检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的rt-lamp引物组及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体设及一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT- LAMP引物组及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 蜜蜂囊状幼虫病是一种严重危害幼虫的病毒性疾病，由蜜蜂囊状幼虫病毒 (Sacbrood Virus，SBV)引起。蜜蜂囊状幼虫病毒属于小RNA病毒，目前至少可W感染蜜蜂科 的两大蜂种即西方蜜蜂和东方蜜蜂，能感染中华蜜蜂的病毒被称为中华蜜蜂囊状幼虫病毒 (化inese Sacbrood ￥山113，〔58￥)。此病毒对蜂群危害极其严重，尤其对我国本±蜂种中华 蜜蜂危害极其严重；中华蜜蜂为东方蜜蜂一个亚种，对此病毒抵抗力非常弱，极易暴发流 行。自从1972年中华蜜蜂囊状幼虫病首次在中国广东爆发至今，此病毒对中华蜜蜂蜂群发 展及生产能力造成了严重的影响，导致我国中华蜜蜂的种群数量急剧减少。流行病学调查 结果显示，此病目前已成为危害中华蜜蜂种群发展最严重的常发疾病之一。在一些地区，中 华蜜蜂囊状幼虫病的发病率高达100%，甚至有些蜂场直接导致蜂群崩溃，当地众多野生植 物和农作物的传粉受到了严重的影响，生态环境平衡W及作物收成面临严峻的考验。
[0003] 中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的传播大体可W归纳为群内传播、群间传播、蜂场 间传播和地区间传播四个途径。开发有效的病毒早期检测技术，做到早发现、早预防、早控 制就显得尤为重要。目前生产实践中主要通过观察症状和聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法等检测CSBV，但是当蜂群出现明显症状时通常就错过了最佳防 控时期，具有明显滞后性;一般PCR检测条件要求苛刻，且价格昂贵，不利于基层使用和推 广。病毒的早期检测技术对于病害的防控意义重大，因此建立快速、准确、简便、经济的CSBV 检测方法迫在眉睫。
[0004] 环介导等溫平衡扩增技术(Xoop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是 2000年日本学者Notomi等开发的一种全新的等溫核酸扩增方法，其特征为针对目标DM链 上的六个区段设计四个不同的引物然后再利用链置换反应在一定溫度下进行反应。相对于 普通的PCR扩增技术而言具有高特异性、高灵敏性、操作简便、结果判定直观等优点，具体如 下:反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定溫度下一步即 可完成，可在短时间内实现1〇9~l〇w倍的扩增，只需根据扩增反应产物的有无即可对祀基 因序列的存在与否作出判断。目前针对CSBV的LAMP检测方法仅限于马鸣潇等于2011年证实 LAMP可W用于CSBV的检测，实验检测的灵敏度低，效果较差。目前，能够快速、准确、特异、便 捷W及经济的检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的RT-LAMP引物组和试剂盒尚未见有报道 及应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能够快速、灵敏、特异的检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒 的RT-LAMP引物组及试剂盒。
[0006] 本发明的上述目的是通过W下技术方案实现的：
[0007] 本发明的发明人通过研究中华蜜蜂囊状幼虫病毒的编码基因序列设计了一种检 测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组，包含W下四条引物：
[0008] F3:5 '-GGAGGAAAGAATTACGCATTG-3 '；
[0009] B3:5 '-TCGAATACTCATTCCAACGAT-3 '；
[00 …]巧P:5 '-GTAACCATCAGGTGGAAAACTATCTAAAGCAATCAACTTATTGGCC-3 '；
[0011] BIP:5 '-CCAGTTAAGCCGACAAATAGCAATATAGATACATTCGCGGGCA-3 '。
[0012] 本分发明的另一个方面还提供了一种中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法，所述方法 包括使用本发明所述的RT-LAMP引物组进行RT-LAMP扩增反应。
[0013] 可选的，检测反应条件为:60-65°C下反应55-65min，80°C作用5-lOmin结束反应。 优选的，为了提高检测反应的特异性和灵敏度，检测反应条件为:63°C下反应60min，8(TC作 用lOmin结束反应。
[0014] 可选的，每25化的RT-LAMP检测体系包括： 链置换DNA聚合酶 8U l〇x反应缓冲液 IpL dNTPs 0.4-l.OmM ΠΡ、BIP 各0.4-0.8μΜ
[001 引 Β3、F3 各0.1-0.2μΜ Mg- 2-6mM 甜菜碱 0.5M AMV逆转录酶 ?ου Triton Χ-100 0.1%。
[0016] 为了获得更高的灵敏度和特异性检测结果，每25化的RT-LAMP检测体系包括： 链置换DNA聚合酶 别J l〇x反应缓冲液 ΙμΙ^ dNTPs 1 .OmM FTP, Β?Ρ 各化8μΜ
[0017] Β3、阳 各化ΙμΜ Mg2 4mM 谢菜碱 0.5M AMV逆转录酶 ?ου
[001 引 Triton 基 100 0.1%。
[0019] 本发明所提供的检测方法可W应用于非诊断和治疗目的的中华蜜蜂囊状幼虫病 毒检测。例如应用于中华蜜蜂囊状幼虫病毒研究和应用于与该病毒相关生物制剂的生产领 域等。
[0020] 本发明的另一个方面提供了一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的试剂盒，所述试剂 盒包括本发明所述的RT-LAMP引物组。
[0021 ] 可选的，在所述试剂盒中还包括RT-LAMP反应所需试剂。
[0022] 在本发明的一种优选的实施方式中，所述RT-LAMP反应所需试剂包括链置换DNA聚 合酶、反应缓冲液、dNTPs、Mg2\甜菜碱、AMV逆转录酶、Tri ton X-100;上述试剂可W共同组 成RT-LAMP反应液，所述RT-LAMP反应液与RT-LAMP引物组共同构成RT-LAMP检测体系。
[0023] 在应用所述试剂盒时，RT-LAMP反应液与RT-LAMP引物组共同构成RT-LAMP检测体 系，每25化的RT-LAMP检测体系包括： 链置换DNA聚合酶 8U 1〇χ反应缓冲液 Ιμ]： dNTPs 0.4-l.OmM Ρ?Ρ、BIP 各0.4-0.8μΜ
[0024] Β3、F3 各0.1-0.2μΜ Mg-" 2-6 mM 甜莱碱 0.5M AMV逆转录酶 ?ου Triton Χ~ 100 0.1%
[0025] 在本发明的一种优选的实施方式中，在应用所述试剂盒时，每25化的RT-LAMP检测 体系包括： 键量换DNA聚合酶 8U
[0026] l〇x反应缓冲液 \μL dNTPs l.OmM FIP、朗P 各0.8μΜ Β3、Ε3 各Ο.ΙμΜ
[0027] Μ呂2 4mM 滯菜碱 0.5M AMV逆横录酶 ?ου Triton X-100 0.1%
[0028] 可选的，利用所述试剂盒进行检测反应时，检测反应条件为：60-65°C下反应55- 65min，80°C作用5-lOmin结束反应。
[0029] 所述的RT-LAMP引物组或所述的试剂盒在制备检测或诊断中华蜜蜂囊状幼虫病毒 的制剂中的用途也属于本发明的保护范围。
[0030] 在本发明的一种实施方式中可W通过W下所列举的方法进行结果检测，
[0031] (1)直观检测：
[0032] 显色法:反应结束后加入lliL巧黄绿素，阳性反应结果显示黄绿色，阴性反应保持 原黄色不变，在紫外光激发下，阳性样品显示明亮巧光；
[0033] 目视浊度法:将反应结束后获得的反应物离屯、，阳性反应结果可观察到沉淀，阴性 反应无沉淀；
[0034] 巧光实时监测法:反应结束后加入SYBR Green显色剂，然后置于巧光定量仪实时 观察；
[0035] (2)琼脂糖凝胶电泳：用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，阳性反应呈现特有的 梯状条带，阴性反应则无条带出现。
[0036] 本发明还提供了所述RT-LAMP引物组在制备检测或诊断中华蜜蜂囊状幼虫病毒的 制剂中的用途。
[0037] 与现有的中华囊状幼虫病毒(CSBV)早期检测方法相比，本发明所提供的RT-LAMP 试剂盒有显著的优点，具体如下：一、反应迅速，利用AMV逆转录酶实现一步RT-LAMP完成反 应，省去了RNA反转录过程，同时相比一般的RT-PCR节约2-化r。二、特异性好，灵敏度高，对 蜜蜂其他病毒如蜜蜂残翅病毒(DWV)等呈阴性反应，最低可检测到8个拷贝的RNA模板，即使 几个病毒粒子，也能被快速准确的检测到。Ξ、反应结果易于观