专利名称：用限制性核酸内切酶克服滞后污染的聚合酶链式反应方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及防止滞后污染的聚合酶链式反应方法。
背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)是一种快捷、高效的扩增特定DNA的方法，经过30个左右的循环目标基因片段被扩增上亿倍。由于扩增产物和样品中的原始目标基因均可作为扩增的模板，痕迹量的PCR反应液滞后污染会造成比样品交叉污染严重得多的麻烦。克服滞后污染的方法包括物理防范措施(J.L.Hartley等，PCR-Methods and-applications，1993，3S10-S14)和各种化学和生物化学方法。M.C.Longo等(Gene，1990，93125-128)用dUTP取代天然核苷酸dTTP作为反应的底物，使滞后扩增产物可被脱氧尿嘧啶糖苷酶(UDG)所分解。该方法得到了广泛认可，但扩增产物带有大量非天然核苷酸PCR产物不适宜用于克隆等操作。F.M.DeFilippes(BioTechniques，1991，1026-29)和B.Furrer等(Nature，1990，346324)分别用核酸酶和限制性内切酶来克服滞后污染，但所用酶没有专一性除了分解扩增产物也会分解样品中的原始核酸模板。本发明提供了通过引物设计和采用特定的限制性内切酶来减少和消除滞后污染的简单有效的方法，可用于临床检测扩增产物也可用于克隆等分子生物学研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题本发明提供一种克服滞后污染的PCR方法，以填补目前缺乏通过引物设计和特定限制性核酸内切酶方法解决滞后污染问题的空白，解决现有克服滞后污染技术中需要采用非天然核苷酸底物和扩增产物无法进行克隆的缺陷。
发明构思限制性核酸内切酶切割核酸的部位通常在其识别顺序的内部或一侧，但已报导和商品化的限制性内切酶中有少数酶，他们切割核酸的部位在识别顺序的上游4-20个碱基。如果在引物的5’端通过引进错配碱基或加一段非基因专一顺序，可在扩增产物内构建一个上述限制性内切酶的识别顺序，而原始目标基因的内部不存在这种识别顺序。PCR反应前用酶处理反应液可使滞后污染扩增产物中本来与引物互补的部位被切割约4-20个核苷酸。即使在相当低的退火温度下引物也不会与这种已被“断臂”的扩增增产物退火，使污染扩增产物的扩增流产其干扰被消除。由于原始模板不含识别顺序，限制性核酸内切酶处理对引物与原始模板的退火没有任何影响。
技术方案本发明提供一种能克服滞后污染的聚合酶链式反应方法，其反应液成份包括4种脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶、缓冲液、Mg离子、模板核酸和一对引物，在引物的5’端带有一类限制性核酸内切酶的识别顺序，这类内切酶的切割部位在其识别顺序的上游4-20个碱基(见表1)，PCR反应步骤依次包括(1)用限制性内切酶处理PCR反应液；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；表1切割部位在识别顺序上游9-20碱基的部份限制性核酸内切酶
用人工方法，借助引物设计软件(Oligo6.0由Molecular BiologyInsights，Inc.出品)或使用软件完全自动化方法得高严谨性的引物对，然后在引物的5’端引进上述限制性内切酶识别顺序，并验核在扩增产物内部没有该内切酶的识别顺序。限制性内切酶识别顺序设计在正引物或反引物，或同时设计在正引物和反引物。
当同时设计在正引物和反引物时，正反引物的限制性核酸内切酶的识别顺序可以相同或不相同。在正引物或反引物上可设计一个，二个或二个以上限制性核酸内切酶识别顺序，其识别顺序可以相同或不相同。
限制性内切酶识别顺序位于引物3’端数起的第8-40碱基，优选第12-25碱基。
在配制PCR反应液时加入限制性核酸内切酶，PCR反应前在酶作用的最适温度通常为37℃下保温20-60分钟，然后升温变性开开始常规PCR程序。
有益效果1，引物对的区域可以按常规方法选择或者寻找，没有特定限制，引入错配碱基在引物的5’端，对PCR没有影响。
2，滞后污染的扩增产物经酶分解后完全失去作为模板的功能，即使在低退火温度等非严谨的扩增条件下也不产生干扰。
3，PCR反应液和引物不含任何非天然核苷酸，PCR反应的各项特性与标准PCR保持一致。
4，PCR扩增产物不含任何非天然核苷酸，扩增产物可用于克隆和分子杂交等。
具体实施例方式
实施例1实施例1在正引物引进一个限制性内切酶识别顺序，目标基因分别为人beta-2肾上腺素受体基因(美国国家生物信息中心基因库编号M15169)和人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(美国国家生物信息中心基因库编号XM_006959)。引物顺序和特性示于表2和3。粗体字为限制性核酸内切酶识别顺序，粗体字和下划线为引进的错配碱基，下划线隔开的为内切酶的切割部位。
表2实施例1引物顺序
表3实施例1引物特性及与不同模板的结合强度
由此可见，正引物的5’端引进限制性核酸内切酶识别顺序后，正引物与被内切酶分解后的扩增产物的匹配碱基数均小于10，二者之间不可能再发生退火，滞后污染扩增产物的干扰被完全消除。
实施例2实施例2在正引物和反引物中各引进二个限制性内切酶识别顺序，目标基因为人beta肌动球蛋白基因(美国国家生物信息中心基因库编号BC016045)，引物顺序和特性示于表4和5。粗体字为限制性内切酶识别顺序，粗体字和下划线为引进的错配碱基，下划线隔开的为内切酶的切割部位。
表4实施例2引物顺序
表5实施例2引物特性及与不同模板的结合强度
用Clontech公司的Advantage-2-PCR试剂盒以人基因组DNA为模板进行扩增。每管反应体积25微升，引物浓度0.4uM。PCR程序为首次变性94℃1分钟，循环变性94℃10秒钟，退火和延伸70℃1分半钟，共32循环。反应结束后用电泳和染色方法检测得到长度为172碱基扩增片段。用Biolabs公司的限制性内切酶Acul和Fokl在37℃与反应液保温1小时，电泳结果得到长116碱基的内切酶分解片段。分离提纯该分解片段稀释后作为核酸模板在同样条件下进行PCR，结果没有目标产物的条带出现说明用酶解方法可消除滞后污染扩增产物的干扰。在PCR反应前用上述二种酶作同样处理，反应结束依然得到172碱基扩增片段，说明限制性核酸酶不影响正常核酸模板的扩增。
权利要求
1，一种能克服滞后污染的聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)用限制性内切酶处理PCR反应液；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；其特征在于通过在引物中导入错配碱基在扩增产物中构建原始目标基因所不含有的限制性核酸内切酶识别顺序，且该限制性核酸内切酶切割核酸的部位在其识别顺序的上游4-20碱基。
2，根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于限制性内切酶识别顺序位于引物3’端数起的第8-40碱基。
3，根据权利要求2所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于限制性内切酶识别顺序位于引物3’端数起的第12-25碱基。
4，根据权利要求1-3中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于在正引物、或反引物、或正反引物同时引进错配碱基。
5，根据权利要求1-3所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于在引物内引进错配从而在扩增产物内构建一个以上的限制性核酸内切酶识别顺序。
6，根据权利要求4所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于当同时设计在正引物和反引物时，正反引物的限制性核酸内切酶的识别顺序可以相同或不相同。
全文摘要
本发明提供一种用限制性内切酶克服滞后污染的PCR方法。在引物的5’端引进错配碱基使之在扩增产物中构建一个限制性核酸内切酶的识别顺序，且这类内切酶切割核酸部位在其识别顺序的上游4－20碱基。本发明提供的方法简单可靠，能广泛用于PCR临床诊断有效克服滞后污染所造成的严重弊端。本发明方法扩增产物不含任何非天然核苷酸可用于PCR克隆等分子生物学研究所需。
文档编号C12P19/00GK1718736SQ20041002579
公开日2006年1月11日 申请日期2004年7月7日 优先权日2004年7月7日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯 申请人:徐定邦, 徐文慧