线。
[0044] 说明，实施例3的检测试剂能够用于检测新城疫病毒、禽流感病毒朋亚型、鸡传染 性支气管炎病毒，且能将Ξ者区分开来。
[0045] 实施例6特异性实验 分别W禽流感病毒H7、册亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网 状内皮组织增生病毒为样本，W新城疫病毒Laso化株为阳性对照，采用实施例2的方法提取 RNA为模板，按照实施例3的方法配置反应体系，按照实施例4的方法进行PCR;结果为:皿X/ VIC检测通道和CY5检测通道均无 Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线；均无交叉反应，FAM检测 通道出现"S"型曲线为阳性对照的扩增曲线，底部直线为通过FAM检测通道读取上述其他病 毒(样本)的检测结果，见图4,表明特异性良好。
[0046] 分别W禽流感病毒H7、册亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、 禽网状内皮组织增生病毒为样本，W禽流感病毒朋亚型为阳性对照，采用实施例2的方法提 取RNA为模板，按照实施例3的方法配置反应体系，按照实施例4的方法进行PCR;结果为:FAM 检测通道和CY5检测通道均无 Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线；均无交叉反应，肥X/VIC检测 通道出现"S"型曲线为阳性对照的扩增曲线，底部直线为通过肥X/VIC检测通道读取上述其 他病毒(样本)的检测结果，见图5,表明特异性良好。
[0047] 分别W禽流感病毒H7、册亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、 禽网状内皮组织增生病毒为样本，W鸡传染性支气管炎病毒H52株为阳性对照，采用实施例 2的方法提取RNA为模板，按照实施例3的方法配置反应体系，按照实施例4的方法进行PCR; 结果为:FAM检测通道和皿X/VIC检测通道均无 Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线；均无交叉反 应，CY5检测通道出现"S"型曲线为阳性对照的扩增曲线，底部直线为通过CY5检测通道读取 上述其他病毒(样本)的检测结果，见图6,表明特异性良好。
【主权项】
1. 一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检 测试剂，其特征在于，含有以下引物：其中，NDV-P:5' FAM-TA+G TG+C AG+G CA+C C-TAMRA 3'中 "+"后面的碱基代表LNA修 饰。2. 根据权利要求1所述的三重荧光RT-PCR检测试剂，其特征在于，由荧光RT-PCR反应液 和酶混合物按照20:1的体积比组成； 所述荧光RT-PCR反应液的组成：所述酶混合物：由200 U/yL的M-MLV反转录酶、5 U/yL的Taq DNA聚合酶、40 U/yL的 RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。3. -种含有权利要求1或2所述三重荧光定量RT-PCR检测试剂的试剂盒。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还含有阴性对照、阳性对照； 所述阴性对照：正常SPF鸡的肝脏，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成20%悬液，70 °C作用1小时； 所述阳性对照:为灭活的新城疫病毒Lasota株、禽流感病毒H9N2、鸡传染性支气管炎病 毒H52株尿囊液分别1:1000倍稀释后按1:1:1体积比混合而成。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，由提取试剂盒和检测试剂盒组成： 所述提取试剂盒的组成如下：Buffer A为裂解液，含有4mol/L异硫氰酸胍、10wt%十二烷基肌氨酸钠、4.5wt%氯化钠、 30% 乙醇 v/v; Buffer B为洗液，含有10mmol/L Tris-HCI、lmmol/LEDTA、70%乙醇v/v; Buffer C为溶解液，主要由DEPC水组成； 所述检测试剂盒的组成如下：〇6. -种新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检 测方法，其特征在于， 取待测样品的核酸5ul与20ul权利要求1或2所述的检测试剂配成25ul的反应体系，或 者， 取待测样品的核酸5ul置于权利要求3、4或5所述试剂盒中； 然后进行荧光定量RT-PCR反应，读取结果； 所述荧光定量PCR反应： 第一阶段:反转录，42°C/30 min; 第二阶段:预变性，92°C/3 min; 第三阶段：预扩增，92°C 15sec，45°C 30sec，72°C 60sec; 第四阶段:92°C 10sec，52°C 15sec，60°C 30sec，40个循环，在第，四阶段每次循环的 60 °C退火延伸时收集荧光； 所述读取结果： 如果FAM检测通道出现"S"形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有新城疫病毒； 如果HEX或VIC检测通道出现"S"形扩增曲线，且Ct值小于30,则样品中含有禽流感病毒 H9亚型； 如果CY5检测通道出现"S"形扩增曲线，且Ct值小于30,则样品中含有鸡传染性支气管 炎病毒。7. 根据权利要求6所述检测方法，其特征在于，利用FAM(465-510)通道、HEX(VIC)(533-580)和CY5(618-660)通道读取结果； 阴性结果:三个检测通道均无 Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无新城疫病 毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒； 单阳性结果： 如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值<30.0,而HEX/VIC检测通道和CY5 检测通道无 Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在新城疫病毒； 如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值< 30.0，而FAM检测通道和CY5 检测通道无 Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在禽流感病毒H9亚型； 如仅CY5检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值<30.0,而FAM检测通道和HEX/VIC 检测通道无 Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在鸡传染性支气管炎病毒； 双阳性结果： 如FAM检测通道和HEX/VIC检测通道均出现典型的扩增曲线，且Ct/Cp值均< 30.0,表示 样品中存在新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型； 如FAM检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线，且Ct/Cp值均< 30.0,表示样品 中存在新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒； 如HEX/VIC检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线，且Ct/Cp值均< 30.0,表示 样品中存在禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒。8. 根据权利要求7所述检测方法，其特征在于， 阴性对照用三个检测通道读取数据时，应均无 Ct/Cp值并且无扩增曲线； 阳性对照用三个检测通道读取数据时，应出现三条相应的特征性扩增曲线，且Ct/Cp值 均应小于等于28。9. 根据权利要求8所述检测方法，其特征在于，任一通道Ct/Cp值大于30.0，且出现典型 的扩增曲线的样品建议复验;复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
【专利摘要】本发明涉及一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂及检测方法，属于动物检疫技术领域。本发明分别选择新城疫病毒M基因编码区特定序列、禽流感病毒H9亚型H基因编码区特定序列、鸡传染性支气管炎病毒M基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于5℃。为保证新城疫病毒探针的通用，探针的长度仅为13个碱基，采用LAN修饰，以提高其Tm值；其它两种病毒探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105671204
【申请号】CN201610145803
【发明人】陈静, 徐聪, 张向东, 王苗利, 杨鹏, 马慧玲, 王贵升, 孙圣福, 张月, 孔祥华, 于青海, 李玉杰, 徐鸿, 刘丽平, 蔺晓月
【申请人】山东省动物疫病预防与控制中心, 北京森康生物技术开发有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月15日