一种利用核苷酸衍生物调节限制性核酸内切酶的酶切活性的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用核苷酸衍生物修饰DNA双链底物来调节限制性核酸内切酶对底物的酶切活性的方法。该方法包括利用一种或几种核苷酸衍生物修饰限制性核酸内切酶的底物，即脱氧核酸双链，的识别序列中一个或几个核苷酸以及邻近识别序列3'-末端和5'-末端的核苷酸，从而在不改变限制性核酸内切酶识别序列的前提下调节限制性核酸内切酶对该底物的酶切活性。使用核苷酸衍生物对限制性核苷酸内切酶识别序列或其附近的核苷酸进行选择性的修饰，从而达到调节限制性核酸内切酶的特异性酶切效率的方法。该方法可以应用在限制性核酸内切酶参与的各种生物检测和生物化学反应中。
【专利说明】—种利用核苷酸衍生物调节限制性核酸内切酶的酶切活性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分析化学、生物化学与分子生物学的【技术领域】，提供了一种对限制性核酸内切酶的酶切活性进行调节的方法。该方法可以应用于包括合成生物学、分子克隆、生物检测等各种生物化学与分子生物学的技术中。
【背景技术】
[0002]1、核苷酸衍生物
[0003]核苷酸衍生物是在天然核苷酸的化学结构上经过化学修饰而得到的一类核苷酸类似物。根据修饰部位的不同，可以将其分为碱基修饰的核苷酸衍生物、戊糖修饰的核苷酸衍生物，以及磷酸修饰的核苷酸衍生物。这些核苷酸衍生物表现出各种不同的物理化学以及生物特性。有的核苷酸衍生物与DNA有较强的亲和力，而有些则倾向于与RNA结合。有些核苷酸衍生物可以提高对杂交双链中的错配碱基对的识别能力，增加寡核苷酸探针的检测特异性。有些核苷酸衍生物对核酸酶有较强的抵抗能力，能增强反义核酸药物在生理条件下的稳定性，提高治疗效果。有些核苷酸衍生物可以用来调控核酸链的空间构象。因此，核苷酸衍生物已经广泛地应用在涉及各种生物分子相互作用的基础研究中以及以核酸为基础的临床治疗和转化医学中。
[0004]2、限制性核酸内切酶以及应用
[0005]限制性核酸内切酶(Restri ction endonuclease, RE)是一类特殊的蛋白质分子，它们可以识别特定的DNA序列，并在识别序列上将双链DNA切割成为两个片段。限制性核酸内切酶可以分为1、II和III型。在基因工程技术中最常用的是II型。II类限制性核酸内切酶所能够识别的核苷酸序列都具有回文结构(palindrome),酶切后形成的产物具有粘性末端或平头末端的特点。限制性核酸内切酶被广泛地应用在分子克隆等技术。使用限制性核酸内切酶对DNA片段以及质粒进行酶切，形成粘性末端，再通过连接酶的连接反应，形成重组质粒，进行质粒的复制和蛋白的表达。合成生物学中需要许多限制性核酸内切酶，来完成基因的拼接和构建工作。限制性核酸内切酶还用于临床疾病的检测方面，如利用限制性酶切片段长度多态性的分析来确定基因的突变情况。
[0006]3、限制性核酸内切酶酶切活性的检测
[0007]检测限制性核酸内切酶的酶切活性的方法有:表面等离子体共振谱(surfaceplasma resonance spectroscopy)、电泳迁移率(electrophoresis mobility shiftassay, EMSA)、聚合酶链反应阻滞实验(PCR-stop experiment)、突光共振能量转移(flourescence resonance energy transfer, FRET)等。与其他技术相比，FRET 具有样品用量少，检测周期短，可以进行实时检测等优点。
[0008]利用FRET技术检测限制性核酸内切酶的酶切活性的基本原理如图1所示。限制性核酸内切酶的底物是由三条寡核苷酸链组成的。它们分别是在5’ -末端标记了荧光基团的荧光链(F-ON链)、在3’ -末端标记了荧光淬灭基团的淬灭链(Q-ON链)以及模板链(T-ON链)。荧光链和淬灭链可以与模板链通过互补杂交原理，形成DNA双链复合物。在模板链和荧光链上，分别含有限制性核酸内切酶所能识别的核苷酸序列。因此，DNA双链复合物就成为了限制性核酸内切酶的底物。在DNA双链复合物上，荧光链的荧光发射基团和淬灭链的荧光淬灭基团相互接近，使得荧光被淬灭基团淬灭掉。当加入限制性核酸内切酶后，底物DNA双链被酶切成为两个片段，含有荧光基团的寡核苷酸链过于短小，不能继续与模板链形成稳定的互补双链，从复合物上脱落下来，远离了荧光淬灭基团，发射出荧光。利用该原理，在加入限制性核酸内切酶后，通过检测荧光强度的变化，可以方便地和实时地监测内切酶催化的酶切反应的全过程。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种可以调节限制性核酸酶酶切活性的方法。其包含以下部分:核苷酸衍生物对限制性核酸内切酶底物上的酶切位点的修饰、限制性核酸内切酶催化的酶切反应体系。
[0010]本发明中，所述的核苷酸衍生物是指在天然核苷酸的戊糖或脱氧戊糖上经过化学修饰形成的核苷酸衍生物，包括在02’ -原子上经过化学修饰形成的单环戊糖结构、在C2’ -原子上经过化学修饰形成的卤代单环戊糖结构、在02’ -和C4’ -原子之间经过化学修饰形成的双环戊糖结构、在02’ -和Cl’ -原子之间经过化学修饰形成的双环戊糖结构。由于水分子的水化作用、化学修饰基团的电负性、化学修饰基团的空间阻碍性等元素，这些核苷酸衍生物戊糖环的柔韧度受到了限制，一 般表现出C3’-内趋的戊糖环构象(C3’-endosugar pucker conformation)。这种戍糖环构象又将连接碱基的糖苷键限定在反式构象(anti glycosidic conformation)。
[0011]其中，在02’-原子上经过化学修饰所形成的单环戊糖结构的核苷酸衍生物包括① 2’ -0-modified 系列
【权利要求】
1.一种利用核苷酸衍生物调节限制性核酸内切酶的酶切活性的方法，其特征在于:利用核苷酸衍生物对含有限制性核酸内切酶识别序列的脱氧核酸双链中限制性核酸内切酶识别序列中一个或几个核苷酸以及邻近识别序列3’ -末端或5’ -末端的核苷酸的修饰。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的含有限制性核酸内切酶识别序列的脱氧核酸双链为天然的或合成的脱氧核酸双链，该脱氧核酸双链含有一个或多个相同的限制性核酸内切酶的识别序列，或含有一种或多种不同的限制性核酸内切酶的识别序列。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的核苷酸衍生物是在天然核苷酸的戊糖或脱氧戊糖上经过化学修饰形成的核苷酸，包括在02’ -原子上经过化学修饰形成的单环戊糖结构、在C2’ -原子上经过化学修饰形成的卤代单环脱氧戊糖结构、在02’ -和C4’ -原子之间经过化学修饰形成的双环戊糖结或在02’ -和Cl’ -原子之间经过化学修饰形成的双环戊糖结构。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:，在02’-原子上经过化学修饰所形成的单环戊糖结构的核苷酸衍生物包括①2’-0-modified系列
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:在C2’-原子上经过化学修饰形成的卤代单环脱氧戊糖结构的核苷酸衍生物包括
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:在02’-和C4’-原子之间经过化学修饰形成的双环戊糖结构的核苷酸衍生物包括
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:在02’-和Cl’-原子之间经过化学修饰形成的双环戊糖结构的核苷酸衍生物包括
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的限制性核酸内切酶包括
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:核苷酸衍生物对限制性核酸内切酶所识别的核苷酸序列的修饰是一个或几个核苷酸修饰，或是使用一种或几种核苷酸衍生物修饰，修饰的位点是识别序列中的核苷酸或者是邻近识别序列3’-末端以及5’-末端的核苷酸。
10.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，修饰的方法是核酸化学合成法或者是核酸酶合成法。
【文档编号】C12N15/11GK103436531SQ201310305768
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2013年7月19日
【发明者】关一夫, 赵国杰 申请人:关一夫, 赵国杰