专利名称：一种防治蜜蜂幼虫腐烂病病原的中草药制剂及其用法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治蜜蜂幼虫腐烂病病原的中草药制剂及其用法。
背景技术：
蜜蜂细菌性幼虫病是严重危害蜜蜂正常生长发育的传染性疾病，对养蜂生产和蜂产品质量安全构成重大威胁。至今为止，已报道的蜜蜂细菌性幼虫病包括美洲幼虫腐臭病和欧洲幼虫腐臭病，这两种蜜蜂细菌性幼虫病曾经给世界养蜂业造成了巨大的损失。2005年早春，在浙江慈溪、富阳、江山等地出现了一种严重的蜜蜂幼虫病，其蜂群发病率在10％左右，一般感染小日龄幼虫，主要症状表现为发病幼虫颜色发黄，失去光泽，严重时腐烂，但腐烂幼虫没有难闻的酸臭味，病虫通常在4～5日龄时死亡，病重群出现成年蜂爬蜂症状，群势下降很快。使用抗生素饲喂发病蜂群，幼虫腐烂症状很快好转，所以，初步判断该病可能由致病性细菌引起。该症状与目前已知的蜜蜂细菌性幼虫病——美洲幼虫腐臭病的症状(美幼病)的症状有明显差异，与欧洲幼虫腐臭病(欧幼病)的发病症状虽有某些类似之处(两者都感染小日龄幼虫，病虫通常在4～5日龄死亡，发病后会发生腐烂)，但也存在明显不同(该病腐烂幼虫没有难闻的酸臭味，病重蜂群出现成年蜂爬蜂症状)。采用美幼病和欧幼病病原检测方法对发病幼虫进行病原检测，没有检测到美幼病和欧幼病对应的病原。通过试验接种试验、蜂群接种试验、细菌形态特征观察、生理生化特征检测及16S rRNA基因序列分析等方法进行菌种鉴定，结果表明引起该蜜蜂幼虫腐烂病的病原为屎肠球菌。
目前，防治蜜蜂幼虫腐烂病的方法主要有以下几种1)烧毁发病蜂群由于美洲蜜蜂幼虫腐臭病病原具有顽强的存活力，且发病时对蜂群的危害是致命的，所以美国和欧盟规定美幼病发病群必须烧毁处理，以控制疾病的传播和漫延，烧毁发病蜂群的方法会给蜂农造成严重的经济损失。
2)使用土霉素防治美幼病1951年Gochnauer等报道土霉素治疗美洲幼虫腐臭病非常有效，而后的几十年人们就普遍使用土霉素来防治美洲幼虫腐臭病。但是近些年来人们越来越多的遇到了使用土霉素治疗美洲幼虫腐臭病效果下降的情况，有时甚至完全失效，后来证实是幼虫芽孢杆菌对土霉素产生了抗性。
3)使用其他抗生素防治美幼病如何控制已经对土霉素产生了抗性的美洲幼虫腐臭病成为蜂病防治的新课题。很多人将注意力投向了使用其他的抗生素来代替土霉素。2001年，Feldlaufer MF等报道盐酸林可霉素(lincomycinhydrochloride)能有效地控制美洲幼虫腐臭病，而且对蜜蜂的生长没有毒性。2002年，Elzen P等报道泰乐菌素(tylosin)对控制有土霉素抗性的美洲幼虫腐臭病很有效，而且它对蜜蜂的生长也没有毒性。然而这些候选抗生素的发现或许会在一定时期内有效，但却不能从根本上解决问题，因为新的抗生素的使用同样还存在会使病原菌产生抗性的问题。
因此，至今为止，蜜蜂幼虫腐臭病和新发现的蜜蜂幼虫腐烂病的防治仍是依赖使用抗生素为主要防治本发明的的使用会导致病原菌抗药性的增强而失效，还不可避免地引起蜂产品中抗生素的残留，给蜂产品安全生产构成严重威胁。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑菌效果优良的防治蜜蜂幼虫腐烂病病原的中草药制剂及其用法。
本发明的防治蜜蜂幼虫腐烂病病原的中草药制剂，其配方为每10mL无菌水中含五倍子提取物粉剂410mg、百蕊草提取物粉剂10mg、大青叶提取物粉剂10mg、山楂提取物粉剂10mg、大蒜提取物粉剂410mg。
上述中草药制剂的制备方法是按比例取上述各组分，将五倍子提取物粉剂、百蕊草提取物粉剂、大青叶提取物粉剂、山楂提取物粉剂和大蒜提取物粉剂一起放入无菌水中、搅拌均匀充分溶解即可。
本发明的中草药制剂用于防治蜜蜂幼虫腐烂病病原的使用方法对发病蜂群隔2天喂一次50mL中草药制剂，连喂3次为一疗程。
饲喂时，可将中草药加到蜂群的饲喂器内，再加入200mL糖浆，一同饲喂。
本发明与现有技术相比，具有的有益的效果是1.采用本发明的中草药复方制剂能有效抑制蜜蜂幼虫腐烂病的病原，该复方制剂比单方制剂的抑菌效果更优越。
2.采用本发明的中草药复方制剂比使用抗生素防治蜜蜂幼虫病更安全，不会对蜂产品造成抗生素残留问题。
3.中草药复方制剂不会造成类似病原菌对抗生素的抗性问题。
4.中草药复方制剂易溶于水，在喂药时把药剂按适当比例加到饲喂蜜蜂的糖浆中，在给蜜蜂喂糖时一起饲喂药剂，方便易行，便于推广应用。
5.本发明所采用的中草药为常见的中草药品种，且能人工栽培，资源丰富，因此产品价格低廉，适于产业化推广。
6.本发明所使用的中草药制剂对环境温和友好，不会污染环境，且为天然有机产品的提取物，对绿色、有机蜂产品生产具有重要的推广应用价值。
具体实施例方式
以下结合实例进一步说明本发明。
蜜蜂幼虫腐烂病病原的确认1)在蜜蜂繁殖和生产季节，发现蜂群中的小日龄幼虫发生病变，主要症状表现为发病幼虫颜色发黄，失去光泽，严重时腐烂，但腐烂幼虫没有难闻的酸臭味，病虫通常在4～5日龄时死亡，病重群出现成年蜂爬蜂症状，群势下降很快。
2)挑取3个症状典型的样品，分别放入1.5mL灭菌离心管中，用75％酒精进行表面消毒，无菌水冲洗3次，无菌条件下剪开幼虫表皮后捣碎；取匀浆在EFB培养基(每升含酵母浸膏10g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，牛心浸出液干粉10g，磷酸氢二钾13.6g，琼脂10g，pH 6.6)平板上划线；37℃培养24h，菌落直径为1mm左右，珍珠白，半透明水滴样，边缘整齐，表面光滑。在光镜和电镜下观察，菌体呈椭圆形，排列成短链或者成对散在，无鞭毛，革兰氏染色阳性。细菌DNA的提取采用常规酚法(见《分子克隆实验指南》(第三版)北京科学出版社，2003，pp.27-30)。以PrimerA(5′-AAGATTTGATC(CA)TGGCTCAG-3′)和PrimerB(5′-TACGGCTCTACCTTGTTACGACTT-3′)作为引物扩增。PCR扩增条件94℃3min；94℃1min，53℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR扩增产物的克隆参照《实用分子生物学方法手册》李永明、赵玉琪等著，北京科学出版社，2000，pp.46-48)介绍的DNA分子克隆方法，经克隆后测序，将测序结果用BLAST软件与GenBank中的数据库进行比较(http//ncbi.nih.gov/BLAST)分析，确定该发病蜂群的病原为屎肠球菌。
实施例1单方中草药制剂抑制蜜蜂幼虫腐烂病病原屎肠球菌试验单方中草药粉剂购自西安奥晶科技发展有限公司(每克中草药粉剂由10克中草药提取制得)。单方中草药药液配制按1克中草药粉剂加9mL无菌水的比例配制药液，药液浓度为10％。
方法取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6mm直径的圆形小纸片。取圆纸片10片放入清洁干燥的2mL离心管中。121℃，高压灭菌30min后，放在烘箱中，使之完全干燥。在上述含有10片纸片的2mL离心管中加入药液0.5mL，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在离心管上记录药物名称及浓度，放37℃恒温箱内干燥。
菌液的制备从发病幼虫样品中分离并保存的屎肠球菌菌株。细菌在EFB液体培养基中37℃培养过夜，使生长浊度达到1.25×109/mL；使用时再将菌液用灭菌的EFB液体培养基稀释1000倍，使细菌浓度达到1.25×106/mL，备用。
抑菌圈大小的测定取50μL制备的菌液加到EFB平板上，涂抹均匀。用灭菌的镊子小心的将药敏片贴到涂有菌液的EFB平板上。37℃恒温培养24小时后，测量并记录抑菌圈大小。每种药敏片做3个重复。
结果试验的18种中草药的抑菌作用如表1。
表1 18种中草药的抗菌作用(mm)
从表1可以看出，大蒜、大青叶、百蕊草、山楂、五倍子、甘草的抑菌效果明显，良姜、白术、白头翁、黄连次之；黄芪、金银花、龙胆紫、大黄、板蓝根、黄芩、青蒿、黄柏等中草药的抑菌圈均在10mm以下，抑制作用弱。
实施例2本发明的复方中草药制剂抑制蜜蜂幼虫腐烂病病原屎肠球菌试验中草药粉剂购自西安奥晶科技发展有限公司(每克中草药粉剂由10克中草药提取制得)。复方中草药制剂药液制备按每10mL无菌水加入5种中草药大蒜、大青叶、百蕊草、山楂、五倍子，各种中药的添加量见表3，搅拌均匀充分溶解，制备复方中草药制剂药液。
取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6mm直径的圆形小纸片。取圆纸片10片放入清洁干燥的2mL离心管中。121℃，高压灭菌30min后，放在烘箱中，使完全干燥。在上述含有10片纸片的2mL离心管中加入药液0.5mL，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在离心管上记录试验组别编号，放37℃恒温箱内干燥。
菌液的制备从发病幼虫样品中分离并保存的屎肠球菌菌株。细菌在EFB液体培养基中37℃培养过夜，使生长浊度达到1.25×109/mL；使用时再将菌液用灭菌的EFB液体培养基稀释1000倍，使细菌浓度达到1.25×106/mL，备用。
抑菌圈大小的测定取50μL制备的菌液加到EFB平板上，涂抹均匀。用灭菌的镊子小心的将药敏片贴到涂有菌液的EFB平板上。37℃恒温培养24小时后，测量并记录抑菌圈大小。每种药敏片做3个重复。
中草药复方的筛选根据抑菌圈大小，选择对屎肠球菌抑菌效果最好的5种中草药，选用5个浓度水平，使用DPS软件，采用二次正交旋转组合试验设计，设计5因素5水平36组试验。试验因素及水平见表2，试验结果见表3。
表2二次正交旋转组合试验的因子和各因子的零水平、变化区间
表3二次正交旋转组合试验各处理结果
注C1五倍子；C2百蕊草；C3大青叶；C4山楂；C5大蒜-210mg；-1110mg；0210mg；1310mg；2410mg用DPS软件对上表进行分析，最高值的各个因素组合如表4。
表4最高值的各个因素组合
注x1五倍子；x2百蕊草；x3大青叶；x4山楂；x5大蒜从上述正交实验结果可知，试验的5种中草药的最佳配方为每10mL水中含五倍子410mg、百蕊草10mg、大青叶10mg、山楂10mg、大蒜410mg。
权利要求
1.一种防治蜜蜂幼虫腐烂病病原屎肠球菌的中草药制剂，其特征是该中草药制剂配方为每10mL无菌水中含五倍子提取物粉剂410mg、百蕊草提取物粉剂10mg、大青叶提取物粉剂10mg、山楂提取物粉剂10mg、大蒜提取物粉剂410mg。
2.权利要求1所述的中草药制剂用于防治蜜蜂幼虫腐烂病病原的方法，其特征是对发病蜂群隔2天喂一次50mL中草药制剂，连喂3次为一疗程。
全文摘要
本发明公开的防治蜜蜂幼虫腐烂病病原屎肠球菌的中草药制剂，其配方为每10mL无菌水中含五倍子提取物粉剂410mg、百蕊草提取物粉剂10mg、大青叶提取物粉剂10mg、山楂提取物粉剂10mg、大蒜提取物粉剂410mg。用于防治蜜蜂幼虫腐烂病病原的方法是对发病蜂群隔2天喂一次50mL中草药制剂，连喂3次为一疗程。本发明的中草药制剂能有效抑制蜜蜂幼虫腐烂病的病原，抑菌效果优良。且中草药品种资源丰富，价格低廉，适于产业化。不会造成类似病原菌对抗生素的抗性问题，也不会对蜂产品造成抗生素残留问题。
文档编号A61P31/00GK1903309SQ20061005287
公开日2007年1月31日 申请日期2006年8月10日 优先权日2006年8月10日
发明者苏松坤, 罗建能, 戎映君, 钱建华, 任锦芳, 陈盛禄, 陈集双 申请人:浙江大学