RNA分子能够通过RNA干扰抑制靶基因或下调靶基因的表达。
[0052] 术语"基因表达下调"和"基因表达抑制"可交换使用，并且是指在来自靶基因的 蛋白质产物和/或mRNA产物水平上，基因表达的可测量或可观察的减少，或可检测的基因 表达的完全消除。dsRNA对基因表达的下调效果可计算为与正常基因表达相比时的至少 30 %、40 %、50 %、60 %，优选70 %、80 %，或甚至更优选90 %或95 %。根据靶基因的性质， 昆虫细胞中基因表达的下调或抑制可通过细胞或整个昆虫的表型分析，或者通过使用分子 技术如RNA液相杂交（solutionhybridization)、PCR、核酸酶保护、RNA杂交（Northern hybridization)、反转录、利用微阵列的基因表达监控、抗体结合、酶联免疫吸附试验 (ELISA)、蛋白质印迹（Westernblotting)、放射免疫测定（RIA)、其它免疫测定或荧光激活 细胞分析（FACS)测量mRNA或蛋白质表达来证实。
[0053] 必需基因的下调导致生长抑制。取决于所使用的测定，与已用对照dsRNA处理的 害虫有机体相比，生长抑制可定量为大于约5 %、10 %，更优选约20 %、25 %、33 %、50 %、 60%、75%、80%，最优选约90%、95%，或约99%。
[0054] "靶基因"可为期望受到抑制的必需的任何基因，因为其干扰昆虫的生长或病原性 或感染性。例如，如果本发明的方法被用于防止昆虫生长和/或侵扰，则优选筛选对昆虫活 力、生长、发育或生殖必需的靶基因，或者参与昆虫病原性或感染性的任何基因，以致靶基 因的特异性抑制导致致死表型或降低或停止昆虫侵扰。
[0055] 根据一个非限制性实施方案，靶基因为当使用本发明的方法其表达下调或受抑制 时昆虫死亡或者昆虫的生殖或生长停止或迟缓的此类靶基因。这种靶基因被认为是对昆虫 活力所必需的，并称为必需基因。因此，本发明包括如此处所述的方法，其中所述靶基因为 必需基因。
[0056] 在不受理论束缚下，靶基因为当其下调时使得昆虫的侵扰或感染、昆虫引起的损 害、和/或昆虫侵扰或感染宿主有机体和/或引起此类损害的能力降低的此类靶基因。术 语"侵扰"（动词，infest)和"感染"（动词，infect)或者"侵扰"（名词，infestion)和 "感染"（名词，infection)通常全文可交换使用。这种靶基因被认为参与昆虫的病原性或 感染性。因此，本发明延伸至此处所述的方法，其中所述靶基因参与昆虫的病原性或感染 性。选择后一种类型的靶基因的优势在于，阻断昆虫进一步感染植物或植物部分，并且抑制 形成下一代。
[0057] 在防治特定昆虫在宿主细胞或宿主有机体内或上生长或侵扰的dsRNA-介导的方 法中，优选dsRNA不与任何宿主基因共享，或至少不与宿主的任何必需基因共享任何显著 同源性。由此而言，优选dsRNA显不小于30%、更优选小于20%、更优选小于10 %和甚至更 优选小于5%的与宿主细胞的任何基因的核酸序列同一性。百分序列同一性应以dsRNA区 的全长计算。如果宿主有机体的基因组序列数据是可获得的，则可使用标准生物信息学工 具再确认与dsRNA的序列同一性。在一个实施方案中，在dsRNA和宿主序列之间的21个邻 接核苷酸上没有序列同一性，意味着由此而言，优选dsRNA的21个邻接碱基对未出现在宿 主有机体的编码序列（CDS)中。在另一实施方案中，在dsRNA的24个邻接核苷酸上与来自 宿主物种的任何核苷酸序列的序列同一性小于约10%或小于约12%。
[0058] dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与要下调的靶基因的靶核苷酸序列相对 应的核苷酸序列。dsRNA的另一链能够与第一链碱基配对。
[0059] 靶昆虫基因的"靶区"或"靶核苷酸序列"的表述可为基因的任何适合的区域或核 苷酸序列。革E区应包括革E基因的至少17、至少18或至少19个连续核苷酸（consecutive nucleotide)，更优选革El基因的至少20或至少21个核苷酸，仍更优选革El基因的至少22、23 或24个核苷酸。
[0060] 优选dsRNA(至少其部分）将与昆虫靶基因的靶区共享100%的序列同一性。然 而，将理解，在双链区全长上的100%序列同一性对于功能性RNA抑制不是必需的。相对于 靶基因具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也被发现对RNA抑制是有效的。
[0061] 术语"对应于"或"与……互补"在此可交换使用，并且当这些术语用于指dsRNA 与革G基因的革El区之间的序列对应性（sequencecorrespondence)时，它们可以相应地解读 为，即不绝对要求100%的序列同一性。然而，dsRNA与靶区之间的百分序列同一性通常为 至少80 %或85 %同一，优选至少90 %、95 %、96 %，或更优选至少97 %、98 %，并仍更优选至 少99%。当两条核酸链的至少85%的碱基配对时，这两条核酸链"基本上互补"。
[0062] 本文所使用的术语"互补"涉及DNA-DNA互补、RNA-RNA互补和DNA-RNA互补的全 部。依此类推，术语"RNA等同物"基本上是指在DNA序列中，碱基"T"可由核糖核酸中通常 存在的相应碱基"U"所代替。
[0063] 尽管dsRNA包含对应于靶基因的靶区的序列，但对应于靶区序列的整个dsRNA不 是必要的。例如，dsRNA可包含位于特异性靶序列侧翼的短的非靶区，条件是此类序列在 RNA抑制中不对dsRNA的性能影响到实质程度（materialextent)。
[0064] dsRNA可包含一种或多种置换碱基以便优化在RNAi中的性能。如何依次改变 dsRNA的各碱基并（例如在适合的体外试验体系中）测试所得dsRNA的活性从而优化所的 dsRNA的性能，对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
[0065] dsRNA可进一步包含DNA碱基、非天然碱基或糖-磷酸骨架的非天然骨架连接或修 饰，从而例如增强保存期间的稳定性或增强被核酸酶降解的抗性。
[0066] 约21bp的干扰RNA(siRNA)对于基因沉默的是有用的。优选将dsRNA的长度增加 到至少约80-100bp可提高dsRNA被害虫有机体摄取的效率。此类较长的片段可在基因沉 默中更加有效，可能是由于这些长dsRNA被无脊椎动物更有效地摄取。
[0067] 由具有29bp茎区（stem)和2-nt3'突出端的27-mer平端的或短发夹（sh)RNA 的RNA双链体（duplex)也可用作siRNA。因此，基于上述鉴定的靶标且为具有29bp茎区和 2-nt3'突出端的27-mer平端或短发夹（sh)RNA的靶标的分子也包括在本发明的范围内。
[0068] 因此，在一个实施方案中，dsRNA片段（或区域）本身将优选为至少17bp长，优选 18或19bp长，更优选至少20bp，更优选至少21bp、或至少22b、或至少23bp、或至少24bp、 25bp、26bp或至少27bp长。"双链RNA片段"或"双链RNA区"的表述是指对应于靶基因（的 部分）的dsRNA的小实体（entity)。
[0069] 更普遍地，双链RNA优选在约17-1500bp之间、甚至更优选在约80-1000bp之间， 并最优选在约17_27bp之间或在约80-250bp之间；例如约17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、 22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、 450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、llOObp、1200bp、1300bp、1400bp或 1500bp的双链RNA区。
[0070] dsRNA长度的上限可取决于i)dsRNA被昆虫摄取的要求和ii)dsRNA在细胞中被加 工成指导RNAi的片段的要求。所选长度还可受到RNA合成方法和RNA运送至细胞的模式 的影响。优选在本发明的方法中要使用的dsRNA将为小于10, 000bp长，更优选1000bp以 下、更优选500bp以下、更优选300bp以下、更优选100bp以下。对于任何给定的靶基因和 昆虫，对于有效抑制的dsRNA的最佳长度可通过实验确定。
[0071] dsRNA可完全或部分双链化。部分dsRNA可在双链部分的一端或两端包含短单链 突出端，条件是RNA仍能够被昆虫摄取并指导RNAi。dsRNA还可包含内部非互补区。
[0072] 本发明的方法包括向同一昆虫同时或连续供给两种或更多种不同的dsRNA或RNA 构建体，以便实现多种靶基因的下调或抑制，或者实现单个靶基因更强有力的抑制。
[0073] 可选地，通过提供命中多种靶序列的一种dsRNA来命中多种靶标，通过存在对应 于靶基因的双链RNA片段的超过一个拷贝来更有效地抑制单个靶标。因此，在某些方面， dsRNA构建体包括多个dsRNA区，每一个dsRNA区的至少一条链包括与昆虫靶基因的靶核苷 酸序列的至少部分互补的核苷酸序列。RNA构建体中的dsRNA区可与相同或不同的靶基因 互补和/或dsRNA区可与来自相同或不同昆虫物种的靶标互补。
[0074] 术语"命中（hit、hits和hitting) "是表示至少一条dsRNA链与革巴基因或核苷酸 序列互补并且其本身可结合至靶基因或核苷酸序列的可选词汇。
[0075] 在一个实施方案中，双链RNA区包括与靶基因互补的核苷酸序列的多个拷贝。可 选地，dsRNA命中相同靶基因的超过一个靶序列。本发明因而包括包含与昆虫靶标的核苷 酸序列的至少部分互补的所述核苷酸序列的至少两个拷贝的分离的双链RNA构建体。
[0076] 如本文所述的术语"多个（种）"是指至少两个（种）、至少三个（种）、至少四个 (种）、至少五个（种）、至少六个（种）等。
[0077] "其它靶基因"或"至少一种其它靶基因"的表述是指例如第二种、第三种或第四种 等靶基因。
[0078] 开发命中超过一种上述革E1标的dsRNA或者与上述革E1标不同的不同dsRNA的组合并 用于本发明的方法。
[0079] 双链RNA中的dsRNA区（或片段）可如下组合：a)当靶向单个靶基因的多个 dsRNA区组合时，它们可以在RNA构建体中以原始顺序组合（S卩，其中所述区域出现在靶基 因中的顺序）；b)可选地，片段的原始顺序可忽略，以便它们以任何顺序随机或有意地颠倒 (scrambled)和组合为双链RNA构建体中；c)可选地，在dsRNA构建体中一个单独片段可重 复多次，例如1-10次，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或d)dsRNA区（靶向单个或不同靶 基因）可以以正义或反义方向组合。
[0080] 革E1向单个或不同弱基因（weakgene)的多个dsRNA区可组合来获得更强的RNAi 效果。"昆虫特异性"基因或序列，例如Gb特异性的、特别是Gb特异性基因和序列，包括当 可通过生物信息学同源性检索，例如通过BLAST检索来确定时，在非昆虫有机体中不具有 实质上同源的对应物（counterpart)的基因。特异性革E1基因的选择产生种特异性RNAi效 果，而对非祀标有机体（non-targetorganism)没有效果或没有实质（不利）效果。"保守 基因"包括在靶标有机体和非靶标有机体之间保守（在氨基酸水平上）的基因。为了减少 对非靶标物种可能的作用，分析此类有效但保守的基因，并选择来自这些保守基因的可变 区的序列被RNA构建体中的dsRNA区靶向。在核酸序列水平上评价保守性。此类可变区因 而至少包括保守靶基因的在核酸序列水平上的保守部分。根据本发明的RNA构建体从不同 的生物学途径靶向多基因，导致广泛的细胞RNAi效果和更佳有效的昆虫防治。在某些实施 方案中，dsRNA由序列，例如与蜜蜂直向同源物的序列的同一性等于或小于80%的Gb转录 组序列构建。
[0081] 在某些方面，dsRNA构建体构建有影响不同类型细胞功能的基因序列。此类细胞功 能类型的实例包括，但不限于，（i)蛋白质合成和代谢，（ii)RNA合成和代谢，和（iii)细胞 进程。在某些实施方案中，dsRNA构建体包括来自前述各权利要求即三种类型的序列。在 某些实施方案中，dsRNA构建体包括来自前述类型中的两种类型，如蛋白质合成和代谢以及 RNA合成和代谢；蛋白质合成和细胞进程；或RNA合成和代谢以及细胞进程的序列。
[0082] dsRNA区包括与本文所记载的任一种靶基因的核苷酸序列的至少部分或一部分互 补的至少一条链。然而，假如双链RNA区之一包括与本文所记载的任一种靶基因的核苷酸 序列的一部分互补的至少一条链，则其它双链RNA区可包括与任何其它昆虫靶基因（包括 已知的靶基因）的一部分互补的至少一条链。
[0083] 在某些构建体中，dsRNA可包括附加序列和任选的连接子。附加序列可包括，例如 (i)促进dsRNA构建体大规模生产的序列；（ii)影响dsRNA稳定性的提高或降低的序列； (iii)允许蛋白质或其它分子结合以促进RNA构建体被昆虫摄取的序列；（iv)为结合昆虫 表面上或胞质中的受体或分子以促进被昆虫摄取、内吞和/或胞转的适配体（aptamer)的 序列；或（v)催化dsRNA区加工的附加序列。在一个实施方案中，连接子为附有条件地自剪 切（self-cleaving)RNA序列，优选pH敏感性连接子或疏水敏感性连接子。
[0084] dsRNA构建体的多个dsRNA区可直接连接或者通过一个或多个连接子连接。连接 子可存在于RNA构建体中将dsRNA区与另一个感兴趣区分隔的位点。dsRNA构建体的多个 dsRNA区可在没有连接子的情况下连接。
[0085] 当连接子存在时，其可用于断开害虫有机体中的较小的dsRNA区。有利地，在该情 况下，连接子序列可在特定情况下促使长dsRNA分成较小的dsRNA区，导致在这些情况下分 离的dsRNA区的释放，并由这些较小的dsRNA区产生更有效的基因沉默。适合的附有条件 的自剪切连接子的实例为在高pH条件下自剪切的RNA序列。此类RNA序列的适合的实例 由Borda等人记载（NucleicAcidsRes. 2003May15 ;31 (10): 2595-600)，将该文献引入于 此以作参考。该序列源自锤头状核酶HH16的催化中心。
[0086] 连接子还可定位于dsRNA构建体中将dsRNA区与另一例如感兴趣的附加序列分隔 的位点，所述感兴趣的附加序列优选为RNA构建体提供某些附加功能。
[0087]dsRNA构建体可包括适配体以促进dsRNA被昆虫摄取。将适配体设计为结合被昆 虫摄取的物质。此类物质可来自昆虫或植物来源。适配体的一个具体实例为结合至跨膜蛋 白，例如昆虫的跨膜蛋白的适配体。可选地，适配体可结合被昆虫摄取的（植物）代谢物或 营养素。
[0088] 连接子可在内涵体中进行自剪切。当本发明的构建体经胞吞或胞转被昆虫摄取， 并因而在昆虫物种的内涵体中被区室化时这可是有利的。内涵体可具有低pH环境，导致连 接子的剪切。
[0089] 当用于经由细胞壁运输从一个细胞转移至另一个细胞时，例如当穿过有害昆虫有 机体的细胞壁时，在疏水条件下自剪切的连接子在dsRNA构建体中特别有用。
[0090] 内含子可用作连接子。本文所使用的"内含子"可为信使RNA的任何非编码RNA序 列。
[0091] 还可将范围在约1碱基对至约10, 000碱基对的非互补性RNA序列用作连接子。
[0092] 在不希望受任何特定理论或机理的束缚下，认为长dsRNA被昆虫从它们的附近环 境中摄取。dsRNA被摄取进入肠并转移至肠上皮细胞，然后在细胞中通过内源核酸内切酶的 作用加工成短dsRNA，称为小干扰RNA(siRNA)。所得siRNA然后通过形成称为RISC或RNA 干扰沉默复合体的多组分RNase复合体来介导RNAi。
[0093] 为了实现昆虫细胞内靶基因的下调，添加至细胞壁外部的dsRNA可为可被摄取进 入细胞，接着在细胞内加工成siRNA，进而介导RNAi的任何dsRNA或dsRNA构建体，或者添 加至细胞外部、本身是能够可摄取进入细胞且从而指导RNAi的siRNA的RNA。
[0094]siRNA通常为长度在19-25碱基对或20-24碱基对范围内的短的dsRNA。在优选 实施方案中，可使用对应于要下调的靶基因，具有19、20、21、22、23、24或25个碱基对、特别 是21或22个碱基对的siRNA。然而，本发明不意欲限制此类siRNA的使用。
[0095]siRNA可包括在双链部分的侧翼的一端或两端的单链突出端。siRNA可包含3'突 出核苷酸，优选两个3'突出胸苷（dTdT)或尿苷（UU)，如果在包含于dsRNA双链部分中的序 列的紧接上游的靶基因序列为AA，则3'TT或UU突出端可包含于siRNA中。这使得siRNA 中的TT或UU突出端与靶基因杂交。尽管3'TT或UU突出端还可包含于siRNA的另一端， 但是包含于siRNA双链部分中序列的靶序列的下游序列不必具有AA。由此而言，作为RNA/ DNA嵌合体的siRNA也是预期的。这些嵌合体包括，例如如上所述包括具有DNA碱基3'突 出端（如，dTdT)的dsRNA以及为其中一个或多个RNA碱基或核糖核苷酸、甚至整个链上的 所有核糖核苷酸被DNA碱基或脱氧核糖核苷酸代替的多核苷酸的dsRNA的siRNA。
[0096]dsRNA可由两个单独的（正义和反义）RNA链通过（非共价）碱基配对退火在一起 而形成。可选地，dsRNA可具有折回茎-环或发夹结构，其中dsRNA的两个退火链共价连接。 在该实施方案中，dsRNA的正义和反义链由部分自身互补的单个多核苷酸分子的不同区域 形成。如果dsRNA通过在体内例如在宿主细胞或有机体中表达，或者通过体外转录来合成， 则具有该结构的RNA是便利的。连接两个RNA链的"环"的确切性质和序列，除了不应损害 分子的双链部分介导RNAi的能力以外，对本发明通常是不重要的。用于RNAi的"发夹"或 "茎-环"RNA的特征通常是本领域已知的（例如参见WO99/53050,将其内容引入于此以作 参考）。在本发明的其它实施方案中，环结构可包括如上所述的连接子序列或附加序列。
[0097] 在某些方面，本文公开的Gb序列及此类序列的互补体还可通过使用本领域内 已知的方法表达反义RNA或过表达正义RNA来用于抑制Gb核酸的表达。所述已知方 法，参见例如Frizzi等，PlantBiotechJ, (2010)8:655-677;Brodersen等，Trendsin Genetics, (2008)22:268-280 ;和美国专利5, 759, 829。使用本文所述的表达元件、载体和 方法，针对Gb靶基因的反义RNA或正义RNA在桉树植物中表达。在被Gb害虫摄食后，反义 或正义RNA抑制靶基因的表达，从而防治害虫侵扰。
[0098] 用于设计dsRNA构建体的靶核苷酸序列优选至少17个，优选至少18、19、20或21 个，更优选至少22、23或24个核苷酸长度。优选的靶核苷酸序列的非限制性实例示于实施 例中。
[0099] 靶序列可包括与本文所述序列同源的序列。靶基因的同源物可使用本领域普 通技术人员公知的方法来发现。优选的同源物为包括与本文所公开的序列的同一性为 至少约85 %或87. 5 %、仍更优选至少约90 %、仍更优选至少约95 %和最优选至少约 99%或99.9%的序列的基因，或其互补体。用于确定序列同一性的方法在本领域是常 规的，并包括使用Blast软件和EMBOSS软件（TheEuropeanMolecularBiologyOpen SoftwareSuite(2000)，Rice,P.Longden，I?和Bleasby，A.TrendsinGenetics16，（6)pp 276-277)。本文所使用的术语"同一性"是指核苷酸水平上序列之间的关系。" ％同一性" 的表述通过在比较窗口上比较，例如两个或更多个最佳比对序列来确定，其中与用于序列 最佳比对的参考序列相比，比较窗口中的序列部分可包括插入或缺失。参考序列不包括插 入或缺失。参考窗口选自至少10个邻接核苷酸至约50、约100或至约150个核苷酸之间， 优选约50和150个核苷酸之间。然后通过确定窗口中序列之间相同的核苷酸数，将相同的 核苷酸数除以窗口中的核苷酸数，再乘以100来计算"百分率同一性"。
[0100] 术语"选择性杂交"包括涉及在严格杂交条件下的核酸序列与特定核酸靶序列 的杂交使得可检测程度大于其与非靶核苷酸序列的杂交（例如相对于背景至少2倍），并 基本上排除非靶核酸。选择性杂交序列典型地彼此具有约至少40%的序列同一性，优选 60-90 %的序列同一性，和最优选100 %的序列同一性（即，互补）。
[0101] 术语"严格条件"或"严格杂交条件"包括涉及在该条件下探针将与其靶序列杂交 使得可检测程度大于其它序列（例如，相对于背景至少2倍）的条件。严格条件是序列依 赖的并且在不同环境中不同。通过控制杂交的严格性和/或洗涤条件，可识别可与探针达 100%互补的靶序列（同源探测）。可选地，可调整严格条件来允许序列中的某些错配从而 检测较低程度的相似性（异源探测）。最佳地，探针长度为约500个核苷酸，但长度可从小 于500个核苷酸至等于靶序列全长大幅变化。
[0102] 典型地，严格条件将是其中在pH7.0至8. 3和温度为至少约30°C(短探针，例如 10至50个核苷酸）和至少约60°C(长探针，例如大于50个核苷酸）下盐浓度小于约1. 5M Na离子，典型地约0. 01至1. 0MNa离子浓度（或其它盐）的那些。严格条件还可添加去 稳定剂如甲酰胺或Denhardt's来实现。示例性低严格条件包括在37°C下用30至35%甲 酰胺、1MNaCl、l%SDS(十二烷基硫酸钠）的缓冲溶液杂交并在50至55°C下在IX至2X SSC(20XSSC= 3. 0MNaCl/0. 3M柠檬酸三钠）中洗涤。示例性温和严格条件包括在37°C下 在40至45%甲酰胺、1MNaCl、l%SDS中杂交并在55至60°C下在0. 5X至IXSSC中洗涤。 示例性高严格条件包括在37°C下在50%甲酰胺、1MNaCl、l%SDS中杂交并在60至65°C在 0. IXSSC中洗涤。
[0103] 特异性典型地为杂交后洗涤的功能，关键因素为最终洗涤液的离子强度和温度。 对于DNA-DNA杂交，L可从Meinkoth和Wahl, (1984)Anal.Biochem.，138:267-84 等式估 算：!"= 81. 5°C+16. 6(logM)+0. 41(%GC)-〇. 61(%form)-500/L;其中M为单价阳离子 的摩尔浓度（molarity)，％GC为鸟嗓呤和胞喃啶核苷酸在DNA中的百分比，％form为甲 酰胺在杂交液中的百分比，和L为碱基对中杂交体的长度。^为（在规定的离子强度和pH 下）其中50%的互补靶序列与优选匹配的探针杂交的温度。！"相对于每1%的错配降低约 1°C;因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件来与期望同一性的序列杂交。例如，如果搜寻到 >90%同一性的序列，Tm可降低10°C。通常，选择在确定的离子强度和pH下比特异序列及其 互补体的热熔点（TJ低约5°C的严格条件。然而，非常严格条件可使用在比热熔点（TJ低 1、 2、3或4°C的杂交和/或洗涤；温和严格条件可使用在比热熔点（Tm)低6、7、8、9或10°C 的杂交和/或洗涤；低严格条件可使用在比热熔点（Tm)低11、12、13、14、15或20°〇的杂交 和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗涤组成以及期望的Tm，普通技术人员将理解本质上描述 了杂交和/或洗涤液的严格性的变化。如果期望的错配程度产生低于45°C(水溶液）或 32°C(甲酰胺溶液）的Tm，则优选增加SSC浓度以便可使用更高的温度。
[0104] 对核酸杂交的深入介绍见Tijssen,LaboratoryTechniquesinBihemistryand MolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分，第 2 章， "Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobe assays''，Elsevier,N.Y. (1993);和CurrentProtolsinMolecularBiology，第 2 章， Ausubel等，eds,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork(1995) 〇 除非另 有说明，在本申请中，高严格性定义为在65°C下在4XSSC、5XDenhardt's(500ml水中5g 聚蔗糖、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白）、0.lmg/ml煮沸的鲑鱼精子DNA和25mM磷 酸钠中杂交和在65°C下在0.IXSSC、0. 1%SDS中洗涤。
[0105]dsRNA可通过宿主细胞或宿主有机体表达（例如在其中转录）。宿主细胞或有机 体可以是或可以不是对昆虫侵扰敏感或易受其侵害的宿主细胞或有机体。如果宿主细胞或 有机体为对昆虫侵扰敏感或易受其侵害的宿主细胞或有机体，作为控制昆虫在宿主有机体 内或上生长和/或防止或减少宿主有机体的昆虫侵扰的机理，可使用RNAi介导的一种或多 种靶基因在昆虫中的基因沉默。dsRNA在宿主有机体的细胞内的表达可因此赋予对特定昆 虫或对一类昆虫的抗性。假如dsRNA命中超过一种昆虫靶基因，dsRNA在宿主有机体的细 胞中的表达可赋予对超过一种昆虫或超过一类昆虫的抗性。
[0106] 在优选的实施方案中，宿主有机体为植物，昆虫为植物病原昆虫。在该实施方 案中，通过在受植物病原昆虫侵扰或对其侵扰敏感或被其摄食的植物、植物组织或植物 细胞中表达dsRNA而使昆虫与dsRNA相接触。优选的植物宿主有机体为桉树。桉树的 实例包括，但不限于以下物种：葡萄桉（E.botryoides)、苹果桉（E.bridgesiana)、赤 按（E.camaldulesis)、灰按（E.cinerea)、蓝按（E.globule)、巨按（E.grandis)、西达按 (E.gunii)、尼克尔桉（E.nicholii)、圆叶桉（E.pulverulenta)、大叶桉（E.robusta)、野桉 (E.rudis)、柳叶桉（E.saligna)、细叶桉（E.Tereticornis)、尾叶桉（E.Urophilla)、多枝 桉（E.viminalis)和任意前述物种特别是巨桉和尾叶桉的杂交种。优选的植物病原昆虫为 Gb，例如Gb。
[0107] 术语"植物"包括期望处理以防止或减少昆虫生长和/或昆虫侵扰的任何植物材 料。其包括尤其是整株植物、秧苗、繁殖或生殖材料如种子、插条、接枝、外植体等，以及植物 细胞和组织培养物。植物材料应当表达对应于昆虫的一种或多种靶基因的dsRNA或具备表 达该dsRNA的能力。
[0108] 在某些方面，本发明提供表达或能够表达至少一种dsRNA的植物，优选转基因植 物、或（转基因）植物的繁殖或生殖材料、或植物细胞培养物，其中dsRNA包括退火的互 补链，其中之一具有与昆虫的靶基因的至少部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，以便使 dsRNA在植物-昆虫相互作用时被昆虫摄取，所述双链RNA能够通过RNA干扰抑制靶基因或 下调靶基因的表达。靶基因可为本文所述靶基因的任一种，例如昆虫活力、生长、发育或生 殖所必须的靶基因。
[0109] 植物可以以在一种或多种细胞、细胞类型或组织中活跃表达（转录）dsRNA的形式 提供。可选地，植物可为"能够表达"的，指其用转基因转化，所述转基因编码期望的dsRNA 的转基因，但当提供该植物（和以提供植物的形式）时转基因在该植物中不活跃。包括编 码dsRNA或dsRNA构建体的核苷酸序列的重组DNA构建体可因而被可操作地连接至至少一 个调节序列。优选地，调节序列选自包括如下所述的组成型启动子或组织特异性启动子的 组。
[0110] 靶基因可为本文所述的任一种靶基因。优选地，调控元件为在植物细胞中活跃的 调控元件。更优选地，调控元件源自植物。术语"调控序列"将在广义上理解，并指能够影 响可操作地连接的序列表达的调控核酸。
[0111] 前述术语包括启动子和激活或增强核酸的转录的核酸或合成融合分子或其衍生 物，所谓的激活子或增强子。本文所使用的术语"可操作地连接"是指启动子序列与目标基 因之间的功能性连接，以使启动子序列能够起始目标基因的转录。
[0112] 举例来说，编码dsRNA的转基因核苷酸序列可位于诱导性或者生长或发育阶 段-特异性启动子控制下，通过添加诱导型启动子的诱导物或当达到生长或发育特定阶段 时所述启动子允许dsRNA转录的开启。
[0113] 可选地，编码dsRNA的转基因位于强组成型启动子如选自包括CaMV35S启动子、 CaMV35S双启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖二磷酸羧化酶（rubisco)启动子、 G0S2启动子、玄参花叶病毒（Figwortmosaicvirus，FMV)34S启动子、木薯叶脉（cassaya vein)花叶病毒（CsVMV)启动子的组的任一种的调控下（VerdaguerB.等，PlantMol. Biol.199837(6):1055-67)。
[0114] 可选地，编码dsRNA的转基因位于组织特异性启动子如选自包括编码PsMTA类型 III几丁质酶基因的根特异性启动子，光合组织特异性启动子如cabl和cab2、rbcS、gapA、 gapB和ST-LS1蛋白的启动子，JAS启动子，查耳酮合成酶启动子和来自草莓的RJ39的启动 子的组的任一种的调控下。
[0115] 编码dsRNA的转基因还可位于昆虫诱导型启动子，例如马铃薯蛋白酶抑制剂 11(卩;[1111)启动子（0皿11乂等，似1:.13;[(^6(3111101.1996，14(4):494-8));或伤害诱导型启 动子，例如茉莉酸醋（jasmonate)和乙稀诱导型启动子、roFl.2启动子（MannersJM等， PlantMol.Biol. 1998, 38(6): 1071-80)的调控下；或者防御相关的启动子，例如水杨酸 诱导型启动子和植物病原相关蛋白（PR蛋白）启动子（PR1启动子（CornelissenBJ等，NucleicAcidsRes. 1987, 15(17) :6799-811 ;C0MT启动子（ToquinV等，卩1&拉]?〇1. Biol. 2003, 52(3) :495-509)下。
[0116] 当使用本文所述的方法来开发抗昆虫的转基因植物时，将编码dsRNA的核酸位于 组织特异性启动子控制下可以是有益的。为了改善dsRNA从植物细胞向昆虫的转移，植 物可优选在首先被植物害虫接近或破坏的植物部分表达。在植物病原性昆虫的情况下， 优选的表达dsRNA的组织为叶、茎、根和种子。因此，在本文所公开的方法中，可使用植物 组织-优选的启动子，例如叶特异性启动子、茎特异性启动子、韧皮部特异性启动子、木 质部特异性启动子、根特异性启动子或种子特异性启动子（蔗糖转运蛋白基因（sucrose transportergene)AtSUC启动子（BaudS等，PlantJ. 2005,43(6) :824_36)、小麦高分子 量麦谷蛋白基因启动子（RobertLS等，PlantCell. 1989, 1(6) :569-78.))。
[0117] 根特异性启动子的适合的实例为PsMTA(Fordam-Skelton，A.P.，等，1997Plant MolecularBiology34:659-668.)和类型III几丁质酶启动子。同样被光活化的叶和 茎特异性或光合组织特异性启动子的实例为来自甜菜的两种叶绿素结合蛋白（cabl和 cab2)的启动子（StahlD.J.，等，2004BMCBiotechnology20044:31)、由rbcS编码的 核酮糖 _ 二磷酸羧化酶（Rubisco)(NomuraM?等，2000PlantMol.Biol. 44:99-106)、 叶绿体甘油醛_3_磷酸脱氢酶A(gapA)和B(gapB)亚单位（ConleyT.R.等.19941〇1. Cell.Biol. 19:2525-33;KwonH.B?等.1994PlantPhysiol. 105:357-67)、编码叶和茎 特异性蛋白的马铃薯（Solanumtuberosum)基因（ST-LS1)的启动子（ZaidiM.A?等， 2005TransgenicRes. 14:289-98)、茎调控的防御诱导性基因，如JAS启动子（专利公布 号20050034192/US-A1)。花特异性启动子的实例为例如，查耳酮合成酶启动子（Faktor 0.等.1996PlantMol.Biol. 32:849)，果实特异性启动子的实例为例如来自草莓的 RJ39(W0 98 31812)〇
[0118] 使用用于表达dsRNA的其它启动子，其包括但不限于来自RNAPoll、RNAPoll、 RNAPolIII、T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的启动子。这些启动子典型地用于体外生产 dsRNA，之后将dsRNA诱导入抗杀虫剂，例如诱导入抗杀虫液、喷雾剂或粉剂中。
[0119] 本文所描述的dsRNA或RNA构建体可通过以下步骤产生：（i)使分离的核酸或重 组DNA构建体与无细胞组分接触；或（ii)在允许核酸或重组DNA构建体转录的条件下将分 离的核酸或重组DNA构建体导入（例如，通过转化、转染或注射）细胞中，从而产生dsRNA 或RNA构建体。
[0120] 任选地，还可将一种或多种转录终止序列引入重组构建体中。术语"转录终止序 列"包括转录单元末端的控制序列，其传导初级转录本的3'加工和多聚腺苷酰化以及转录 终止的信号。可将额外的调控元件，例如转录或翻译增强子引入表达构建体中。
[0121] 重组构建体可进一步包括在特定的细胞类型中保持和/或复制所需的复制起点。 一个实例为当需要表达构建体作为细胞中的附加型遗传元件（例如，质粒或柯斯质粒分 子）保持于细菌细胞中时，优选的复制起点包括，但不限于fl-ori和colElori。
[0122] 重组构建体可任选地包括选择标记基因。如本文所述，术语"选择标记基因"包 括任一种基因，其赋予细胞以表型，其中该基因的表达促进转染或转化有本发明的表达构 建体的细胞的识别和/或选择。适合的选择标记的实例包括抗氨苄青霉素（Ampr)、四环素 (Ter)、卡那霉素（Kanr)、膦丝菌素（phosphinothricin)和氯霉素（CAT)基因的抗性基因。 其它适合的标记基因提供代谢特性，例如manA。还可使用可视化标记基因，并且包括例如 0-葡糖醛酸酶（GUS)、荧光素酶和绿色荧光蛋白（GFP)。
[0123] 已稳定转化有编码dsRNA的转基因的植物可提供为不活跃表达dsRNA但具有活跃 表达dsRNA的能力的种子、生殖材料、繁殖材料或细胞培养材料。植物可以以其中在一种或 多种细胞、细胞类型或组织中活跃表达（转录）RNA分子的形式提供。可选地，植物可为"能 够表达"的，指利用编码期望的RNA分子的转基因转化，但当提供该植物（并且以其中提供 植物的形式）时转基因在该植物中不活跃。许多载体可用于该目的，并且适合的载体的选 择将主要取决于插入载体的核酸大小和要转化有载体的特定宿主细胞。
[0124] 为了RNAi的目的在植物中表达外源dsRNA的通用技术是本领域已知的（参见 BaulcombeD, 2004,Nature. 431 (7006):356-63.RNAsilencinginplants，将其内容共引 入于此以作参考）。更特别地，为了下调植物害虫如线虫或昆虫中的基因表达的目的而在植 物中表达dsRNA的方法也是本领域已知的。类似的方法可以以类似的方式应用，从而在植 物中表达dsRNA以下调植物病原昆虫中靶基因的表达。为了实现该效果，对于植物来说，必 须仅在要与昆虫接触的植物的部分表达（转录）dsRNA，由此dsRNA可被昆虫摄取。取决于 昆虫的性质及其与宿主植物的关系，dsRNA的表达可发生在昆虫在其生命周期期间存在的 植物细胞或组织内，包括脉管系统，或者RNA可分泌至细胞之间，例如在昆虫的生命周期期 间被昆虫占据的质外体。
[0125] 此外，dsRNA可位于植物细胞如细胞溶胶中，或者位于植物细胞细胞器如叶绿体、 线粒体、液泡或内质网中。dsRNA可进一步在韧皮部中和/或转运至韧皮部表达，例如在叶 韧皮部或木质部其可被吸汁害虫摄食。参见Pitino等，PLoS0NE，6(10):e25709(2011)和 Mlotshwa等，PlantCell, 14:S289-S301 (2002)〇
[0126] 发育期间，Gb幼虫由于摄食（例如摄食质外体）或细胞溶解而暴露于包括脉管系 统在内的细胞外环境以及细胞内的内容物。
[0127] 可选地，dsRNA可由植物细胞分泌，并由植物分泌至植物外部。由此，dsRNA可在植 物表面上形成保护层。
[0128] 在另一方面，本发明还提供用于预防或保护植物免受害虫侵扰的方法和组合物的 组合。例如，一种手段提供使用植物转基因方法与使用dsRNA分子表达的方法和使用此类 Bt杀虫蛋白表达的方法相结合。
[0129] 在进一步的实施方案中，本发明涉及用于控制昆虫生长和/或防止或减少昆虫侵 扰的组合物，其至少包括包含至少一种dsRNA的植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其 中所述dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与昆虫靶基因的至少部分核苷酸序列互补 的核苷酸序列。任选地，组合物进一步包括至少一种适合的载体、赋形剂或稀释剂。靶基因 可为本文所述的任何靶基因。优选地，昆虫靶基因对于昆虫的活力、生长、发育或生殖是必 须的。
[0130] 无论何时术语"一种"在"一种靶基因"的语境中使用，这是指"至少一种"靶基因。 对于"一种"靶有机体是指"至少一种"靶有机体，和"一种"RNA分子或宿主细胞是指"至少 一种"RNA分子或宿主细胞同样适用。
[0131] 根据一个实施方案，本发明的方法依赖于存在于昆虫外部的dsRNA被昆虫摄取 (如，进食），并且不需要在昆虫细胞内表达dsRNA。此外，本发明还包括如上所述的其中昆 虫与包括dsRNA的组合物接触的方法。
[0132] 本发明进一步提供用于下调靶有机体（其能够摄食植物、植物部分、植物细胞或 种子）中至少一种靶基因表达的方法，所述方法包括向靶有机体喂养植物、植物部分、植物 细胞或种子，所述植物、植物部分、植物细胞或种子表达dsRNA。
[0133] 在更优选的方面，本发明提供用于下调靶有机体（其能够摄取宿主细胞或其提取 物）中至少一种靶基因的方法，所述方法包括向靶有机体喂养宿主植物、植物部分、植物细 胞或种子，所述宿主植物、植物部分、植物细胞或种子表达dsRNA，所述dsRNA包括与至少一 种靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物互补或表示至少一种靶基因的至少部分核 苷酸序列的RNA等同物的核苷酸序列，从而宿主植物、植物部分、植物细胞或种子被靶有机 体的摄食引起和/或导致至少一种靶基因的表达下调。
[0134] 本发明提供如本文所定义的植物、植物部分、植物细胞或种子用于下调昆虫靶基 因表达的用途。在更详细的方面，本发明提供如本文所定义的宿主细胞和/或包括核苷酸 序列的RNA分子用于下调靶基因表达的用途，所述核苷酸序列包括来自靶有机体的靶基因 的至少部分核苷酸序列的RNA等同物的RNA互补体或表示来自靶有机体的靶基因的至少部 分核苷酸序列的RNA等同物，所述包括核苷酸序列的RNA分子通过，例如在商品制造时，在 植物、植物部分、植物细胞或种子中转录核酸分子来生产。
[0135] 根据一个实施方案，本发明的方法依赖于遗传改良生物（GMO)法，其中dsRNA通过 受昆虫侵扰或对昆虫侵扰敏感的细胞或有机体表达。优选地，所述细胞为植物细胞或所述 有机体为植物。
[0136] 对于siRNA介导的昆虫基因的下调，dsRNA直接或间接地引入和/或表达于昆虫 细胞中。dsRNA可人工添加至昆虫食物或通过转基因食物来源如细菌和植物来生产[2, 8]。 包含昆虫基因特异性序列的反向重复RNA被转基因植物转录，可将其加工成dsRNA并稍后 加工成siRNA(为沉默通路中的第一产物的小干扰RNA)。消化此类转基因植物的昆虫受植 物合成的dsRNA和siRNA的影响[5]。该昆虫防治法可用于保护植物有效对抗特定的害虫 [2, 8]。然而，不需要在植物材料中将dsRNA加工成siRNA。dsRNA可被有害昆虫摄食并在 昆虫细胞内首次加工成siRNA。
[0137] 用于向植物引入外源基因的许多方法是已知的，并可用于将NT多核苷酸 插入植物宿主中，包括生物学和物理植物转化法。例如，参见Miki等，"Procedure forIntroducingForeignDNAintoPlants，"inMethodsinPlantMolecular BiologyandBiotechnology,GlickandThompson,eds. ,CRCPress,Inc.,Boca Raton，pp. 67-88 (1993)。所选方法根据宿主植物而变化，并包括化学转染法如磷酸钙、微生 物介导的基因转移如农杆菌属（Horsch等，Science227:1229_31 (1985))、电穿孔、显微注 射和生物射弹轰击（biolisticbombardment)。
[0138] 用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知 且可获得的。参见例如Gruber等，"VectorsforPlantTransformation，"inMethodsin PlantMolecularBiologyandBiotechnology，supra，pp.89_119〇
[0139] 分离的多核苷酸或多肽可通过一种或多种典型用于直接递送进入细胞的技术引 入植物中。此类方法可取决于基因修饰所靶向的有机体、细胞、植物或植物细胞的类型，即 单子叶植物或双子叶植物而变化。适合的转化植物细胞的方法包括显微注射（Crossway， 等，（1986)Biotechniques4:320-334 ;和U.S.Pat.No. 6, 300, 543)、电穿孔（Riggs，等， (1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606、直接基因转移（Paszkowski等，（1984) ￡]\?0<1.3:2717-2722)和弹道粒子加速（参见，例如331^〇1'(1，等，美国专利号4,945,050 ; TO91/10725;和McCabe，等，（1988)Biotechnology6:923-926)。还参见，Tomes等， "DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment". 第 197-213 页，PlantCell,TissueandOrganCulture,FundamentalMethods,eds. 0.L.Gamborg&G.C.Phillips.Springer-VerlagBerlinHeidelbergN.Y.，1995 ;美国 专利号 5, 736, 369(分生组织）；Weissinger，等，（1988)Ann.Rev.Genet. 22:421-477; Sanford，等，（1987)ParticulateScienceandTechnology5:27-37 (洋葱）；Christou， 等，（1988)PlantPhysiol. 87:671_674(大豆）；Datta，等，（1990)Biotechnology 8:736-740(水稻）；Klein，等，（1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米）； Klein，等，（1988)Biotechnology6:559_563(玉米）；W091/10725(玉米）；Klein，等， (1988)PlantPhysiol.91:440_444(玉米）；Fromm，等，（1990)Biotechnology8:833-839; 和Gordon-Kamm，等，（1990)PlantCell2:603_618(玉米）；Hooydaas_VanSlogteren &Hooykaas(1984)Nature(英国）311:763_764;Bytebierm，等，（1987)Proc.Natl. Acad.Sci.USA84:5345-5349 (Liliaceae);DeWet，等，（1985)InTheExperimental ManipulationofOvuleTissues,ed.G.P.Chapman,等，pp. 197-209.Longman，N.Y?(花 粉）；Kaeppler，等，（1990)PlantCellReports9:415-418 ;和Kaeppler，等，（1992) Theor.Appl.Genet. 84:560-566 (晶须介导的转化）；美国专利号5, 693, 512 (声处理）； D'Halluin，等，（1992)PlantCell4:1495-1505(电穿孔）；Li，等，（1993)PlantCell Reports12:250-255;和ChristouandFord，（1995)AnnalsofBotany75:407_413(水 稻）；〇sjoda，等，（1996)NatureBiotech. 14:745-750 ;农杆菌介导的玉米转化（美 国专利号 5, 981，840);碳化硅晶须法（Frame，等，（1994)PlantJ. 6:941-948);激光 法（Guo，等，（1995)PhysiologiaPlantarum93:19-24);声处理法（Bao，等，（1997) UltrasoundinMedicine&Biology23:953-959；FinerandFiner, (2000)LettAppl Microbiol. 30:406-10 ;Amoah，等，（2001)JExpBot52:1135-42);聚乙二醇法（Krens，等， (1982)Nature296:72-77);单子叶和双子叶植物细胞的原生质可使用电穿孔（Fromm，等， (1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5824-5828)和显微注射（Crossway，等，（1986)Mol. Gen.Genet. 202:179-185)转化；将其所有引入于此以作参考。
[0140] 用于将表达载体引入植物的最广泛利用的方法是基于农杆菌的自然转化系统。根 癌农杆菌（A.tumefaciens)和毛根农杆菌（A.rhizogenes)为植物病原土壤细菌，其在遗传 学上转化植物细胞。根癌农杆菌和毛根农杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化 的基因。参见，例如Kado，（1991)Crit.Rev.PlantSci. 10:U农杆菌载体系统和农杆菌介导 的基因转移的方法的描述提供于Gruber，等，上述；Miki，等，上述；和Moloney，等，（1989) PlantCellReports8:238〇
[0141] 类似地，基因可插入分别来源于根癌农杆菌或毛根农杆菌的Ti或Ri质粒的T-DNA 区。因此，表达盒可使用这些质粒如上构建。已知许多控制序列当其与异源编码序列结合并 转化至宿主有机体中时相对于原始编码序列的组织/器官特异性在基因表达中显示保真 性。参见例如Benfey和Chua, (1989)Science244:174-81。特别适合的用于这些质粒的控 制序列为在各种靶植物中的基因的组成型叶特异性表达的启动子。其它有用的控制序列包 括来自胭脂碱合酶基因（NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2， 可由美国模式培养物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection)获得并命名为ATCC 67238。如果使用此类系统，则来自Ti或Ri质粒的毒性（vir)基因也必须或者与T-DNA部 分一起或者经其中vir基因存在于单独载体的二元体系存在。在其中使用的此类系统、载 体和转化植物细胞的方法记载于美国专利4, 658, 082号；1986年10月1日提交的美国专 利申请系列号913, 914,参考1993年11月6日公布的美国专利5, 262, 306号；和Simpson, 等，（1986)PlantMol.Biol.6:403-15m，将其全部内容引入于此以作参考。
[0142] 一旦构建，这些质粒可置于毛根农杆菌或根癌农杆菌中以及用于转化通常对镰刀 菌属（Fusarium)或链格孢属（Alternaria)感染敏感的植物物种的细胞的这些载体中。根 癌农杆菌或毛根农杆菌的选择将取决于由此转化的植物。通常根癌农杆菌是优选的转化有 机体。大多数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物（如百合目（Liliales)和天南 星目（Arales)的某些成员）对根癌农杆菌感染敏感。毛根农杆菌还具有广泛的宿主范围， 包含大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科（Leguminosae)、菊科（Compositae) 和藜科（Chenopodiaceae)的成员。如今转化单子叶植物已取得一些成功。欧洲专利申请 604 662A1号公开了使用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利申请672752A1号公 开了使用未成熟胚胎的盾片（scutellum)利用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等 讨论了通过将未成熟胚胎暴露于根癌农杆菌来转化玉米的方法（NatureBiotechnology 14:745-50(1996))。
[0143] 一旦转化，这些细胞可用于再生转基因植物。例如，可通过造成植物创伤然后将 载体引入伤口部位，用这些载体感染整个植物。植物的任何部分可造成创伤，包括叶、茎和 根。可选地，外植体形式的植物组织，例如子叶组织或叶盘可接种这些载体，并在促进植物 再生的条件下培养。通过用包含编码伏马菌素（fumonisin)降解酶基因的毛根农杆菌或根 癌农杆菌接种植物组织而转化的根或嫩枝可用作植物组织来源，从而经体细胞胚胎发生或 器官发生来再生伏马菌素-抗性转基因植物。此类用于再生植物组织的方法的实例公开于 Shahin, (1985)Theor.Appl.Genet. 69:235-40 ;美国专利号 4, 658, 082 ;Simpson,等，上述； 和美国专利申请913, 913和913, 914号，二者均于1986年10月1日提交，参考1993年11 月16日公布的美国专利5, 262, 306号，将其中全部公开内容引入于此以作参考。
[0144] 作为农杆菌-介导的转化的替代方法已开发了几种植物转化方法（统称为直接基 因转移）。
[0145] 植物转化的普遍适用的方法为微粒-介导的转化（mircoprojectile-mediated transformation)，其中在尺寸为约1至4ym的微粒表面上携带DNA。利用将微粒加速至 300至600m/s速度，足以穿透植物细胞壁和膜的生物射弹装置（biolisticdevice)将表 达载体引入的植物组织（Sanford,等，（1987)Part.Sci.Technol. 5:27 ;Sanford, (1988) TrendsBiotech6:299 ;Sanford, (1990)Physiol.Plant79:206;和Klein,等，（1992) Biotechnology10:268)〇
[0146] 物理递送DNA至植物的另一方法为如Zang等描述的靶细胞的声处理（（1991) BioTechnology9:996)。可选地，脂质体或原生质体融合已用于将表达载体引入植物中。 参见例如Deshayes等，（1985)EMB0J.4:2731;和Christou,等，（1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3962。还已报道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接摄取 进入原生质体中。参见例如Hain等，（1985)Mol.Gen.Genet. 199:161 ;和Draper等，（1982) PlantCellPhysiol. 23:451。
[0147] 还记载了原生质体和整个细胞和组织的电穿孔。参见例如Donn等，（1990) AbstractsoftheVllthInt' 1.CongressonPlantCellandTissueCulture IAPTC，A2-38,p.53 ;D，Halluin等，（1992)PlantCell4:1495-505;和Spencer等，（1994) PlantMol.Biol. 24:51-61。
[0148] 稳定转化后，进行植物繁殖。最常见的植物繁殖方法是通过种子。然而，通过种子 繁殖的再生具有使作物中缺少均匀性的杂合性引起的缺陷，这是因为种子是植物根据孟德 尔法则支配的遗传变异而产生的。基本上，每个种子在遗传学上是不同的，且每个将以其自 身特有的特征生长。因此，优选转化植物以使再生植物具有亲本转基因植物同一的特征和 特性这样的方式产生。
[0149] 转化植物可通过微体繁殖（micropropagation)来再生，所述微体繁殖使转化植 物快速、一致的生殖。微体繁殖为由从选择的亲本植物或培养植物中切离的单片组织长成 新一代植物的方法。该方法允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物的规模化繁殖。所产 生的新一代植物在遗传学上与原始植物同一，并具有原始植物所有的特性。微体繁殖使得 优质植物材料在短时间内规模化生产，并使所选栽培植物快速增殖，保留原始转基因或转 化植物的特性。克隆植物的优势为植物增殖速度和所产生的植物优良和一致。
[0150] 微体繁殖为多阶段步骤，需要在阶段之间改变培养基或生长条件。因此，微体繁殖 方法涉及四个基本阶段：阶段一，初始组织培养；阶段二，组织培养增殖；阶段三，分化和植 物形成；和阶段四，温室培养和强化（hardening)。在阶段一初始组织培养期间，建立组织 培养并证实无污染物。在阶段二期间，繁殖初始组织培养物，直至产生足以满足生产目标数 量的组织样品。在阶段三期间，将在阶段二中生长的组织样品分离并生长为单独的小植株。 在阶段四中，将转化的小植株转移至温室来强化，其中植物对光的耐受性逐渐增加，从而可 在自然环境中生长。
[0151] 在某些方面，本发明提供抗植物病原害虫的植物的生产方法，所述方法为用重组 DNA构建体或表达dsRNA的构建体的组合转化植物细胞；由转化的植物细胞再生植物；和在 适于表达所述重组DNA构建体的条件下使转化植物细胞生长。
[0152] 本发明的方法适用于对由RNA干扰产生的基因沉默敏感且能够从其周围环境内 在化dsRNA的Gb物种。本发明适用于处于任何发育阶段的昆虫。由于昆虫具有非生长的 外骨骼，它们不能以均一的速度生长，而是在通过周期性脱落其外骨骼的各阶段中生长。该 过程称为蜕皮或换羽。蜕皮之间的阶段称为"龄"，且根据本发明可靶向这些阶段。另外，根 据本发明还可靶向昆虫的卵或幼虫。根据本发明可靶向包括有翅昆虫的变形在内的发育周 期中的所有阶段。因此，个体阶段如幼虫、蛹、稚虫等发育阶段都可靶向。
[0153] Gb为桉树的害虫。因此，本文所述的核酸、dsRNA和方法对于处理或抑制Gb感染 和侵扰桉树是有用的。
[0154] 实施例
[0155] 实施例1
[0156] Gb转录组测序
[0157]Gb样品从自来自巴西圣保罗州桉树的感染的叶采集。总RNA由在各个发育阶段的 蛹（nymphs)和成虫的混合物获得。将各批100个样品置于冰上的各微管中。然后将管密封 并立即冷冻于液氮中并保存在-80°C直至进一步处理。使用MasterPureRNA纯化试剂盒和 操作手册（MRC85102_EpicentereBiotechnologies)分离总RNA。总RNA体积为 50yl。然 后用DNAse处理总RNA以除去残留DNA，接着分离polyAmRNA(MicroPoly(A)Purist,小规 模mRNA纯化试剂盒，AM1919Ambion)。mRNA终体积为20y1。纯化的mRNA保存在-80°C直 至进行454测序。根据标准操作手册进行454测序，从而提供靶害虫的转录组。组装序列，并 使用罗氏软件包基于与已知公开的半翅目豌豆财（PeaAphidAcyrthosiphonpisum，Ap) 血吸虫的序列比对注释结果，并使用Blast2Go程序（可于http://www.blast2go.org/中 获得）注释。
[0158] 实施例2
[0159] Gb靶基闵和序列的鉴宙
[0160] 特定组织或整个有机体的细胞进程或适当的发育进程所必需的独特的至关重要 的Gb基因鉴定为基因沉默的革E1标。基于公开的黑腹果幡（Drosophilamelanogaster,Dm)) [15, 16]列表中的RNAi文库产生591个显示在RNAi转基因Dm中致死的基因。该列表进一 步缩小为参与翻译、转录和发育的基因。所得140个基因的亚群参与下列中的一种或多种： 蛋白质合成和/或代谢、RNA合成和代谢，和细胞进程。
[0161] 将鉴定为由于果蝇中RNAi而在表达时致死的140个基因的BLAST(NCBI)比较用 于鉴定128个来自豌豆蚜（Ap)的直系同源序列。将鉴定的Ap序列的比较进一步用于筛选 Gb454转录组文库的潜在靶基因。潜在的Gb靶基因限于在开放阅读框中包括至少350bp或 为预测的全长基因的至少50%的Gb454转录组序列。Gb454转录组的筛选鉴定了 27个潜 在的青铜蝽祀标。
[0162] 27个潜在的Gb祀标进一步筛选以鉴定与蜜蜂意蜂（Apismellifera,Ap))序列共 享有限同源性的序列。使用公开可用的NCBIB12Seq分析程序（可于
[0163]http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ?PAGE_TYPE= BlastSearch&PR0G_DEF=blastn&BLAST_PR0G_DEF=megaBlast&SHOff_DEFAULTS= on&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_L0C=align2seq获得）进行比较，以鉴定来自各Gb革巴 标的与相应的Am基因共享限定（即小于80%)同一性的100bp序列（或者，当不能鉴定具 有小于80%的同一性的100bp序列时，鉴定此类序列的较短片段）。鉴定的区域与相应的 蜜蜂序列都显示38-74%的同一性。
[0164] 鉴定的具有与Ap序列限定同源性的各Gb靶基因和序列在SEQIDN0:1-58中示 出。表1示出其中鉴定的具有有限同源性的各Gb靶基因和序列的SEQIDNOs。
[0165] 表1?具有与密峰（意峰（Apis mellifera))序列有限同一十生的Gb革巴基因矛口片段
[0166]

【权利要求】
1. 一种分离的小的抑制性核糖核酸分子（dsRNA)，其抑制Gb的必需基因的表达。
2. 根据权利要求1所述的dsRNA，其包括与来自所述必需基因的至少17个邻接核苷酸 基本上同一的第一链核苷酸和与所述第一链核苷酸基本上互补的第二链核苷酸的单元。
3. 根据权利要求2所述的dsRNA，其中所述核苷酸第一链和第二链为至少约25、35、50、 70或100个核苷酸长度。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的dsRNA，其中所述核苷酸第一链和第二链在它们各 自的长度上与所述必需基因的同一性为70-100 %。
5. 根据权利要求2-4任一项所述的dsRNA，其包括至少两（2)个所述单元。
6. 根据权利要求5所述的dsRNA，其中所述至少两个单元源自不同的必需基因。
7. 根据权利要求6所述的dsRNA，其中所述至少两个单元源自单一物种。
8. 根据权利要求6所述的dsRNA，其中所述至少两个单元源自不同物种。
9. 根据权利要求2-8任一项所述的dsRNA，其进一步包括分隔所述核苷酸第一链和所 述第二链的环区。
10. -种载体，其包括可操作地连接至作为根据权利要求2-9任一项的一条链或两条 链的模板的核苷酸序列的表达控制序列。
11. 一种宿主细胞，其包括根据权利要求10所述的表达载体。
12. -种植物组织，其包括根据权利要求1-9任一项所述的dsRNA。
13. -种植物组织，其包括根据权利要求10所述的载体。
14. 一种植物组织，其包括根据权利要求11所述的宿主细胞。
15. -种分离的核酸，其包括在高严格杂交条件下与选自由SEQ ID N0:30、l-29、31-56 和71-80及其互补序列组成的组的序列选择性杂交的序列。
16. 根据权利要求15所述的分离的核酸，其中所述核酸与所述选自由SEQ ID NO: 1-56 和71-80及其互补序列组成的组的序列的同一性为90-99. 99%。
17. 根据权利要求15或16所述的分离的核酸，其中所述核酸包括选自由SEQ ID NO: 1-56和71-80及其互补序列组成的组的序列的至少17个邻接核苷酸。
18. 根据权利要求17所述的分离的核酸，其中所述核酸包括选自由SEQ ID NO: 1-56和 71-80及其互补序列组成的组的序列的至少25个邻接核苷酸。
19. 根据权利要求15-18任一项所述的分离的核酸，其中所述核酸与所述核酸的蜜蜂 直向同源物的同一性小于约80%。
20. -种载体，其包括可操作地连接至表达控制序列的根据权利要求15-19任一项所 述的分离的核酸。
21. -种宿主细胞，其包括根据权利要求20所述的载体。
22. -种植物组织，其包括根据权利要求20所述的载体。
23. 根据权利要求22所述的植物组织，其中所述组织选自由叶组织、叶脉、韧皮部、木 质部、叶柄、小枝、枝、花、干、果实和种子组成的组。
24. -种分离的小的抑制性核糖核酸分子（siRNA)，其抑制编码CG3590、CG5451、Tef、 eIF3-S8、Hel25E、Uev 1A、Mor、Trip 或 tws 基因的 Gb 核酸分子的表达。
25. -种分离的双链核糖核酸分子（dsRNA)，其包括与SEQ ID NO: 1-56和71-80中所 示的至少17个邻接核苷酸基本上同一的第一链核苷酸和与所述第一链核苷酸基本上互补 的第二链核苷酸的单元。
26. 根据权利要求25所述的分离的dsRNA，其中所述核苷酸第一链与SEQ ID NO: 1-56 和71-80中所示的至少17个邻接核苷酸基本上同一。
27. 根据权利要求25或26所述的分离的dsRNA，其中所述核苷酸第一链和第二链为至 少约25、35、50、70或100个核苷酸长度。
28. 根据权利要求25-27任一项所述的dsRNA，其中所述核苷酸第一链和第二链在它们 各自的长度上与SEQ ID NO: 1-56和71-80的同一性为70-100%。
29. 根据权利要求25-28任一项所述的dsRNA，其中所述核苷酸第一链和第二链的序列 与所述核苷酸第一链和第二链的蜜蜂直向同源物的序列的同一性小于约80%。
30. 根据权利要求25-29任一项所述的dsRNA，其包括至少两（2)个所述单元。
31. 根据权利要求30所述的dsRNA，其中所述至少两个单元源自选自由SEQ ID NO: 1-56和71-80组成的组的不同序列。
32. 根据权利要求25-31任一项所述的dsRNA，其进一步包括分隔所述核苷酸第一链和 所述第二链的环区。
33. -种载体，其包括可操作地连接至作为根据权利要求25-32任一项的一条链或两 条链的模板的核苷酸序列的表达控制序列。
34. -种宿主细胞，其包括根据权利要求33所述的表达载体。
35. 根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述宿主为细菌细胞或酵母细胞。
36. 根据权利要求35所述的宿主细胞，其中所述宿主为农杆菌。
37. -种植物组织，其被根据权利要求36所述的宿主细胞转化。
38. -种植物组织，其包括根据权利要求25-36任一项所述的dsRNA。
39. -种抗害虫植物的生产方法，其包括在所述植物或者在所述植物的繁殖或生殖材 料中表达根据权利要求1-9或权利要求25-32任一项所述的dsRNA。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述植物为桉树。
41. 根据权利要求39或40所述的方法，其中所述害虫为Gb。
42. -种害虫侵扰的抑制方法，其包括培养包含根据权利要求11-18或权利要求25-33 任一项所述的dsRNA的植物，从而抑制所述侵扰。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中所述植物为桉树。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述害虫为Gb。
45. -种抗植物病原害虫的植物的生产方法，其包括： (a) 用表达根据权利要求1-9或权利要求25-32任一项所述的dsRNA的重组DNA构建 体或构建体的组合来转化植物细胞； (b) 由转化的植物细胞来再生植物；和 (c) 在适于所述重组DNA构建体转录的条件下使转化的植物细胞生长， 与未转化植物相比，所述长成的转化植物因此抗所述害虫。
46. 根据权利要求45所述的方法，其进一步包括用表达与所述dsRNA的一条链或其片 段互补的单链RNA的重组DNA构建体转化所述植物细胞。
47. 根据权利要求45或46所述的方法，其中所述植物为桉树。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中所述害虫为Gb。
【文档编号】C12N15/113GK104508134SQ201380033221
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年4月22日 优先权日:2012年4月23日
【发明者】D·阿维萨尔, D·西格尔, Z·萨尼 申请人:富优基尼以色列股份有限公司