用于苯乙烯合成的酶和方法
【专利摘要】本发明的主题技术一般性地涉及生物合成苯乙烯。本发明的主题技术的某些实施方案部分地基于如下认识：苯丙氨酸可通过脱氨和脱羧这样的两步途径转化为苯乙烯，其中反式-肉桂酸(tCA)作为中间物。两种类型的酶直接参与了这一过程，苯丙氨酸解氨酶(PAL)将苯丙氨酸转化为tCA，而肉桂酸脱羧酶将tCA转化为苯乙烯。表达这两种类型的酶的宿主细胞可以在生物反应器中培养，以从可再生的底物(例如葡萄糖)制备苯乙烯。
【专利说明】用于苯乙烯合成的酶和方法
[0001] 并入的序列表
[0002] 本文提供并通过引用并入了一份纸质序列表以及一份计算机可读形式的序列表， 所述序列表包含名为"32990-5_ST25. txt"的文件，该文件的大小（在MS - DOS中测得）为 151，674字节。该序列表由SEQ ID NO :1-44组成。
【背景技术】
[0003] 本发明的主题技术一般性地涉及用于生物合成苯乙烯的酶和方法。
[0004] 苯乙烯（乙烯基苯）是化学式为C8H8的有机化合物。这种环烃是一种无色的、油 状液体，其容易蒸发并且具有甜的类似橡胶的气味。在较高浓度下，苯乙烯发出不那么令人 愉快的气味。苯乙稀是以苏合香树（Styrax platanifolius)命名的，可以从苏合香树提取 汁液（一种安息香树脂）。在几个植物物种中自然存在低水平的苯乙烯。多种食物，例如水 果、蔬菜、坚果、饮料和肉类也含有苯乙烯。
[0005] 在工业上，苯乙烯是聚苯乙烯和几种共聚物的前体。乙烯基的存在使得苯乙烯可 以聚合。每年大约生产150亿镑。美国的苯乙烯生产在20世纪40年代期间急剧增加，当时， 以苯乙烯作为合成橡胶的原料非常流行。现今，商业上显著产品包括聚苯乙烯、丙烯腈-丁 二烯-苯乙烯（ABS)、苯乙烯-丁二烯（SBR)橡胶、苯乙烯-丁二烯胶乳、SIS (苯乙烯-异 戊二烯-苯乙烯）、S-EB-S (苯乙烯-乙烯/ 丁烯-苯乙烯）、苯乙烯-二乙烯基苯（S-DVB)、 苯乙烯-丙烯腈树脂（SAN)和不饱和聚酯。这些材料被用于橡胶、塑料、绝缘材料、玻璃纤 维、管材、汽车和船部件、食品容器和地毯背衬。
[0006] 工业量生产苯乙烯主要来自乙苯，乙苯是由苯与乙烯烷基化而大规模制备的。它 是最重要的石油化工产品之一。有几种方法来生产苯乙烯。乙苯脱氢是最常用的生产方法。 乙苯在气相中与其10-15倍体积的高温蒸汽混合，并经过一个固体催化剂床。绝大部分乙 苯脱氢催化剂基于铁（III)氧化物，由百分之几的氧化钾或碳酸钾促进。蒸汽在这个反应 中起到几个作用。它是用于对吸热反应提供动力的热源，并且它通过水汽变换反应消除了 在所述氧化铁催化剂上形成焦炭的倾向。钾促进剂增强了这种除焦反应。所述蒸汽也稀释 了反应物和产品，使化学平衡的位置向产品转移。一个典型的苯乙烯装置由两个或三个串 联反应器组成，所述反应器在真空下运行，以提高转化率和选择性。对于两个反应器，典型 的单程转化率是约65%;对于三个反应器，典型的单程转化率是70-75%。对苯乙烯的选择 性是93-97%。主要副产物是苯和甲苯。因为苯乙烯和乙苯具有类似的沸点（分别为145 和136°C )，它们的分离需要高大的蒸馏塔和高回流比（return/reflux ratio)。在其蒸馏 温度，苯乙烯倾向于聚合。为了使这个问题最小化，早期苯乙烯装置添加了元素硫以抑制聚 合反应。在20世纪70年代，开发了新的自由基抑制剂，这种新的自由基抑制剂由硝化的苯 酚基缓凝剂组成。最近，已经开发了一些添加剂，它们对聚合显示出优良的抑制作用。
[0007] 由于苯乙烯是用于许多化工产品的基本石油化工产品，所以，迫切需要替代的生 产方法，特别是那些不需要化石燃料作为原料的方法。因此，尽管有可用于生产苯乙烯的方 法，但是，对于有效并且不那么昂贵的制备苯乙烯单体的新方法存在持续需求。
【发明内容】
[0008] 本发明的主题技术一般性地涉及苯乙烯的生物合成。本发明主题技术的一些实施 方案部分地基于如下的认识：苯丙氨酸可通过脱氨和脱羧这样的两步途径转化为苯乙烯， 其中反式肉桂酸（tCA)作为中间物。两种类型的酶直接参与了这一过程，苯丙氨酸解氨酶 (PAL)将苯丙氨酸转化为tCA，而肉桂酸脱羧酶将tCA转化为苯乙烯。表达这两种类型的酶 的宿主细胞可以在生物反应器中培养，以从可再生的底物（例如葡萄糖）制备苯乙烯。
[0009] 在一个方面，本发明的主题技术涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：（a)包含 苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（b)包含肉桂酸脱羧酶的第二域。
[0010] 在某些实施方案中，所述苯丙氨酸解氨酶源自选自下组的一种有机体： Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。在一个不例性实施方案中，所述苯丙氨 酸解氨酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6,以及它们 的功能性片段或变体。
[0011] 在某些实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶源自选自下组的一种有机体： Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。在一个不例性实施方案中，所述肉桂酸 脱羧酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO :8、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：28, SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:38,以及它们的功能 性片段或变体。例如，所述肉桂酸脱羧酶可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO :8、 SEQ ID N0：10,SEQ ID N0：16,SEQ ID N0：18,SEQ ID N0：20,SEQ ID N0：22,SEQ ID NO： 24, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：30, SEQ ID NO ：32, SEQ ID NO ：34, SEQ ID NO :36 以及 SEQ ID NO :38。
[0012] 肉桂酸脱羧酶的功能性变体可以包含与SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：26, SEQ ID ΝΟ:28、5Ε0ΙΟΝΟ:30、5Ε0ΙΟΝΟ:32、5Ε0ΙΟΝΟ :34、5Ε0ΙΟΝΟ:36#&5Ε0ΙΟΝΟ:38φ 任一个有约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%，约99%或甚至100%-致性 的氨基酸序列。可选地，或另外，肉桂酸脱羧酶的功能性变体可以包含：对应于SEQ ID NO: 8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO :8的 残基175位置的R、对应于SEQ ID NO :8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO :8的残基 189位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO :8的残基194 位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO :8的残基286位置 的M、对应于SEQ ID NO :8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO :8的残基440位置 的F。
[0013] 在某些实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶可以包含一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述 突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO :8的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、 196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、441 位或它们的 组合。例如，所述突变的肉桂酸脱羧酶可以包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处 的突变：SEQ ID NO :8的第175、190、193位，以及它们的组合。
[0014] 在某些实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶可以包含一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述 突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的选自如下一个位置的氨基酸残基的缺失、取 代或添加：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、 193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、 441位，以及它们的组合。例如，可以用另一种氨基酸残基取代在以下一个位置中的氨基酸 残基：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、 191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440或441位。在另一个实例中，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在以下一个位置的氨基 酸残基的缺失、取代或添加 ：SEQ ID NO :8的第175、190、193位，以及它们的组合。
[0015] 在一个实施方案中，本发明主题技术的融合蛋白还包含共价连接所述第一域和所 述第二域的连接体。本文所述的融合蛋白的连接体可以是一种肽连接体，例如一种包含 2-15个氨基酸的肽连接体。例如，肽连接体可以包括在表1中所示的那些。
[0016] 本发明还提供了核酸、载体和宿主细胞，所述核酸编码本文所述的融合蛋白，所述 载体包含编码所述融合蛋白的所述核酸，所述宿主细胞包含本文所述的载体。
[0017] 在一个方面，本发明主题技术涉及一种用于生产苯乙烯的方法，所述方法包括（a) 使宿主细胞与可发酵底物（优选碳底物或氮底物）接触，所述宿主细胞包含一种融合蛋白， 所述融合蛋白包含：（i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（ii)包含肉桂酸脱羧酶的第 二域；以及（b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。所述方法还可以包括从 所述细胞培养物中收获苯乙烯。本文所述的融合蛋白中的任何一种都可以被用于生产苯乙 烯。
[0018] 在一个方面，本发明主题技术涉及一种肉桂酸脱羧酶，所述肉桂酸脱羧酶包含： (a) SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :36 以及 SEQ ID NO :38 中的任一个；（b)与 SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：30, SEQ ID NO ：32, SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:36、以及SEQ ID N0:38 中任一个有约 85%、约 90%、约 95%、约 97%、 约98%，约99%或甚至100%-致性的氨基酸序列，其条件是所述氨基酸序列不是SEQ ID NO :8 ;或者（c) : (a)或（b)的功能性片段。
[0019] 在某些实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶包含：对应于SEQ ID NO :8的残基173位 置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO :8的残基175位置的 R、对应于SEQ ID NO :8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO :8的残基189位置的I、对 应于SEQ ID NO :8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO :8的残基194位置的I、对应于 SEQ ID NO :8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO :8的残基286位置的M、对应于SEQ ID NO :8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO :8的残基440位置的F。
[0020] 在某些实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶包含下列中的任一个：SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：28, SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:36、以及 SEQ ID N0:38。
[0021] 本发明的主题技术还涉及一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包 含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID N0:8的第155、156、159、162、 163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、 285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、441 位，以及它们的组合。例如，所 述突变的肉桂酸脱羧酶可以包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO :8的第175、190、193位以及它们的组合。
[0022] 在某些实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的选自如下一 个位置中的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、 175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、 331、360、361、395、396、398、440、441位，以及它们的组合。在某些实施方案中，所述突变为 取代。
[0023] 在某些实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的以下一个位 置中的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第175、190、193位，以及它们的组合。
[0024] 本发明还提供了编码本文所述的肉桂酸脱羧酶的核酸、包含本文所述的肉桂酸脱 羧酶的宿主细胞、以及包含本文所述的核酸的宿主细胞。
[0025] 本发明的主题技术还涉及一种用于生产苯乙烯的方法，所述方法包括：(a)使宿 主细胞与可发酵底物（优选碳底物或氮底物）接触，所述宿主细胞包含（i)本文所述的苯 丙氨酸解氨酶和（ii)本文所述的肉桂酸脱羧酶；以及（b)在培养基中培养所述细胞足够时 间以产生苯乙烯。
[0026] 本发明的主题技术还涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a)如本文所述的 重组表达的苯丙氨酸解氨酶；(b)如本文所述的重组表达的肉桂酸脱羧酶；以及（c)如本文 所述的重组表达的膜结合转运体。所述苯丙氨酸解氨酶和所述肉桂酸脱羧酶可以被表达为 两种单独的蛋白质，或者可以通过如本文所述的连接体共价连接。
[0027] 在一个实施方案中，所述膜结合转运体是ATP结合盒转运体（ABC转运体）。例如， 所述ABC转运体是一种细菌ABC转运体，例如源自Pseudomonas putida。优选地，所述ABC 转运体是一种耐溶剂性外排泵，例如源自Pseudomonas putida S12的SrpABC泵。
[0028] 本发明的主题技术还提供了一种用于筛选候选蛋白的突变的肉桂酸脱羧酶活性 的方法，所述方法包括：(a)提供一种包含候选蛋白的蛋白质样品以及一种选自以下的底 物：苯丙氨酸、反式肉桂酸、酪氨酸、香豆酸以及它们的组合；(b)将所述蛋白质样品和所述 底物样品结合以形成混合物，并在一定条件下培育所述混合物，所述条件为使得突变的肉 桂酸脱羧酶将所述底物转化成选自由苯乙烯、4-羟基苯乙烯以及它们的组合组成的组的产 品；以及（c)将所述混合物暴露于包括聚合物树脂的检测材料之中，所述聚合物树脂吸收 产物蒸气。在一个实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶能够以与野生型酶（例如FDCl) 相当的或高于野生型酶的速率将反式肉桂酸转化为苯乙烯。在另一个实施方案中，所述突 变的肉桂酸脱羧酶能够以与野生型酶相当的或高于野生型酶的速率将香豆酸转化为4-羟 基苯乙烯。在某些实施方案中，所述候选蛋白包括包含突变的肉桂酸脱羧酶的融合蛋白。
[0029] 在一个实施方案中，本发明的主题技术还涉及一种用于筛选候选蛋白的肉桂酸脱 羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供一种包含候选蛋白的蛋白质样品以及一种包含 反式肉桂酸的底物样品；(b)将所述蛋白质样品和所述底物样品结合以形成混合物，并在 一定条件下培育所述混合物，所述条件为使得肉桂酸脱羧酶将反式肉桂酸转化成苯乙烯； 以及（c)将所述混合物暴露于包括聚合物树脂的检测材料之中，所述聚合物树脂吸收产物 蒸气。
[0030] 在某些实施方案中，所述检测材料还包括在苯乙烯的存在下导致颜色变化的可检 测的标记物。例如，所述可检测的标记物可以是4-硝基苄基-吡啶。可以将所述检测材料 附着于固体支持物。在某些实施方案中，所述聚合物树脂包含芳族官能团。
[0031] 在某些实施方案中，可以通过分光光度法检测颜色的变化。例如，可以通过在约 600nm波长下测量样品的吸收率来检测颜色的变化。
[0032] 本文所述的筛选方法可以用于同时筛选多个候选蛋白。
[0033] 本发明的主题技术还涉及一种分离重组生成的肉桂酸脱羧酶的方法，所述方法 包括：(a)提供一种包含一种核酸的细菌宿主，所述核酸编码肉桂酸脱羧酶，并可操作地连 接至启动子序列；(b)在培养基中培养所述细菌宿主以在宿主细胞中表达所述肉桂酸脱羧 酶，其中，在约l〇°C至约25°C的温度下培养所述宿主细胞；以及（c)将所述肉桂酸脱羧酶从 所述宿主细胞分离，其中，在厌氧环境下进行所述分离。
[0034] 在某些实施方案中，用于分离所述肉桂酸脱羧酶的一种或多种缓冲溶液包含还原 剂，例如三（2-羧乙基）膦（TCEP)、β-巯基乙醇以及它们的组合。
[0035] 本发明的主题技术还涉及一种结晶肉桂酸脱羧酶的方法，所述方法包括：（a)提 供浓度为约lmg/ml至约50mg/ml的肉桂酸脱羧酶溶液；(b)将所述肉桂酸脱羧酶溶液与IC 存溶液以约1:10至约10:1的体积比混合；以及（c)将所述肉桂酸脱羧酶溶液和贮存溶液 的混合物保持在适合所述肉桂酸脱羧酶形成晶体的温度下。
[0036] 本发明的主题技术还涉及一种肉桂酸脱羧酶的晶体，其中，所述肉桂酸脱羧酶处 于与3-羟基肉桂酸的复合物之中。
[0037] 本发明的主题技术还涉及一种用于生产苯乙烯的方法，所述方法包括：(a)使宿 主细胞与一种可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含：（i)苯丙氨酸解氨酶；以及（ii)肉桂 酸脱羧酶；以及（b)在培养基中培养所述宿主细胞足够时间以产生苯乙烯，其中，通过吸收 材料吸收所述苯乙烯产物的蒸汽。
[0038] 一种用于同时筛选苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括： (a)提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：（i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（ii) 包含肉桂酸脱羧酶的第二域；(b)在一定条件下将述融合蛋白和所述底物混合，所述条件 为使得所述融合蛋白将所述底物转化成产物；以及（c)检测所述剩余底物的量、或所述产 物的量、或它们的组合。在某些实施方案中，所述筛选包括检测所述底物的损失、或产物 (例如反式肉桂酸、苯乙烯和苯乙烯的下游衍生物）的量。例如，所述筛选可以包括检测反 式肉桂酸、或苯乙烯或它们的组合的量。
[0039] 例如根据以下描述的多个方面阐明了本发明的主题技术。方便起见，将本发明主 题技术的多方面的多个实施例描述为编号的分句（1、2、3等）。这些被作为例子而提供，并 不限制本发明的主题技术。应该注意的是：可以将任意从属分句组合成任意组合，并放入至 各自的独立分句，例如，第1分句或第17分句。能够以类似的方式表现其它分句。
[0040] 1、一种融合蛋白，其包括：（i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（ii)包含肉桂 酸脱羧酶的第二域；以及（iii)共价连接所述第一域和所述第二域的连接体。
[0041] 2、第1分句所述的融合蛋白，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自选自下组的一种有 机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0042] 3、第1分句或第2分句所述的融合蛋白，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含选自下组 的氨基酸序列：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、以及它们的功能性片段或变体。
[0043] 4、第1-3分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶源自选自下 组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0044] 5、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下 组的氨基酸序列：SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38，以及它们的 功能性片段或变体。
[0045] 6、第5分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸序 列：SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。
[0046] 7、第5分句所述的融合蛋白，其中，所述功能性变体包含与SEQ ID NO :8、10、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一个有约85% -致性的氨基酸序列。
[0047] 8、第5分句或第7分句所述的融合蛋白，其中，所述功能性变体包含：对应于SEQ ID NO :8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO: 8的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO :8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO :8的 残基189位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO :8的残基 194位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO :8的残基286 位置的M、对应于SEQ ID NO :8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO :8的残基440 位置的F。
[0048] 9、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变 的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置上 的突变：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440 或 441 位。
[0049] 10、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变 的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置上 的突变：SEQ ID NO :8的第175或190位。
[0050] 11、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变 的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一个位置处的氨 基酸残基的缺失、取代或添加：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、 396、398、440 或 441 位。
[0051] 12、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变 的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一个位置处的氨基 酸残基的取代：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、 192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440 或 441 位。
[0052] 13、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变 的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一个位置处的氨基 酸残基的缺失、取代或添加：第175或190位。
[0053] 14、第1-13分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述连接体为一种包含2-15 个氨基酸的肽连接体。
[0054] 15、第1-14分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述连接体为一种基本上由 甘氨酸和丝氨酸组成的肽连接体。
[0055] 16、第1-15分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述连接体包含如在SEQ ID NO :39-44的任一个中所列出的氨基酸序列。
[0056] 17、一种编码第1-16分句所述的任一种融合蛋白的核酸。
[0057] 18、一种包含第1-16分句所述的任一种融合蛋白的宿主细胞。
[0058] 19、一种包含第17分句所述核酸的宿主细胞。
[0059] 20、一种用于生产苯乙烯的方法，其包括：（a)使宿主细胞与可发酵碳底物接触， 所述宿主细胞包含一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：（i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域， (ii)包含肉桂酸脱羧酶的第二域；以及（iii)共价连接所述第一域和所述第二域的连接 体；(b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。
[0060] 21、第20分句所述的方法还包括从所述细胞培养物中收获苯乙烯。
[0061] 22、第20分句或第21分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自选自下组 的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0062] 23、第20-22分句中任一分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含选自下 组的氨基酸序列：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6,以及它们的功能性片段或变 体。
[0063] 24、第20-23分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶源自选自下组 的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0064] 25、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组 的氨基酸序列：SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38，以及它们的功 能性片段或变体。
[0065] 26、第25分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸序列： SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。
[0066] 27、第25分句所述的方法，其中，所述功能性变体包含与SEQ ID NO :8、10、16、18、 20、22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一个有约85% -致性的氨基酸序列。
[0067] 28、第25分句或第27分句所述的方法，其中，所述功能性变体包含：对应于SEQ ID NO :8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO :8 的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO :8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO :8的残 基189位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO :8的残基194 位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO :8的残基286位置 的M、对应于SEQ ID NO :8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO :8的残基440位置 的F。
[0068] 29、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的 肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的 突变：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、 191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、 440 或 441 位。
[0069] 30、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的 肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的 突变：SEQ ID NO :8的第175或190位。
[0070] 31、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的 肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一个位置处的氨基酸 残基的缺失、取代或添加：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、 191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440 或 441 位。
[0071] 32、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的 肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一个位置处的氨基 酸残基的取代：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、 192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440 或 441 位。
[0072] 33、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的 肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一个位置处的氨基酸 残基的缺失、取代或添加：第175或190位。
[0073] 34、第20-33分句中任一分句所述的方法，其中，所述连接体为一种包含2-15个氨 基酸的肽连接体。
[0074] 35、第20-34分句中任一分句所述的方法，其中，所述连接体为一种基本上由甘氨 酸和丝氨酸组成的肽连接体。
[0075] 36、第20-35分句中任一分句所述的方法，其中，所述连接体包含如SEQ ID NO: 39-44的任一个所列出的氨基酸序列。
[0076] 37、一种肉桂酸脱羧酶，其包含：（i)SEQ ID NO :16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36 和 38 的任意一个；（ii)与 SEQ ID NO :16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 和 38 中任一个有约85%-致性的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列不是SEQ ID N0:8;或 (iii) :(i)或（ii)的功能性片段。
[0077] 38、第27分句所述的肉桂酸脱羧酶，其中，所述氨基酸序列包含：对应于SEQ ID NO :8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO :8 的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO :8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO :8的残 基189位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO :8的残基194 位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO :8的残基286位置 的M、对应于SEQ ID NO :8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO :8的残基440位置 的F。
[0078] 39、第37分句或第38分句所述的肉桂酸脱羧酶，其包含SEQ ID NO :16、18、20、22、 24、26、28、30、32、34、36 和 38 的任意一个。
[0079] 40、一种突变的肉桂酸脱羧酶，其包含对应下列一个位置的氨基酸残基位置处的 突变：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、 191、 192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、 440 或 441 位。
[0080] 41、第40分句所述的突变的肉桂酸脱羧酶，其包含对应于下列一个位置的氨基酸 残基位置处的突变：SEQ ID NO :8的第175或190位。
[0081] 42、一种突变的肉桂酸脱羧酶，其包含在SEQ ID NO :8的下列一个位置处的氨基酸 残基的缺失、取代或添加：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440 或 441 位。
[0082] 43、第42分句所述的突变的肉桂酸脱羧酶，其包含在SEQ ID NO :8的下列一个 位置处的氨基酸残基的取代：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、 396、398、440 或 441 位。
[0083] 44、第42分句所述的突变的肉桂酸脱羧酶，其包含在SEQ ID NO :8的下列一个位 置处的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第175或190位。
[0084] 45、一种编码第37-44分句所述的肉桂酸脱羧酶的核酸。
[0085] 46、一种包含第37-44分句所述的肉桂酸脱羧酶的宿主细胞。
[0086] 47、一种包含第45分句所述是核酸的宿主细胞。
[0087] 48、一种用于生产苯乙烯的方法，其包括：（a)使宿主细胞与可发酵碳底物接触， 所述宿主细胞包含：（i)苯丙氨酸解氨酶；以及（ii)第37-44分句中任一分句所述的肉桂 酸脱羧酶；(b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。
[0088] 49、第48分句所述的方法还包括从所述细胞培养物中收获苯乙烯。
[0089] 50、第48分句或第49分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自选自下组 的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0090] 51、第48-50分句中任一分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含选自下 组的氨基酸序列：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、以及它们的功能性片段或变 体。
[0091] 52、一种宿主细胞，其包含：（i)重组表达的苯丙氨酸解氨酶；（ii)重组表达的肉 桂酸脱羧酶；以及（iii)重组表达的ABC转运体。
[0092] 53、第52分句所述的宿主细胞，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自选自下组的一种 有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0093] 54、第52或53分句所述的宿主细胞，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含选自下组的 氨基酸序列：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、以及它们的功能性片段或变体。
[0094] 55、第52-54分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶源自选自 下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0095] 56、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自 下组的氨基酸序列：SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、以及它们 的功能性片段或变体。
[0096] 57、第56分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸 序列：SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。
[0097] 58、第56分句所述的宿主细胞，其中，所述功能性变体包含与SEQ ID NO :8、10、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一个有约85% -致性的氨基酸序列。
[0098] 59、第56分句或第58分句所述的宿主细胞，其中，所述功能性变体包含：对应于 SEQ ID NO :8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO :8的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO :8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO: 8的残基189位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO :8的 残基194位置的I、对应于SEQ ID NO :8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO :8的残基 286位置的M、对应于SEQ ID NO :8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO :8的残基 440位置的F。
[0099] 60、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突 变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置 处的突变：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440 或 441 位。
[0100] 61、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突 变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置 处的突变：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、 191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440 或 441 位。
[0101] 62、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突 变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置 处的突变：SEQ ID NO :8的第175或190位。
[0102] 63、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突 变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一个位置处的氨 基酸残基的缺失、取代或添加：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、 396、398、440 或 441 位。
[0103] 64、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突 变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一个位置处的 氨基酸残基的取代：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、 191、 192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、 440 或 441 位。
[0104] 65、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突 变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一个位置处的氨 基酸残基的缺失、取代或添加：第175或190位。
[0105] 66、第52-65分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，通过一种连接体共价连接所 述苯丙氨酸解氨酶和所述肉桂酸脱羧酶。
[0106] 67、第66分句所述的宿主细胞，其中，所述连接体为一种包含2-15个氨基酸的肽 连接体。
[0107] 68、第66分句或第67分句所述的宿主细胞，其中，所述连接体为一种基本上由甘 氨酸和丝氨酸组成的肽连接体。
[0108] 69、第66-68分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述连接体包含如在SEQ ID NO :39-44中所列出的氨基酸序列。
[0109] 70、第52-69分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述ABC转运体是一种细菌 ABC转运体。
[0110] 71、第52-70分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述ABC转运体源自 Pseudomonas Putida0
[0111] 72、第52-71分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述ABC转运体是一种耐溶 剂性外排泵。
[0112] 73、第52-72分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述ABC转运体是源自 Pseudomonas putida S12 的 SrpABC 泵。
[0113] 74、一种用于筛选候选蛋白的肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供 一种包含所述候选蛋白的蛋白质样品以及一种包含反式肉桂酸的底物样品；(b)将所述蛋 白质样品和所述底物样品结合以形成混合物，并在一定条件下培育所述混合物，所述条件 为使得肉桂酸脱羧酶将反式肉桂酸转化成苯乙烯；以及（c)将所述混合物暴露于检测材料 之中，所述检测材料包括（i)吸收苯乙烯蒸气的聚合物树脂；以及（ii) 一种在苯乙烯的存 在下导致颜色变化的可检测的标记物；其中，所述检测材料指示所述候选蛋白具有肉桂酸 脱羧酶活性。
[0114] 75、第74分句所述的方法还包括将所述候选蛋白的活性与对照相比较。
[0115] 76、第74分句或第75分句所述的方法，其中，将所述检测材料附着于固体支持物。
[0116] 77、第74-76分句中任一分句所述的方法，所述聚合物树脂包含芳族官能团。
[0117] 78、第74-77分句中任一分句所述的方法，其中，通过分光光度法检测所述颜色的 变化。
[0118] 79、第74-78分句中任一分句所述的方法，所述可检测的标记物是4-硝基苄 基-吡啶。
[0119] 80、第79分句所述的方法，其中，通过在约600nm波长下测量所述样品的吸收率来 检测所述颜色的变化。
[0120] 81、第74-80分句中任一分句所述的方法，其中，同时筛选多个候选蛋白。
[0121] 82、一种分离重组生成的肉桂酸脱羧酶的方法，所述方法包括：(a)提供一种包含 一种核酸的细菌宿主，所述核酸编码肉桂酸脱羧酶并可操作地连接至启动子序列；(b)在 培养基中培养所述细菌宿主以在所述宿主细胞中表达所述肉桂酸脱羧酶，其中，在约l〇°C 至约25°C的温度下培养所述宿主细胞；以及（c)将所述肉桂酸脱羧酶从所述宿主细胞分 离，其中，在厌氧环境下进行所述分离。
[0122] 83、第82分句所述的方法，其中，用于分离所述肉桂酸脱羧酶的一种或多种缓冲 液包含还原剂。
[0123] 84、第83分句所述的方法，其中，所述还原剂为三（2-羧乙基）膦（TCEP)或β -巯 基乙醇。
【专利附图】
【附图说明】
[0124] 图IA是酵母FDCl的预测结构的示意图。图IB示出了 FDCl中四个可能的tCA结 合位点（位点A-D)。图IC示出了酵母FDCl中预测的底物（tCA)结合位点。
[0125] 图2A示出了 37°C下FDCl在E. coli中的表达，使用了三种不同的缓冲液。重组生 成的FDCl仅累积在不溶性颗粒部分（包涵体）。图2B示出了 16°C下FDCl在E. coli中的 表达。在上清液中检测可溶性FDC1。
[0126] 图3示出了纯化的FDCl的SDS-PAGE分析。
[0127] 图4示出了 pH对FDCl活性的影响。酶在pH 6. 5时表现出最大活性，并且被认为 是具有100%的相对活性。X轴表示不同反应缓冲液的pH值。
[0128] 图5示出了 FDCl的pH稳定性。酶表现出良好的pH稳定性。当在反应前在pH 6. 0 时培育30分钟时，没有损失任何活性，并且被认为是具有100%的相对活性。X轴表示在酶 促反应之前培育蛋白质30分钟时的pH值。
[0129] 图6示出了温度对FDCl活性的影响。当在50°C下进行反应时，酶表现出最大活 性，并且被认为是具有100%的相对活性。X轴表示进行酶促反应时的温度。
[0130] 图7示出了 FDCl的温度稳定性。在50°C时，酶表现出最大活性，并且当在反应前 在50°C下培育30分钟时，没有损失任何活性（其被认为是具有100%的相对活性）。X轴 表示在酶促反应前培育所述酶的温度。
[0131] 图8示出了 FDCl在50°C下经过不同时间段的温度稳定性。在反应前在50°C下培 育30分钟后，酶表现出最大活性，并且被认为是具有100%的相对活性。X轴表示在酶促反 应前在50°C时培育所述酶的时间段（以分钟计）。
[0132] 图9示出了辅因子对FDCl活性的影响。比活性表示为每分钟每毫克酶生成的纳 摩尔苯乙烯。
[0133] 图IOA示出了金属离子对FDCl活性的影响。图IOB示出了 Zn2+和Fe3+对FDCl活 性的影响。比活性表示为每分钟每毫克酶生成的纳摩尔苯乙烯。
[0134] 图11示出了 FDCl的底物特异性。当反式肉桂酸作为底物时，酶表现出最大活性， 并且被认为是具有100%的相对活性。
[0135] 图12A和12B描绘FDCl的动力学分析。X轴表示使用不同浓度的底物的酶促反 应。比活性表示为每分钟每毫克酶生成的纳摩尔苯乙烯。
[0136] 图13描述了生成FDC突变体的随机诱变的过程，和FDCl突变体的高通量比色筛 选。
[0137] 图14示出了由FDCl突变体生产苯乙烯。Y轴表示通过FDCl突变体生产的苯乙烯 的量。X轴表示FDCl突变体的改变的氨基酸。
[0138] 图15显示FDC-PAL融合蛋白的活性。X轴示出了连接体的长度。
[0139] 图16是FDC-PAL融合蛋白的预测结构的示意图。
[0140] 图17示出了 ABC转运体的共表达显著提高了苯乙烯的生产。
[0141] 图18A示出了从葡萄糖生产苯乙烯和tCA。
[0142] 图18B示出了由反式肉桂酸或苯丙氨酸生产苯乙烯。
[0143] 图19示出了在培养管（左）的顶部或在96孔培养板（右）的顶部使用 STRATA-X? 树脂。
[0144] 图20示出纯化的FDCl的SDS-PAGE分析。
[0145] 图21A示出了 FDC(K190E)的晶体结构的初始模型的典型电子密度图。
[0146] 图2IB示出了 FDC(K190E)的晶体结构的不对称单元。 具体实施方案
[0147] A.综述
[0148] 本发明的主题技术一般性地涉及苯乙烯的生物合成。本发明主题技术的一些实施 方案部分地基于如下的认识：苯丙氨酸可通过脱氨和脱羧这样的两步途径转化为苯乙烯， 其中反式-肉桂酸（tCA)作为中间物。两种类型的酶直接参与了这一过程，苯丙氨酸解氨 酶（PAL)将苯丙氨酸转化为tCA，而肉桂酸脱羧酶将tCA转化为苯乙烯。表达这两种类型的 酶的宿主细胞可以在生物反应器中培养，以从可再生的底物（例如葡萄糖）制备苯乙烯。
[0149]
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其包括：(a)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（b)包含肉桂酸脱 羧酶的第二域。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含选自下组的氨基 酸序列：SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、以及它们的功能性片段或变体。
3. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸 序列：SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、SEQIDN0:16、SEQIDN0:18、SEQIDN0:20、SEQID NO：22,SEQIDNO：24,SEQIDNO：26,SEQIDNO：28,SEQIDNO：30,SEQIDNO：32,SEQ IDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38,以及它们的功能性片段或变体。。
4. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱 羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于选自下组的一个位置的氨基酸残基位置处的突 变：SEQIDN0:8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、 191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440、441位、以及它们的组合。
5. 根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述突变在对应于选自下组的一个位置的 氨基酸残基位置处：SEQIDNO:8的第175和190位，以及它们的组合。
6. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其还包含共价连接所述第一域和所述第二域的连 接体。
7. 根据权利要求6所述的融合蛋白，其中，所述连接体是一种包含2-15个氨基酸的肽 连接体。
8. 根据权利要求7所述的融合蛋白，其中，所述连接体选自下组：GS、GSG、SEQID N0:39、SEQIDN0:40、SEQIDN0:41、SEQIDN0:42、SEQIDN0:43、SEQIDN0:44。
9. 一种编码根据权利要求1所述的融合蛋白的核酸。
10. -种包含根据权利要求9所述的核酸的载体。
11. 一种包含根据权利要求10所述的载体的宿主细胞。
12. -种生产苯乙烯的方法，所述方法包括： (a)使宿主细胞与可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含根据权利要求1所述的融合 蛋白；以及 (b) 在培养基中培养所述宿主细胞足够时间以产生苯乙烯。
13. -种肉桂酸脱羧酶，其包含一个对应于选自下组的一个位置的氨基酸残基位置处 的突变：SEQIDNO:8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、 396、398、440、441位，以及它们的组合。
14. 根据权利要求13所述的肉桂酸脱羧酶，其中，所述突变在对应于选自下组的一个 位置的氨基酸残基位置处：SEQIDNO:8的第175、190、193位，以及它们的组合。
15. 根据权利要求13所述的肉桂酸脱羧酶，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的 氨基酸序列：SEQIDN0:16、SEQIDN0:18、SEQIDN0:20、SEQIDN0:22、SEQIDN0:24、 SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36, SEQIDN0:38,以及它们的功能性片段。
16. -种编码根据权利要求13所述的肉桂酸脱羧酶的分离的核酸。
17. -种包含根据权利要求16所述的分离的核酸的载体。
18. -种包含根据权利要求17所述的载体的宿主细胞。
19. 一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括： (a) 使宿主细胞与可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含（i) 一种苯丙氨酸解氨酶；以 及（ii)根据权利要求13所述的肉桂酸脱羧酶；以及 (b) 在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。
20. -种宿主细胞，其包含：（a) -种重组表达的苯丙氨酸解氨酶；(b) -种重组表达的 肉桂酸脱羧酶；以及（c) 一种重组表达的膜结合转运体。
21. 根据权利要求20所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸 脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在对应于选自下组的一个位置的氨基酸残基位置处 的突变：SEQIDNO:8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、 396、398、440、441位，以及它们的组合。
22. 根据权利要求20所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基 酸序列：SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、SEQIDN0:16、SEQIDN0:18、SEQIDN0:20、SEQID N0:22、SEQIDN0:24、SEQIDN0:26、SEQIDN0:28、SEQIDN0:30、SEQIDN0:32、SEQID NO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38,以及它们的功能性片段或变体。
23. 根据权利要求20所述的宿主细胞，其中，所述膜转运体一种细菌ABC转运体。
24. -种生产苯乙烯的方法，所述方法包括： (a) 使根据权利要求20所述的宿主细胞与可发酵碳底物接触；以及 (b) 在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。
25. -种用于筛选候选蛋白的突变的肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括： (a) 提供一种包含候选蛋白的蛋白质样品以及一种选自下组的底物：苯丙氨酸、反式 肉桂酸、酪氨酸、香豆酸、以及它们的组合； (b) 将所述蛋白质样品和所述底物样品结合以形成混合物，并在一定条件下培育所述 混合物，所述条件为使得突变的肉桂酸脱羧酶将所述底物转化成选自由苯乙烯、4-羟基苯 乙烯、以及它们的组合组成的组的产物；以及 (c) 将所述混合物暴露于包括聚合物树脂的检测材料之中，所述聚合物树脂吸收产物 蒸气。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述检测材料还包括在产物的存在下导致颜 色变化的可检测的标记物。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中，所述可检测的标记物是4-硝基苄基-吡啶。
28. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述聚合物树脂是一种疏水树脂。
29. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述候选蛋白包括包含突变的肉桂酸脱羧酶 的融合蛋白。
30. -种结晶肉桂酸脱羧酶的方法，所述方法包括： (a) 提供浓度为约lmg/ml至约50mg/ml的肉桂酸脱羧酶溶液； (b) 将所述肉桂酸脱羧酶溶液与贮存溶液以约1:10至约10:1的体积比混合；以及 (c) 将步骤（b)所述的混合物保持在适合所述肉桂酸脱羧酶形成晶体的温度下。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中，在步骤（a)中所述肉桂酸脱羧酶的浓度为约 5mg/ml至约 10mg/ml。
32. 根据权利要求30所述的方法，其中，在步骤（b)中所述体积比为约1:2至约2:1。
33. 根据权利要求30所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶处于与选自下组的小分 子的复合物之中：反式-肉桂酸、3-羟基肉桂酸、阿魏酸、2-甲基肉桂酸、4-羟基肉桂酸、 3, 4-二甲氧基肉桂酸、2, 5-二甲氧基肉桂酸、以及它们的组合。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中，步骤（b)的混合物中的小分子的最终浓度为约 0.01% (w/v)至约 1% (w/v)。
35. 根据权利要求30所述的方法，其中，步骤（b)的混合物还包含一种选自下组的添加 剂：MnCl2、聚乙烯吡咯烷酮K15、非洗涤剂磺基甜菜碱201、苄脒盐酸盐、以及它们的组合。
36. 根据权利要求30所述的方法，其中，所述步骤（c)的温度为约4°C至约12°C。
37. 根据权利要求30所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含与SEQIDNO:8有至少 85 % -致性的氨基酸序列。
38. -种肉桂酸脱羧酶的晶体，其中，所述肉桂酸脱羧酶处于与3-羟基肉桂酸的复合 物之中。
39. 根据权利要求38所述的晶体，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含SEQIDNO: 16所示的 氨基酸序列。
40. 根据权利要求39所述的晶体，其中，所述晶体具有晶胞参数a= 249.51A、b= 120.67A、c=158.49A、0 =94.9° 〇
41. 一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括： (a) 使宿主细胞与一种可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含：（i) 一种苯丙氨酸解氨 酶；以及（ii) 一种肉桂酸脱羧酶；以及 (b) 在培养基中培养所述宿主细胞足够时间以产生苯乙烯，其中，通过吸收材料吸收所 述苯乙烯产物的蒸汽。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中，所述吸收材料选自下组：聚合物树脂、活性炭、 纤维素材料、以及它们的组合。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中，所述聚合物树脂是一种疏水树脂。
44. 根据权利要求42所述的方法，其中，所述聚合物树脂选自下组：C18、C8、苯基、 SDB-L吸附剂树脂、以及它们的组合。
45. -种同时筛选苯丙氨酸解氨酶活性和肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括： (a)提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：（i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（ii) 包含肉桂酸脱羧酶的第二域； (b) 提供选择下组的底物：苯丙氨酸、反式-肉桂酸、酪氨酸、香豆酸、以及它们的组 合； (c) 在一定条件下培育所述融合蛋白和所述底物，所述条件为使得所述融合蛋白将所 述底物转化成选自下组的产物：苯乙烯、4-羟基苯乙烯、以及它们的组合；以及 (d) 检测剩余底物的量、或所述产物的量、或二者。
46. 根据权利要求45所述的方法，其中，所述苯乙烯的检测包括将步骤（c)的融合蛋白 和底物暴露于一种吸收所述产物蒸汽的聚合物树脂。
【文档编号】C12N9/88GK104487581SQ201380033044
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年6月21日 优先权日:2012年6月22日
【发明者】M·W·布伊亚, 陈辉, 蔡先鹏, 韩吉祥, 于晓丹 申请人:菲特吉恩公司