检测肝糖原累积症iii型agl基因突变的试剂盒及其应用
【专利说明】检测肝糖原累积症Μ I型AGL基因突变的试剂盒及其应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种检测肝糖原累积症ΙΠ 型A(iL基因突变的试剂盒及其应用。 (二)【背景技术】
[0002] 糖原累积症ΙΠ 型（Glycogen storage Disease Type III，GSD III)又称Cori病， 是由糖原脱支酶(glycogen debranching enzyme,AGL)缺陷引起的一种常染色体隐性遗传 性、糖原代谢异常性疾病。A化有两个独立的催化位点，即α-1，6-葡萄糖巧酶化C3.2.1.33) 和α-1,4-糖基转移酶化C3.4.1.25)，完整的A(iL活性需要葡萄糖巧酶和葡萄糖转移酶共同 发挥作用。根据酶缺陷和累及的组织器官不同，GSD III型可分为四个亚型，分别为GSD IIIa、GSD inb、GSD IIIc和GSD Hid型，其中W肝脏和肌肉中A化活性均缺乏的GSD Ilia 为最多见，约占总GSD III型的85%，其它Ξ种相对较为罕见。
[0003] GSD III型患者临床表现主要为伴有酬症的饥饿性低血糖、生长迟缓和肝脾增大， 高脂血症也是常见的表现;青春期后，大部分的GSD III型患者的肝部症状会消失，但是有 些患者也会出现进行性肝纤维化和肝硬化，甚至发展成肝功能衰竭或肝细胞癌；部分患者 在成年后会并发累及肌肉组织，表现为肌无力、肌疫李、肌萎缩、屯、肌病等，在行走过速或爬 坡时尤为明显。所有的GSD III型亚型均由A化基因突变引起，该基因1992年被定位于人类1 号染色体断臂的2区1带（lp21)区域，全长85化，由35个外显子组成，其中外显子6、13、14和 15被认定为具有α-1,4-糖基转移酶催化功能区域，外显子26和27为α-1,6-葡萄糖巧酶功能 区，而糖原结合区域存在于外显子31-34上。迄今为止，国内外已发现与GSD III疾病相关的 的A(iL基因突变类型超过30余种，在美国人中，Ρ.Arg864X突变最常见，占10.3% ;在意大利 人中，常见突变为c2681+lG〉A，占20.5%;国内最常见突变主要有(：1735+16〉1'和口.了7^428乂 (占 25%)。
[0004] 基因测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嚷岭(A)、胸腺喀晚(T)、胞 喀晚(C)与鸟嚷岭的(G)排列方式。目前常用的Sanger测序法是Frederick Sanger于1975年 发明的，测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应(PCR)dPCR过程中，双脱氧核糖核巧酸可能 随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核巧酸又少了一个氧原子，一旦 它被加入到DNA链上，运个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、 不同长度的DNA片段。作为一种新型基因检测技术，基因测序能够从血液或唾液中分析测定 目的基因序列，助力相关遗传病诊断，可W对那些即使没有临床症状的患者，也可W得到尽 早的诊断和治疗，为临床诊治提供科学依据。与患者拥有相同基因型的家族成员，尽管没有 临床症状也应该尽早治疗，而临床症状或生化检查都模棱两可的家族成员，有可能是杂合 子携帯者需加 W关注，具有高度特异且精确，低成本，操作简便，快速，高通量等优点，是国 际上公认的检测基因突变的"金标准"。
[0005] 在A(iL基因克隆之前，GSD III的诊断主要靠临床表现和生化检查，在临床上主要 问题表现为诊断率低和诊断手段有限。进一步确诊则依靠在肝脏和/肌肉中检测到异常的 糖原和A(iL活性降低或缺乏。但是实际操作比较困难，大多数患者或者家长不接受肝脏和肌 肉活检，对携带者更是无法进行检查，产前诊断如果对胎儿肝脏进行活检会给胎儿带来危 险。A化基因突变检测使得WDNA为基础的基因诊断成为可能，该方法不仅显著提高了不典 型GSD III型病例的诊断率，也是通过产前诊断从而有效降低该病发病率的重要手段。同时 对患者的同胞进行基因检测将有可能将诊断提前至无症状的临床前期，因而对于GSD III 型的基因测序检测，具有更准确、更经济、更简便，利于开展，避免了 W往该病的诊断有赖于 肝穿刺和肌肉活检的诊断方法，更易于被患者接受。因此WDNA为基础的非侵入性基因测序 诊断为传统的诊断提供了一种可替代的方法。 (Ξ)
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种检测肝糖原累积症III型A(iL基因突变的试剂盒及其应用， 该试剂盒用于检测A(iL基因突变位点，特异性好，灵敏度高。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] -种检测肝糖原累积症III型A(iL基因突变的试剂盒，主要包括用于检测A(iL基因 的10个夕F显子Exon6、Exonl3、Exonl4、Exonl5、Exon26、Exon27、Exon31、Exon32、Exon33和 Exon34的特异性扩增引物和PCR反应试剂，所述特异性引物序列如下：
[0009] 外显子Exon6扩增引物：
[0010] 上游引物：5 ' -GAACCCAAGTGTTTGACCTCTTTTC-3 '
[0011] 下游引物：5 ' -CTTTCTCTTATTTGTGTGTATATGT-3 ' ；
[001^ 外显子Exonl3扩增引物：
[0013] 上游引物：5 ' -TAAAAACCAGTGTTTCCTTG-3 '
[0014] 下游引物：5 ' -AATGCTTGTGTCCAACTAGC-3 ' ；
[001引外显子Exonl4扩增引物：
[0016] 上游引物：5 ' -TGTCAAATCATGCCTCCTT-3 '
[0017] 下游引物：5 ' -GTTCATCCTACTGGTCTTTCAA-3 ' ；
[001引外显子Exonl5扩增引物：
[0019] 上游引物：5 ' -TGAGCCATTTCTCCAGTTAAG-3 '
[0020] 下游引物:5 ' -TATGGGTATGATTGTGACCAAG-3 ' ；
[0021] 外显子Exon26扩增引物：
[0022] 上游引物：5 ' -AGGATTTGCAGGTGCCT-3 '
[0023] 下游引物：5' -AATACAGCTCCCAAATGTTAAG-3' ；
[0024] 外显子Exon27扩增引物：
[00 巧]上游引物：5 ' -AAAGAAATAGGGCAAGAGAGA-3，
[0026] 下游引物：5 ' -GGTGCCAAATCAATACTGAC-3 ' ；
[0027] 外显子Exon31扩增引物：
[002引上游引物：5 ' -ACACATCTCAATTCAGACTGG-3 '
[0029] 下游引物:5 ' -TGGGAATAAGGAACTAAGCA-3 ' ；
[0030] 外显子Exon32扩增引物：
[0031] 上游引物：5 ' -GGCTTTCCTAACTTCTACGG-3 '
[0032] 下游引物：5' -GGTGTACACAATCTCTCCCA-3' ；
[0033] 外显子Exon33扩增引物：
[0034] 上游引物:5 ' -AGATGGATGATGTACTAATGCC-3 '
[0035] 下游引物：5 ' -ATAGTCTTTGCAGTAGTCTCCG-3 ' ；
[0036] 外显子Exon34扩增引物：
[0037] 上游引物：5 ' -CTGTGGAATTTATGACAATGC-3 '
[0038] 下游引物：5 ' -AGGGCATACAGAAATCAATTC-3 '。
[0039] 所述PCR反应试剂为本领域常规试剂，主要包括:dNTP、10冲CR缓冲液、双蒸水、Tag 酶等。
[0040] 所述试剂盒还可包括A(iL基因 10个外显子序列标准品，所述标准品序列如下：
[0041] 外显子 Exon6:
[0042] 5 '-GCTACAACATGATTCATTTTACCCCATTGCAGACTCTTGGACTATCTAGGTCATGCTACTCCCTTG CCAATCAGTTAGAATTAAATCCTGACTTTTCAAGACCTAATAGAAAGTATACCTGGAATGATGTTGGACAGCTAGTG GAAAAATTAAAAAAGGAATGGAATGTTATTTGTATTACTGATGTTGTCTACAATCATACTG-3'；
[0043] 外显子 Exonl3:
[0044] 5'-GTTCAGAAGTTTACCTAAGGAGAGAACTTATTTGCTGGGGAGACAGTGTTAAATTACGCTATGGGA ATAAACCAGAGGACTGTCCTTATCTCTGGGCACACATGAAAAAATACACTGAAATAACTGCAACTTATTTCCAGGGA GTACGTCTTGATAACTGCCACTCAACACCTCTTCACGTAGCTGAG-3 '；
[0045] 外显子 Exonl4:
[0046] 日 '-TACATGTTGGATGCTGCTAGGAATTTGCAACCCAATTTATATGTAGTAGCTGAACTGTTCACAGGA AGTGAAGATCTGGACAATGTCTTTGTTACTAGACTGGGCATTAGTTCCTTAATAAGAG-3'；
[0047] 外显子 Exonl5:
[0048] 5 '-AGGCAATGAGTGCATATAATAGTCATGAAGAGGGCAGATTAGTTTACCGATATGGAGGAGAACCTG TTGGATCCTTTGTTCAGCCCTGTTTGAGGCCTTTAATGCCAGCTATTGCACATGCCCTGTTTATGGATATTACGCAT GATAATGAGTGTCCTATTGTG-3'；
[0049] 外显子 Exon26:
[0050] 5'-GCTTACCTCATTTTTCTTCTGGTATTTTCCGCTGCTGGGGAAGGGATACTTTTATTGCACTTAGAG GTATACTGCTGATTACTGGACGCTATGTAGAAGCCAG-3 '。
[0化1] 外显子Exon27:
[005。 5 '-GAATATTATTTTAGCATTTGCGGGTACCCTGAGGCATGGTCTCATTCCTAATCTACTGGGTGAAGG AATTTATGCCAGATACAATTGTCGGGATGCTGTGTGGTGGTGGCTGCAGTGTATCCAGGATTACTGTAAAATGGTTC CAAATGGTCTAGACATTCTCAAGTGCCCAGTTTCCAGAATGTATCCTACAGATGATTCTGCTCCTTTGCCTGCTGGC ACACTG-3'；
[0化3] 外显子Exon31:
[0054] 5 '-GAAAGGCTATAAAGGTCTCATATGATGAGTGGAACAGAAAAATACAAGACAACTTTGAAAAGCTAT TTCATGTTTCCGAAGACCCTTCAGATTTAAATGAAAAGCATCCAAATCTGGTTCACAAACGTGGCATATACAAAGAT AGTTATGGAGCTTCAAGTCCTTGGTGTGACTATCAGCTCAGGCCTAATTTTACCATAGCAATGGTTGTG-3'；
[0化5] 外显子Exon32:
[0056] 5'-GCCCCTGAGCTCTTTACTACAGAAAAAGCATGGAAAGCTTTGGAGATTGCAGAAAAAAAATTGCTT GGTCCCCTTGGCATGAAAACTTTAGATCCAGA-3'；
[0化7] 外显子Exon33:
[005引 5 '-TGATATGGTTTACTGTGGAATTTATGACAATGCATTAGACAATGACAACTACAATCTTGCTAAAGG TTTCAATTATCACCAAGGACCT-3'；
[0化9] 外显子Exon：M:
[0060] 5'-GAGTGGCTGTGGCCTATTGGGTATTTTCTTCGTGCAAAATTATATTTTTCCAGATTGATGGGCCCG GAGACTACTGCAAAGACTATAGTTTTGGTTAAAAATGTTCTTTCCCGACATTATGTTCATCTTGAGAG-3'o [0061 ] PCR及测序所需野生型标准品的制备WGenebank中发布A化的基因序列为标准，W 健康体检人的外周血基因组为模板，用上述10对引物扩增出10个特异性的PCR片段，合成与 表1引物一致的野生型质粒，并与A(iL的标准基因序列比对，确认质粒的正确性，作为检测分 析中的标准品。
[0062] 本发明还设及所述试剂盒在检测肝糖原累积症ΙΠ 型A(iL基因突变中的应用。
[0063] 具体的，所述应用方法如下：
[0064] (1)采集待测血液样本，提取DNA;
[0065] (2似样品DNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进 行PCR扩增；
[0066] (3)步骤(2)得到的PCR反应产物进行进一步的测序，依据单基因遗传病基因突变 数据库或者对照标准品序列进行分析，确定是否肝糖原累积症ΠΙ型致病突变位点。
[0067] 所述PCR反应体系每25化组成如下：
[006引 5X PrimeSTAR Buffer 化L