r>[0069] dNTP MixUire(200uM) 2化
[0070] 正向引物（10皿ol/L) UiL
[0071] 反向引物（10皿ol/L)化1 [00巧模板化L
[0073] PrimeSTAR 服 DNA Polymerase(2.抓/μ1) 0.化1;
[0074] d地2〇补足至化化。
[0075] 所述PCR反应条件如下：951：3111111;98°(：1〇3、56°(：153,721：3〇3,30个循环；最后72 °C8min。
[0076] 对于扩增出来的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，纯化后分别对扩增引物测 序，结果采用DNAStar软件子程序SeqMan分析，整理数据并在国际通用标准人基因突变数据 库中化t化://www. hgmd. cf. ac.址/ac/index.地P)进行比对分析或者与对照标准序列进行 比对，进一步分析已明确的致病突变位点，可作为临床诊断的依据。
[0077] 本发明的有益效果主要体现在:本发明试剂盒用于检测A化基因与肝糖原累积症 III型疾病相关的10个外显子突变位点，特异性好，灵敏度高，可显著提高不典型GSD III型 病例的诊断率，也是通过产前诊断从而有效降低该病发病率的重要手段。同时对患者的同 胞进行基因检测将有可能将诊断提前至无症状的临床前期，具有更准确、更经济、更简便， 利于开展，避免了 W往该病的诊断有赖于肝穿刺和肌肉活检的诊断方法，更易于被患者接 受。 (四）【附图说明】
[007引图1为患者A的检测结果;其A化基因外显子27附近处出现剪切点突变（IVS27-2A^ 00 (五)【具体实施方式】
[0079] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0080] 实施例1:
[0081] (1)样品准备。临床医生怀疑该患者A为遗传代谢性肝病糖原累积症III型，但是不 能确诊，决定实施基因检测。
[0082] 间样品处理。抽取受检者A静脉血2ml左右，置于肝素抗凝管内，低溫避光保存运输 至检验室;全血DNA提取向样品中抽取30化L血液加入90化L红细胞裂解液，颠倒混匀，室溫 放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。lOOOOrpm离屯、1分钟，吸去上清，留下白细胞。
[0083] 间基因组DNA提取。向上述装有白细胞的1.5ml离屯、管加入20μ1蛋白酶K(20mg/ml) 溶液，混匀后快速离屯、后加入20化1缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置lOmin，溶液应变清 亮，简短快速离屯、W去除管盖内壁的水珠;加入20化1无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时 可能会出现絮状沉淀，快速离屯、W去除管盖内壁的水珠;将上一步所得溶液和絮状沉淀都 加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离屯、30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附 柱CB3中加入500μ1缓冲液GD，12000g离屯、30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向 吸附柱CB3中加入60化1缓冲液PW，12000g离屯、30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管 中；再重复上一步骤操作;将吸附柱CB3放回收集管中，12000g离屯、2min，倒掉废液，将吸附 柱CB3置于室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残余漂洗液;将吸附柱CB3转入一个干 净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加10化1洗脱液TE，室溫放置3min，12000g离屯、 2min，将溶液收集到离屯、管中。
[0084] (4)PCR 扩增。
[0085] 表1:可扩增出A化中5个特异性外显子及其附近区域的引物
[0086]
[0087]
[0090]
[0091] 利用表1中AGLIO个外显子部位特异性PCR扩增引物，w样品DM作为模板，进行PCR 扩增。
[0092] PCR反应体系组成如下（共25化）： 5* PHmeSTA民 Buffer 5 pL dNTP Mixture (200 Μ) 2μΙ. 正向引物（10μπιο1/υ 1片已
[0093] 反向引物（10叫111〇1化） I以仁 模板l|oL PrimeSTA民 HS DN4 化]ymera觀(2.5 υ/μ1)化5 μ。 (klHsO 补化巧 25 .uL。
[0094] 野生型标准品和待测样品的模板均稀释成同一浓度5ng/yL。
[0095] PCR反应条件如下：
[0096] 95°C3min；
[0097] 98°C10s、56°C15s，72°C45s，30 个循环；
[009引最后 72°C10min;
[0099] 同时利用表2中标准品设置阴阳性对照。
[0100] 10 对引物分别扩增出 431bp，36 化p，452bp，45 化p，324bp，483bp，427bp，45Ap， 41化P，和412bp的片段。
[0101 ]间上机测序。利用测序仪进行目的片段测序。
[0102]做利用DNAMAN8软件对的测序结果进行序列分析，在单基因遗传病基因突变数据 库进行确定诊断，分析出外显子27处出现的剪切点突变（IVS27-2A^C)，从而可确诊患者A 属于遗传代谢性肝病糖原累积症ΠI型(参见图1)。
【主权项】
1. 一种检测肝糖原累积症III型AGL基因突变的试剂盒，主要包括用于检测AGL基因的 外显子Exon6、Exonl3、Exonl4、Exonl5、Exon26、Exon27、Exon31、Exon32、Exon33和Exon34的 特异性扩增引物和PCR反应试剂，所述特异性引物序列如下： 外显子Exon6扩增引物： 上游引物：5 ' -GAACCCAAGTGTTTGACCTCTTTTC-3 ' 下游引物：5 ' -CTTTCTCTTATTTGTGTGTATATGT-3 ' ； 外显子Exon 13扩增引物： 上游引物：5 ' -TAAAAACCAGTGTTTCCTTG-3 ' 下游引物：5 ' -AATGCTTGTGTCCAACTAGC-3 ' ； 外显子Exon 14扩增引物： 上游引物：5 ' -TGTCAAATCATGCCTCCTT-3 ' 下游引物：5 ' -GTTCATCCTACTGGTCTTTCAA-3 ' ； 外显子Exon 15扩增引物： 上游引物：5 ' -TGAGCCAITTCTCCAGTTAAG-3 ' 下游引物：5 ' -TATGGGTATGATTGTGACCAAG-3 ' ； 外显子Exon26扩增引物： 上游引物：5 ' -AGGAITTGCAGGTGCCT-3 ' 下游引物:5 ' -AATACAGCTCCCAAATGTTAAG-3 ' ； 外显子Exon27扩增引物： 上游引物:5 ' -AAAGAAATAGGGCAAGAGAGA-3， 下游引物：5 ' -GGTGCCAAATCAATACTGAC-3 ' ； 外显子Exon31扩增引物： 上游引物：5 ' -ACACATCTCAATTCAGACTGG-3 ' 下游引物:5 ' -TGGGAATAAGGAACTAAGCA-3 ' ； 外显子Exon32扩增引物： 上游引物：5 ' -GGCTTTCCTAACTTCTACGG-3 ' 下游引物：5 ' -GGTGTACACAATCTCTCCCA-3 ' ； 外显子Exon33扩增引物： 上游引物：5 ' -AGATGGATGATGTACTAATGCC-3 ' 下游引物：5 ' -ATAGTCTTTGCAGTAGTCTCCG-3 ' ； 外显子Exon34扩增引物： 上游引物：5 ' -CTGTGGAATTTATGACAATGC-3 ' 下游引物：5 ' -AGGGCATACAGAAATCAATTC-3 '。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括AGL基因外显子序列标准 品，所述标准品序列如下： 外显子Exon6: 5'-GCTACAACATGATTCATTTTACCCCATTGCAGACTCTTGGACTATCTAGGTCATGCTACTCCCTTGCCAA TCAGTTAGAATTAAATCCTGACTTTTCAAGACCTAATAGAAAGTATACCTGGAATGATGTTGGACAGCTAGTGGAAA AATTAAAAAAGGAATGGAATGTTATTTGTATTACTGATGTTGTCTACAATCATACTG-3'； 外显子Exonl3: 5'-GTTCAGAAGTTTACCTAAGGAGAGAACTTATTTGCTGGGGAGACAGTGTTAAATTACGCTATGGGAATAA ACCAGAGGACTGTCCTTATCTCTGGGCACACATGAAAAAATACACTGAAATAACTGCAACTTATTTCCAGGGAGTAC GTCTTGATAACTGCCACTCAACACCTCTTCACGTAGCTGAG-3'； 外显子Exonl4: 5'-TACATGTTGGATGCTGCTAGGAATTTGCAACCCAATTTATATGTAGTAGCTGAACTGTTCACAGGAAGTG AAGATCTGGACAATGTCTTTGTTACTAGACTGGGCATTAGTTCCTTAATAAGAG-3'； 外显子Exonl5: 5'-AGGCAATGAGTGCATATAATAGTCATGAAGAGGGCAGATTAGTTTACCGATATGGAGGAGAACCTGTTGG ATCCTTTGTTCAGCCCTGTTTGAGGCCTTTAATGCCAGCTATTGCACATGCCCTGTTTATGGATATTACGCATGATA ATGAGTGTCCTATTGTG-3'； 外显子Exon26: 5'-GCTTACCTCATTTTTCTTCTGGTATTTTCCGCTGCTGGGGAAGGGATACTTTTATTGCACTTAGAGGTAT ACTGCTGATTACTGGACGCTATGTAGAAGCCAG-3 '。 外显子Exon27: 5'-GAATATTATTTTAGCATTTGCGGGTACCCTGAGGCATGGTCTCATTCCTAATCTACTGGGTGAAGGAATT TATGCCAGATACAATTGTCGGGATGCTGTGTGGTGGTGGCTGCAGTGTATCCAGGATTACTGTAAAATGGTTCCAAA TGGTCTAGACATTCTCAAGTGCCCAGTTTCCAGAATGTATCCTACAGATGATTCTGCTCCTTTGCCTGCTGGCACAC TG-3' ；外显子Exon31: 5'-GAAAGGCTATAAAGGTCTCATATGATGAGTGGAACAGAAAAATACAAGACAACTTTGAAAAGCTATTTCA TGTTTCCGAAGACCCTTCAGATTTAAATGAAAAGCATCCAAATCTGGTTCACAAACGTGGCATATACAAAGATAGTT ATGGAGCTTCAAGTCCTTGGTGTGACTATCAGCTCAGGCCTAATTTTACCATAGCAATGGTTGTG-3'； 外显子Exon32: 5'-GCCCCTGAGCTCTTTACTACAGAAAAAGCATGGAAAGCTTTGGAGATTGCAGAAAAAAAATTGCTTGGTC CCCTTGGCATGAAAACTTTAGATCCAGA-3，； 外显子Exon33: 5'-TGATATGGTTTACTGTGGAATTTATGACAATGCATTAGACAATGACAACTACAATCTTGCTAAAGGTTTC AATTATCACCAAGGACCT-3,； 外显子Exon34: 5'-GAGTGGCTGTGGCCTATTGGGTATTTTCTTCGTGCAAAATTATATTTTTCCAGATTGATGGGCCCGGAGA CTACTGCAAAGACTATAGTTTTGGTTAAAAATGTTCTTTCCCGACATTATGTTCATCTTGAGAG-3 ,〇3. 权利要求1所述试剂盒在检测肝糖原累积症III型AGL基因突变中的应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用方法如下： (1) 采集待测血液样本，提取DNA; (2) 以样品DNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行 PCR扩增； (3) 步骤(2)得到的PCR反应产物进行进一步的测序，依据单基因遗传病基因突变数据 库或者对照标准品序列进行分析，确定是否肝糖原累积症III型致病突变位点。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述PCR反应条件如下:95°C3min;98°C10s、56 。(：15s，72°C30s，30 个循环；最后 72°C8min。
【专利摘要】本发明涉及一种检测肝糖原累积症III型AGL基因突变的试剂盒及其应用，所述试剂盒主要包括用于检测AGL基因的10个外显子Exon6、Exon13、Exon14、Exon15、Exon26、Exon27、Exon31、Exon32、Exon33和Exon34的特异性扩增引物和PCR反应试剂。本发明试剂盒用于检测AGL基因与肝糖原累积症III型疾病相关的10个外显子突变位点，特异性好，灵敏度高，可显著提高不典型GSD？III型病例的诊断率，也是通过产前诊断从而有效降低该病发病率的重要手段。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105671198
【申请号】CN201610252379
【发明人】刘小龙, 刘景丰, 魏大海, 曾永毅, 蔡志雄
【申请人】福州市传染病医院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月21日