新城疫病毒/禽流感病毒h9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量检测试剂及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种新城疫病毒/禽流感病毒Η9亚型/传染性支气管炎病毒Ξ重巧光 定量RT-PCR检测试剂及检测方法，属于动物检疫技术领域。
【背景技术】
[0002] 新城疫、禽流感和鸡传染性支气管炎是危害养禽业的重要传染病，属于急性高度 接触性呼吸道传染病。新城疫是纳入养禽场日常免疫程序的防控传染病，虽然疫苗覆盖范 围广，但是由于种种原因，新城疫疫情时常发生，只不过死亡率比不用疫苗来说大幅降低。 禽流感Η9亚型对养禽业的影响较大，疫苗使用较普遍，但是由于禽流感朋亚型毒株变异快， 经常出现新的变异株，导致禽类发病。鸡传染性支气管炎也具有很强的变异性，常规疫苗保 护率不高，禽群感染发病的情况时有发生。在鸡场使用疫苗的前提下，运Ξ种传染病发生导 致鸡的死亡率一般都在30%W内，由于运Ξ种传染病都属于呼吸道传染病，临床症状相似， 仅凭肉眼很难区分。再者临床上经常出现两种传染病混合感染情况，给疫病的诊断带来困 难。
[0003] 实验室传统的诊断新城疫、禽流感和鸡传染性支气管炎的方法为鸡胚病毒分离鉴 定，该方法耗时长，需要在一定安全级别的实验室内进行。当出现两种W上传染病混合感染 时，鸡胚病毒分离鉴定更为困难，一种病毒的增殖会掩盖另一种病毒的增殖，最后往往只能 鉴定出一种病毒，忽略了其它病毒的存在，造成发生疾病的误诊，给防治工作带来难度。
[0004] 随着分子生物学技术的发展，一批核酸检测技术如普通RT-PCR和巧光RT-PCR应用 到新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎检测诊断工作中，特别是巧光RT- PCR技术W敏感、特异、耗时短受到广大科研和检测技术人员的青睐，对于混合感染的禽群， 也很容易用该方法检出，真正做到了早发现、早确诊。国内外报道单一巧光RT-PCR方法较 多，将新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒同时检测的Ξ重巧光RT- PCR技术还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是建立同时检测新城疫病毒、禽流感病毒朋亚型和鸡传染性支气管 炎病毒的Ξ重巧光RT-PCR检测方法，为快速鉴别运Ξ种病毒提供技术支撑。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案： 一种新城疫病毒/禽流感病毒朋亚型/传染性支气管炎病毒Ξ重巧光定量RT-PCR检测 试剂，含有W下引物： NDV-F: 5 ' TATGRTGRTAACWTGCAAGAAGAG3 '，如沈Q ID NO. 1 所示， NDV-R为：5 ' GCTTTCACRTGCTTVACTG3 '，如沈Q ID NO. 2所示， NDV-P:5'FAM-TA+GTG+CAG+GCA+CC-TAMRA3'，如沈QIDN0.3所示， 册-F:5'ATGGGGTTTGCTGCC 3'，如沈Q ID N0.4所示， 册-R: 5 ' AATTATATACAAATGTTGCAYCTG 3 '，如沈Q ID NO. 5所示， 册斗：5'肥乂-1'1'押666〔￥4了61^￥44￥66-8册1-3'，如沈9 10側.6所示， 18￥斗：5'(：了41^6〇：4666444了61^3'，如沈9 10側.7所示， 18￥-3:5乂〔6了〇：了46了6(：了6了4〔〇：3'，如沈9 10側.8所示， 18￥斗：5乂￥5-〇：了66444〔644〔66了464〔〇：1'-8册2-3'，如沈9 10側.9所示， 其中，NDV-P:5' FAM-TA+G TG+C AG+G CA+C C-TAMRA 3'中'V'后面的碱基代表LNA修 饰。
[0007] 一种上述新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的Ξ重巧光 RT-PCR检测试剂，由巧光RT-PCR反应液和酶混合物按照20:1的体积比组成； 所述巧光RT-PCR反应液的组成： 10ymol/L的NDV-F:lyl， 10ymol/L的NDV-R:化1， 10ymol/L的Ν〇ν-Ρ:0.5μ1， 10ymol/L 的册-Ρ:1.2μ1， 10ymol/L 的册-Κ:1.2μ1， 10ymol/L 的册-Ρ:1μ1， 10ymol/L的IBV-F:lyl， 10ymol/L的ΙΒν-Κ:1μ1， 10ymol/L的ΙΒν-Ρ:0.5μ1， 5Χ RT缓冲液:3.7扣1， 10XPCR 缓冲液：1.875μ1， 25mmol/L 的 MgCl2:2.125yl， lOmmol/L的dNTP:化1， DEPC处理水：1.8扣1; 所述酶混合物：由200 U/化的M-MLV反转录酶、5 U/化的化q DNA聚合酶、40 U/化的 RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。
[000引所述DEPC处理水：自来水两次蒸馈，经过Millipore MILLI-Q PF化US纯水仪纯 化，收取电阻率>18.0MQ.cm的水，得Millipore-Q纯化水；然后向Millipore-Q纯化水 中加入DEPC至终浓度为0.1%，37°C揽拌处理12hr，15化f7in2 (1.034 X 1 05pa)高压蒸汽灭 菌15分钟，即可。
[0009] 一种含有上述新城疫病毒/禽流感病毒朋亚型/传染性支气管炎病毒Ξ重巧光定 量RT-PCR检测试剂的试剂盒。
[0010]上述试剂盒，还含有阴性对照、阳性对照； 所述阴性对照:正常SPF鸡的肝脏，用0.Olmol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成20%悬液，70 °C作用1小时； 所述阳性对照：为灭活的新城疫病毒Lasota株、禽流感病毒H9N2(A/chicken/ 化andong/96【朋N2】）、鸡传染性支气管炎病毒册2株尿囊液分别1:1000倍稀释后按1:1:1体 积比混合而成。
[0011]上述试剂盒，由提取试剂盒和检测试剂盒组成： 所述提取试剂盒的组成如下：
Buffer A为裂解液，含有4mol/L异硫氯酸脈、lOwt%十二烷基肌氨酸钢、4.5wt%氯化钢、 30%(v/v)乙醇。
[0012] Buffer B为洗液，含有lOmmol/L Tris-肥I、lmmol/L邸TA、70%(v/v)乙醇。
[0013] Buffer C为溶解液，主要由DEPC水组成； 所述检测试剂盒的组成如下：
[0014] 一种新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的Ξ重巧光RT-PCR 检测方法， 取待测样品的核酸5ul与20ul本发明的上述检测试剂配成25ul的反应体系，或者， 取待测样品的核酸5ul置于本发明的上述试剂盒中； 然后进行巧光定量RT-PCR反应，读取结果； 所述巧光定量PCR反应： 第一阶段:反转录，42°C/30 min; 第二阶段:预变性，92°C/3 min; 第Ξ阶段:预扩增，92°C 15sec，45°C 30sec，72°C 60sec; 第四阶段:92°C 10sec，52°C 15sec，60°C 30sec，40个循环，在第，四阶段每次循环的 60 °C退火延伸时收集巧光； 所述读取结果： 如果FAM检测通道出现"S"形扩增曲线，且Ct值小于30,则样品中含有新城疫病毒； 如果肥X或VIC检测通道出现"S"形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有禽流感病毒 册亚型； 如果CY5检测通道出现"S"形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有鸡传染性支气管 炎病毒。
[0015] 上述检测方法，利用FAM(465-510)通道、肥X(VIC)巧33-580)和CY5(618-660)通道 读取结果； 阴性结果:Ξ个检测通道均无 Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无新城疫病 毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒； 单阳性结果： 如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值< 30.0，而肥X/VIC检测通道和CY5 检测通道无 Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在新城疫病毒； 如仅皿X/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值含30.0，而FAM检测通道和CY5 检测通道无 Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在禽流感病