H10n8亚型禽流感病毒三重rt-pcr检测引物组、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种H10N8亚型禽流感病毒三重 RT-PCR检测引物组、试剂盒，以及鉴定HlO亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒、通用检测 所有亚型禽流感病毒的引物对或引物对组及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV)根据表面糖蛋白（Hemagglutinin，HA) 和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA)抗原性差异分为不同的亚型，目前已发现有18种HA亚 型（H1-H18)和11种NA亚型（Nl-Nll)。AIV是一种有包膜、单股负链、分节段的RNA病毒， 病毒基因组由8个分节段负链RNA组成。由于禽流感病毒基因组呈节段复制，通过依赖RNA 聚合酶完成复制，而RNA聚合酶缺乏校正功能，所以禽流感病毒发生基因突变的频率极高。
[0003] 2013年12月6日，江西省南昌市一名73岁女子罹患H10N8亚型禽流感，因呼吸衰 竭、休克死亡，这是全球首例人类感染H10N8的死亡案例。2014年1月25日，也是在南昌， 又确诊一例人感染H10N8亚型禽流感的病例。
[0004] 目前，急需建立一种快速检测H10N8亚型禽流感病毒的方法及开发相应试剂。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引 物组、试剂盒及其应用。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组，包括3对特异性引物，分别 是引物对H10-1和H10-2、引物对N8-1和N8-2、引物对M-I和M-2,其分别具有如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 6所示的序列。
[0008] -种用于鉴定HlO亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物H10-1和H10-2,它 们分别具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 2的碱基序列。
[0009] -种用于鉴定N8亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物N8-1和N8-2,它们分 别具有序列表SEQ. ID. No. 3至SEQ. ID. No. 4的碱基序列。
[0010] -种通用鉴定所有亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物M-I和M-2,它们分 别具有序列表SEQ. ID. No. 5至SEQ. ID. No. 6的碱基序列。
[0011] -种H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒，包括反转录试剂、PCR试剂、 DEPC水和RNase-free水，所述的PCR试剂中含有3对特异性引物，分别是引物对H10-1和 H10-2、引物对N8-1和N8-2、引物对M-I和M-2,其分别具有如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 6 所示的序列。
[0012] 作为优选，所述的3对特异性引物H10-1和H10-2, N8-1和N8-2, M-I和M-2在所 述的PCR试剂中的终浓度为0. 1-0. 8 μ M。
[0013] 作为优选，所述的反转录试剂每管16 μ L，其中5XReverse Transcriptase Buffer 10 μL、50pmol 9mer Random Primer 2 μL、IOmM dNTP Mixture 2 μL、40U Ribonuclease Inhibitor I μ L、5U/μ L AMV Reverse Transcriptase lyL〇
[0014] 作为优选，所述的 PCR试剂每管 27 μ L，其中 2 XEasyTaqTM PCR SuperMix 25 μ L、 50 μ M H10-1 和 H10-2 引物各 0· 2 μ L、50 μ M N8-1 和 N8-2 引物各 0· 4 μ L、50 μ M M-I 和 M-2 引物各〇. 4yL。
[0015] 本发明还提供了所述的H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测引物组、所述的引 物对或所述的H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒在鉴别H10N8亚型禽流感病 毒、HlO亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒及其它亚型禽流感病毒中的应用。
[0016] 本发明具有如下有益效果：
[0017] 1.发明人专门针对HlO亚型禽流感病毒HA基因、N8亚型禽流感病毒NA基因和所 有禽流感病毒M基因的保守序列，设计了三对特异性引物，组合成H10N8亚型禽流感病毒三 重RT-PCR检测试剂盒，一管检测即可确定是否为H10N8亚型禽流感病毒感染。利用本发明 的引物对、引物对组或试剂盒，可以检测待测样品中是否含有H10N8亚型禽流感病毒、HlO 亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒和其他亚型禽流感病毒感染。本发明建立了一次PCR 反应就能同时检测和鉴别HlO亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒、H10N8亚型禽流感病 毒，并确定是否存在其他亚型禽流感病毒的三重RT-PCR检测试剂盒。通过扩增条件优化、 特异性和敏感性试验，建立了 HlO亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒和通用检测禽流感 病毒的三重RT-PCR试剂盒，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点，可 用于临床检测H10N8亚型禽流感病毒，并能确定是否存在其他亚型禽流感病毒的感染。
[0018] 2.由于本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得 该法在结果判定时更简便、直观和实用。实验证明，该法对同一样品中的HlO亚型禽流 感病毒、N8亚型禽流感病毒和禽流感病毒模板进行扩增，结果均得到与试验设计相符的 267bp (H10亚型禽流感病毒）、464bp (N8亚型禽流感病毒）、693bp (禽流感病毒）的特异性 扩增条带，对其他亚型的禽流感病毒，只出现693bp禽流感通用检测的条带，对新城疫、传 染性支气管炎和传染性喉气管炎常见禽病的检测全为阴性。敏感性试验结果表明，该试剂 盒最低能检测到IO 3拷贝/ μ L的HlO亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒及所有亚型禽流 感病毒。
[0019] 3.本发明可为HlO亚型、Ν8亚型、Η10Ν8禽流感病毒和禽流感病毒的发病早期提 供准确的诊断结果，对切断其传播途径有重要意义，可及时隔离与处理，对Η10Ν8亚型禽流 感的有效防控具有重要意义，应用前景广阔，对养禽业可持续发展也有重要现实意义。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明所建立Η10Ν8亚型AIV三重RT-PCR检测试剂盒的特异性试验结果 图；
[0021] 其中：M-DLlOOOMarker ;1-Η10+Ν8 ;2-Η10Ν7 ;3-Η6Ν8 ;4-Η1Ν1 ;5-Η1Ν7 ;6-Η2Ν3 ; 7-Η3Ν2 ;8-Η4Ν6 ;9-Η5Ν1 ;10-Η6Ν1 ;11-Η7Ν2 ;12-Η8Ν4 ;13-Η9Ν2 ;14-Η11 ;15-Η12Ν5 ; 16-Η13Ν6 ;17-Η14Ν5 ;18-Η15Ν9 ;19-Η16Ν3 ;20-NDV ;21-IBV ;22-ILTV ;23-阴性对照； 24-空白对照。
[0022] 图2为本发明所建立H10N8亚型AIV三重RT-PCR检测试剂盒的敏感性试验结果 图；
[0023] 其中：1-108拷贝 /yL;2-107拷贝 /yL;3-106拷贝 /yL;4-105拷贝 /yL;5-104 拷贝/ μ L ;6-103拷贝/ μ L ;7-100拷贝/ μ L ;8-空白对照。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0025] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] AIV 毒株（H3N8、H6N8、H1N1、H3N2、H4、H9N2 和 H11)、NDV、IBV 和 ILTV 由广西兽 医研究所分离鉴定保存；AIV毒株（H2N3、H8N4、H10N3、H12N5)由香港大学惠赠；AIV毒株 (H10N7、H5N1、H7N2、H13N6、H14N5、H15N9 和 H16N3)的 RNA 由美国康涅狄格州大学惠赠； Minibest viral RNA/DNA extraction kit ver. 4.0和反转录试剂购自大连宝生物公司； PCR SuperMix购自北京全氏金生物公司。
[0027] 实施例1:禽流感病毒三重RT-PCR的引物设计及试剂盒的制备
[0028] (1)引物的设计
[0029] 根据GenBank中现有公开的HlO亚型AIV的HA基因、N8亚型AIV的NA基因和所 有亚型AIV的M基因共3个基因的保守序列，通过NCBI Blast验证，设计并合成了三对特 异性引物（见表1)，用于HlO亚型AIV、N8亚型AIV和所有亚型AIV的检测。
[0030] 表1引物信息
[0032] 注：AIV H10-1和H10-2引物对用来检测是否含有HlO亚型禽流感病毒；AIV N8-1 和N8-2引物对用来检测是否含有N8亚型禽流感病毒；AIV M-I和M-2引物对通用检测所 有亚型禽流感病毒。
[0033] (2)样品的制备
[0034] 根据 Minibest viral RNA/DNA extraction kit ver. 4. 0 提取试剂盒说明书，分 别提取上述禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的RNA，提取传染性喉气管炎病 毒的DNA。
[0035] (3) H10N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测试剂盒的配制
[0036] 对RT-PCR引物浓度、反应温度、时间及循环次数等进行优化，最后确定RT-PCR中 H10-1和H10-2引物在PCR试剂中的最佳终浓度为0. 2 μΜ ;N8-1、N8-2、M-I和M-2的引物 在PCR试剂中的最佳终浓度为0. 4 μ M ;PCR的最佳反应模式是94°C预变性5min，然后进入 94°C变性30s，52°C退火30s