一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种核酸检测技术，具体而言是一种依赖核酸内切酶活性的核酸检测 技术和试剂。
[0002] 背景知识
[0003] 核酸等溫检测技术是核酸体外检测技术的一种，其反应过程始终维持在恒定的溫 度下，通过添加等溫扩增DNA聚合酶和各自特异性引物W及其他辅助酶类或报告基团来达 到快速核酸扩增的目的。由于等溫扩增的产物结构复杂，一般不适合用于分子克隆，主要用 于核酸体外诊断。核酸等溫扩增技术由于不需要使用PCR仪等专用设备，因此适合在基层医 院和简易实验室中推广使用，因此近几年发展迅速。常见的等溫扩增技术主要包括:环介导 核酸等溫扩增技术化oop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)、滚环扩增技术 (Rolling Circle Amplification, RCA)、单引物等溫扩增技术（Single Primer Isothermal Ampl if i cat ion，SPIA)、依赖解旋酶恒溫扩增技术化 el icase-dependent Isothermal DM Amplification,皿A)、依赖核酸序列的扩增（Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)、链替代扩增（Strand Displacement Amplification，SDA)、 快速等溫检测放大技术（Rapid Isothermal Detection and Amplification,RIDA)、交叉 引物等溫扩增（Cross priming amplification,CPA)等。
[0004] 上述方法可W分为Ξ大类，第一类WRCA为代表的多步反应等溫扩增检测方法，包 括RCA、SPIA等。该类方法的特点是在反应过程中先通过一步反应合成检测中间体，而后对 其进行等溫扩增，实现核酸检测。WRCA为例，该技术是于1998年模拟自然界微生物环状DNA 的滚环复制过程，发展起来的一种放大信号和祀核酸相结合的检测方法。先根据引物特异 性，合成DNA环，作为等溫扩增中间体，而后在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下由一条引 物与环形DNA模板的链置换合成，实现环状DNA模板的体外等溫线性扩增。依据扩增过程中 加入的引物不同可分为线性扩增、指数扩增、多引物扩增和信号扩增等。该类检测方法的缺 点在于，需要多步反应才能得到检测结果，检测方法繁琐，费用较高，也较为费时，检测灵敏 度也较低。
[0005] 第二类，WLAMP为代表的多引物依赖于链置换酶活性的等溫扩增检测技术，该类 技术主要包括LAMPXPA等。上述技术的核屯、是通过巧妙的引物设计，不需要使用连接酶等 辅助酶直接通过扩增产生等溫扩增中间体。进而依靠引物组扩增中间体上的特定片段，通 过检测扩增产物实现核酸检测。WLAMP为例，该方法针对祀基因的6个区域设计4种特异引 物，利用BstDNA聚合酶在等溫条件下扩增出双发卡状中间体，进而进入循环实现链增长， 最终的产物为不同级数的扩增产物的混合物。反应产物可通过电泳或者根据扩增副产物焦 憐酸儀沉淀形成的浊度或者巧光染料进行判断。此类方法具有快速、高灵敏度的特点但是 由于气溶胶污染的原因，该类方法的假阳性结果较多，另外在进行引物设计时，要求目的片 段在3(K)bp之内具有15化P左右的保守序列，引物设计繁琐，而且在高突变率的RNA病毒基因 组中，运样的序列是很难找到的，粗放的引物设计容易导致假阴性，运极大地限制了该方法 的应用。
[0006] 第Ξ类，WRIDA为代表的不进行扩增的核酸检测技术。该类方法不依靠核酸扩增 产生检测信号，而通过分子灯标的方法进行检测。WRIDA为例，该方法通过核酸切刻酶的活 性，将和检测目的序列结合的分子灯标切开，产生巧光信号进行检测。该类方法由于核酸切 刻酶种类有限，因此对目的序列限制较大。而且只能切刻DNA双链，不能直接检测RNA，因而 并没有得到广泛的应用。
[0007] 总之，核酸等溫扩增技术在检验医学中体现出的最大的优势在于操作简单，检测 时间较短，不需要依赖大型设备等几个方面。而目前的等溫检测方法依然存在着一些缺欠， 第一类技术方法由于需要在体系中加入连接酶、解旋酶等物质，需要多步反应完成，无法体 现出操作简便的优势。第二类方法则对目的片段的保守性要求过高，引物设计复杂，容易引 起气溶胶污染，其应用也受到了一定的限制。第Ξ类方法还处于发展初期，RIDA方法需要切 刻酶参与对检测目的序列提出了更高的要求，也没有得到广泛的应用。
[0008] 综上所述，建立一种具有识别序列较短(类似于PCR反应识别2段特异性序列），对 引物位置要求较低，检测体系简单(一步完成），检测效率较高，检测目的核酸通用性强(DNA 和RNA均能直接检测)等特点的核酸等溫检测技术，不仅对有效的丰富核酸等溫扩增技术具 有推动作用，更具有重要的应用价值和临床意义。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的：
[0010] 本发明旨在建立一种依赖于内切酶活性的核酸检测技术，该技术具有识别序列较 短(类似于PCR反应识别2段特异性序列），对引物位置要求较低，检测体系简单(一步完成）， 检测效率较高，检测目的核酸通用性强(DNA和RNA均能直接检测)等特点。
[0011] 本发明的技术原理：
[0012] DNA单链分子在水溶液中会根据其一级结构，折叠成特定的二级结构。决定二级结 构形态的因素在于DNA分子内、DNA分子间或者DNA和RNA分子间能够形成碱基互补配对。因 此当一种特定的DNA分子在溶液中时，它会保持一种二级结构;而当另一种能够和该DNA分 子形成碱基互补配对双键的核酸分子加入到该溶液中时，能够改变第一种DNA分子的二级 结构。
[0013] 本发明即是通过DNA分子的该特点设计的。本研究进行核酸检测使用的是DNA分子 探针，该探针DNA分子在没有和目的核酸片段结合时，保持一种二级结构(如图1所示），此时 在该结构上没有特定的核酸内切酶的切点。而当有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够 和目的片段结合改变其二级结构，此时形成了具有Ξ段双链结构的"丫"字型的核酸分子 (如图2所示），其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成的，而另一条双链则为探针 DNA分子自己折叠形成的。在运条分子内折叠形成的双链上，具有能够被特定DNA内切酶识 别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。
[0014] 当溶液中存在该内切酶时，探针DNA分子能够被内切酶切开。由于热力学的作用， 新的未被切开的探针DNA分子将替代被切开的分子和目的片段结合。该循环周而往复，溶液 中的探针DNA分子不断被切开，切开的探针分子和未被切开的探针分子能够通过琼脂糖凝 胶电泳进行区别分析，实现目的核酸片段的等溫检测。当在探针DNA分子上进行巧光标记 后，还能够通过巧光检测装置检测出被切开的DNA分子，实现目的核酸片段的巧光等溫检 测。
[0015] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0016] 1.探针DNA分子的设计
[0017] 本研究使用的探针DNA分子，需要至少具备W下功能，探针DNA分子在没有和目的 核酸片段结合时，保持一种二级结构，此时在该结构上没有特定的核酸内切酶的切点。而当 有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够和目的片段结合改变其二级结构，此时形成了具 有Ξ段双链结构的"丫"字型的核酸分子，其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成 的，而另一条双链则为探针DNA分子自己折叠形成的，运条探针DNA分子自己折叠形成的双 链上，具有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点。
[0018] 而实现上述功能则可W通过W下设计实现，如将探针分为4个区域，从5'-3'端分 别为区域I至区域IV。
[0019] 区域I为和检测目的片段中某些序列的反义互补片段，能够和检测目的片段形成 双链。
[0020] 区域II中包含能够与区域ΙΠ 反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域III 形成的DNA双链上具有能够被特定核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶切开 的酶切位点，同时区域II中还含有能够和区域IV的部分序列反义互补形成双链的片段。
[0021] 区域III中包含有能够与区域II反义互补形成双链的序列，而且在区域II和区域 III形成的DNA双链上具有能够被特定核酸内切酶识别的识别位点和能够被该核酸内切酶 切开的酶切位点。
[0022] 区域IV为和检测目的片段中某些序列的反义互补片段(不和区域I所针对的检测 目的片段中某些序列的反义互补片段重合），也能够和检测目的片段形成双链。另外该区域 中还包含有部分能够和区域II中的部分序列形成反义互补形成双链的片段。
[0023] 本发明中某一符合上述要求的探针DNA分子的序列和其中的不同区域如图1和图3 所示。
[0024] 还可W使用其他探针，并不需要完全仿照区域I-区域IV的功能设计，只需要能够 在目的片段不存在时维持一种二级结构，而当目的片段存在时和目的片段结合的DNA分子 能够产生由区域II和区域III所形成的能够被核酸内切酶识别并切开的分子内DNA双链即 可实现等溫检测。
[0025] 2.运用探针DNA分子检测目的核酸
[0026] 具体步骤如下：
[0027] (1)合成探针DNA分子，使用双蒸水将其稀释至1皿ol/L备用。
[0028] (2)取能够识别且切开探针