H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，它确立了H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法，含有三个技术要点： 确立了核酸检测所需要的引物序列；确立了检测反应种类；确立了检测反应体系和反应条件。该核酸检测方法可以用于H9亚型禽流感病毒的科学研究，也可以用于动物或人的临床诊断检测。
【专利说明】
H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域;具体说来，本发明确立了H9亚型禽流感病毒的快速检测方法，用于H9亚型禽流感病毒的快速检测，在体外诊断、兽医、食品安全、生物安全等领域有较大的使用价值。
[0002]
【背景技术】
[0003]禽流感根据致病性的不同，可以分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。其中，高致病性禽流感是由H5和H7亚型的某些毒株引起的疾病，H9亚型禽流感属于低致病性禽流感。
[0004]病毒核酸检测是病毒检测重要方法之一。目前，国内外对H9亚型禽流感病毒的各种核酸检测方法，包括农业行业标准或国家标准，耗费时间都比较长，如农业行业标准(禽流感病毒RT-PCR检测方法，NY/T 772-2013)至少需要2 h，国家标准(H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法，GB/T 19438.4-2004)至少需要1.2 h，目前没有比这些方法效率更高的检测方法。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明针对上述现有H9亚型禽流感病毒检测技术的不足，开展了深入研究和测试，建立了基于重组酶聚合酶扩增技术的H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法，仅需20min即可完成检测。该方法包括以下三个方面内容:
(一)确立了核酸检测所需要的引物序列，针对H9亚型禽流感病毒HA基因中保守区域，设计引物序列，其中上游引物序列含有3 O个碱基，序列为ctacaacaggaggaagtatcaagaagaatc(即序列表中SEQ ID N0.1)，下游上游引物序列含有30个碱基，序列为tatcgtctcgtattagtagaaacaagggtg(即序列表中SEQ ID N0.2)；
(二)确立了基于重组酶聚合酶扩增技术的快速检测方法；
(三)确立了检测反应体系和反应条件，在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.2 μ?、反应缓冲液29.5 41(含有(^了？、(《^\(1111\(10^等四种核苷酸)、第一步所合成的上游引物
2.4μ?(浓度为10 μπιοΙ/L)、第一步所合成的下游引物2.4 μ?(浓度为10 μπιοΙ/L)、酶混合物[逆转录酶、能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶]1.0 口1、1?嫩酶抑制剂1.0 μ?、需要检测的流感病毒核酸2.0 μ1(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)、醋酸镁(280 mmol/L)2.5 μ?;然后将反应体系密闭，置于恒温仪(或水浴锅)上进行反应，反应条件为40°C 20 min;反应结束后，在反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为242 bp的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
[0007]
【具体实施方式】
[0008]下面通过实施例，说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于这个实施例。
[0009]本实施例用重组酶聚合酶扩增技术，对H9亚型禽流感病毒进行核酸快速检测，包括如下步骤:
第一步(合成引物):按照本发明指定的核酸序列(即序列表中SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2)，人工合成重组酶聚合酶扩增反应所需要的上游引物和下游引物；
第二步(配置反应体系):在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.2 μ?、反应缓冲液29.5 41(含有(^了？、(16了？、(11'了？、(1013等四种核苷酸)、第一步所合成的上游引物2.4 μ?(浓度为10 口11101/1)、第一步所合成的下游引物2.4 μ1(浓度为10 ymol/L)、酶混合物[逆转录酶、能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶]1.0 41、1?^酶抑制剂1.0 μ?、需要检测的流感病毒核酸2.0 μ?(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)、醋酸镁(280 mmol/L)2.5 μ?;
第三步(反应):将第二步配置好的反应体系密闭后，置于恒温仪(或水浴锅)上进行反应，反应条件为40°C 20 min；
第四步(结果检测):在第三步的反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为242 bp的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
[0010]实际应用结果:对96份H9亚型禽流感病毒标准阳性临床样品进行检测，以及300份标准阴性样品，用上述H9亚型禽流感病毒快速核酸检测技术进行检测，结果显示该技术的灵敏度为100.0%，特异性为100.0%。
【主权项】
1.H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法，采用重组酶聚合酶扩增反应，其特征是可以检出所有H9亚型禽流感病毒。2.H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法，其特征有两个:一是可以检出所有H9亚型禽流感病毒;二是采用重组酶聚合酶扩增反应。3.H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法，其特征有三个:一是可以检出所有H9亚型禽流感病毒;二是采用针对H9亚型禽流感病毒HA基因保守的区域而设计的一对引物;三是采用重组酶聚合酶扩增反应。4.H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法，可采用重组酶聚合酶扩增反应，其特征有两个:一是可以检出所有H9亚型禽流感病毒；二是检测反应采用的一条引物的序列为ctacaacaggaggaagtatcaagaagaatc，或与 tatcgtctcgtattagtagaaacaagggtg 序列有 10 个或10个以上的碱基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相应的喊基)。5.H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法，其特征有两个:一是采用重组酶聚合酶扩增反应；二是检测反应采用的两条引物，其序列分别为ctacaacaggaggaagtatcaagaagaatc和tatcgtctcgtattagtagaaacaagggtg，或与这两个序列有10个或10个以上的碱基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相应的碱基)。
【文档编号】C12Q1/68GK105986042SQ201610063460
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2016年1月29日
【发明人】蒋文明, 陈继明
【申请人】中国动物卫生与流行病学中心