专利名称：以离子交换层析为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种以离子交换为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法。
背景技术：
血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率和死亡率居各种疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法。但当前的溶栓剂，如尿激酶、链激酶、重组组织型纤溶酶原激活剂等，存在半衰期短、副作用大、价格昂贵等各种缺点，难以成为适用的大众药品。1987年须见洋行在日本的传统发酵食品纳豆中发现了一种具有强烈纤溶活性的酶，定名为纳豆激酶(nattokinase，NK)。研究表明，纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，能显著溶解体内外血栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间(ELT)，并能刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂(t-PA)，从而更有效地发挥溶栓效果。因此纳豆激酶是一种很有潜力的新型口服溶栓药物。
Fujita等从固体发酵纳豆中分离纯化纳豆激酶，工艺为生理盐水抽提纳豆激酶，加入硫酸铵在25％饱和度下过夜，再于4℃，7000r/min离心40min，收集上清上Butyl-Toyopearl疏水柱，收集活性峰再次进行饱和度25％的硫酸铵沉淀，取上清进行饱和度60％的硫酸铵沉淀，然后上CM-Toyopearl离子交换柱，收集活性峰再上Sephadex-G50，收集活性峰并透析过夜。该工艺操作复杂，收率低，最终获得的产品很少。俞丽华以三倍乙醇沉淀发酵离心出菌后的上清液，然后上Hitrap CM-Sepharose-FF 1ml柱层析纯化，最终回收率为85.4％，纯化倍数为8.1倍。此方法回收率高，但是操作容量有限，生产成本高，不适应于大规模纳豆激酶的制备。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本低、周期短、方法简单、易于掌握、产品纯度高的以离子交换为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法。
其方法步骤如下1)工程菌发酵从固体培养基上挑取表达纳豆激酶的单菌落接入10～200ml的种子培养基中，150～300rpm下摇床培养8～25小时，按1％～5％接种量接入发酵培养基中，，再在28～37℃、150～300rpm下发酵罐培养100～150小时；2)硫酸铵分级沉淀用冷冻离心机将发酵液于0～20℃下以2000～10000rpm的速度离心8～15min，收集上清液，在上清液中加入10～40％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，2000～10000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至60～85％的饱和度，2000～10000rpm离心收集沉淀，将沉淀重悬于10～100mM、pH6～8的磷酸缓冲液中，2000～10000rpm离心10～30min收集上清液，于0～20℃保存备用；3)凝胶层析分离用层析系统将上清液以10～100cm/h的线速度加入凝胶层析柱中，用10～200mM的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm和260nm进行检测，收集保留体积为9～15ml处的洗脱液，收集液体积为3～6ml；4)离子交换层析分离用层析系统将洗脱液液以15～75cm/h的线速度加入层析柱中，用含有0.2～2M、pH6～8的磷酸缓冲液和0.1～1M的NaCl以相同的线速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、260nm进行检测。收集含纳豆激酶的活性峰洗脱液，洗脱液于0～10℃条件下保存备用；5)冷冻干燥收集活性蛋白将收集的活性洗脱液在去离子水中进行透析脱盐16-32h后，置于-20℃冰箱下冷冻12-24h将其进行冷冻干燥。干燥时间为24～48h。
本发明的优点1)分离工艺简单、生产周期短、产品纯度高本分离纯化工艺由硫酸铵分级沉淀、凝胶层析与离子层析操作单元组成。硫酸铵分级沉淀约为5小时，凝胶层析约为3小时，离子交换层析约为2小时，最终获得的纳豆激酶经SDS凝胶电泳分析后为单一条带，说明得到的产品纯度很高；2)作用条件温和、见效快纳豆激酶的等电点为8.7，利用阳离子交换剂，在低于纳豆激酶等电电的pH下与介质在非变性状态下依靠静电相互作用与其它蛋白质进行分离，作用条件温和；3)生产自动化水平高，操作方便本生产工艺采用KTA explorer 100层析分析系统，可通过波长280nm、260nm的吸收值在线检测纳豆激酶的存在与否；4)占地小、成本低本分离生产操作仅需二十多平方米的实验室即可进行。
本菌种于2004年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。包藏中心登记入册编号CGMCC No.1177。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作详细说明用以离子交换层析为主要手段的分离纯化方法制备纳豆激酶，其具体步骤如下1)纳豆激酶的液体发酵从同体培养基上挑取表达纳豆激酶的单菌落接入10～200ml的种子培养基中，150～300rpm下摇床培养8～25小时，按1％～5％接种量接入发酵培养基中，再在28～37℃、150～300rpm下发酵罐培养100～150小时；2)硫酸铵分级沉淀用冷冻离心机将发酵液于0～20℃下以2000～10000rpm的速度离心8～15min，收集上清液，在上清液中加入10～40％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，2000～10000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至60～85％的饱和度，2000～10000rpm离心收集沉淀，将沉淀重悬于10～100mM、pH6～8的磷酸缓冲液中，2000～10000rpm离心10～30min收集上清液，于0～20℃保存备用；3)凝胶层析分离用层析系统将上清液以10～100cm/h的线速度加入凝胶层析柱中，用10～200mM的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm和260nm进行检测，收集保留体积为9～15ml处的洗脱液，收集液体积为3～6ml；4)离子交换层析分离用层析系统将洗脱液液以15～75cm/h的线速度加入层析柱中，用含有0.2～20mM、pH6～8的磷酸缓冲液和0.1～1M的NaCl以相同的线速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、260nm进行检测。收集含纳豆激酶的活性峰洗脱液，洗脱液于0～10℃条件下保存备用；5)冷冻干燥收集活性蛋白将收集的活性洗脱液在去离子水中进行透析脱盐16-32h后，置于-20℃冰箱下冷冻12-24h，再将其进行冷冻干燥，干燥时间为24～48h；在本发明中所用设备及材料如下1)菌种菌种为Bacillus subtilis MLH-02，菌种编号为CGMCC No.1177；2)培养基种子培养基(g/l)LB液体培养基；发酵培养基(g/l)酵母提取物5，胰蛋白胨22.7，木糖25，Na2HPO45.37，NaH2PO41，CaCl20.2，MgSO40.5，pH7.0；固体培养基(g/l)酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 5.0，pH 7.0，琼脂8；3)设备电泳仪(Mini-Proten3cell)购自Bio-RAD公司；层析系统(KTA explorer100)、层析柱(XK16/20)、凝胶(Superdex 75)、离子交换介质(SP Sepharose FastFlow)购自Amersham Pharmacia Biotech AB.Sweden；其他试剂均为市售的分析纯试剂。
实施例11)工程菌发酵从固体培养基上挑取表达纳豆激酶的单菌落接入10ml的种子培养基中，150rpm下摇床培养8小时，按1％接种量接入发酵培养基中，，再在28℃、150rpm下发酵罐培养100小时；2)硫酸铵分级沉淀用冷冻离心机将发酵液于0℃下以2000rpm的速度离心8min，收集上清液，在上清液中加入10％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，2000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至60％的饱和度，2000rpm离心收集沉淀，将沉淀重悬于10mM、pH6的磷酸缓冲液中，2000rpm离心10min收集上清液，于0℃保存备用；3)凝胶层析分离用层析系统将上清液以10cm/h的线速度加入凝胶层析柱中，用10mM的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm和260nm进行检测，收集保留体积为9处的洗脱液，收集液体积为3；4)离子交换层析分离用层析系统将洗脱液液以15cm/h的线速度加入层析柱中，用含有0.2M、pH6的磷酸缓冲液和0.1的NaCl以相同的线速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、260nm进行检测。收集含纳豆激酶的活性峰洗脱液，洗脱液于0℃条件下保存备用；5)冷冻干燥收集活性蛋白将收集的活性洗脱液在去离子水中进行透析脱盐16h后，置于-20℃冰箱下冷冻12h将其进行冷冻干燥。干燥时间为24h。
实施例21)工程菌发酵从固体培养基上挑取表达纳豆激酶的单菌落接入200ml的种子培养基中，300rpm下摇床培养25小时，按5％接种量接入发酵培养基中，，再在37℃、300rpm下发酵罐培养150小时；2)硫酸铵分级沉淀用冷冻离心机将发酵液于20℃下以10000rpm的速度离心15min，收集上清液，在上清液中加入40％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，10000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至85％的饱和度，10000rpm离心收集沉淀，将沉淀重悬于100mM、pH8的磷酸缓冲液中，10000rpm离心30min收集上清液，于20℃保存备用；3)凝胶层析分离用层析系统将上清液以100cm/h的线速度加入凝胶层析柱中，用200mM的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm和260nm进行检测，收集保留体积为15ml处的洗脱液，收集液体积为6ml；4)离子交换层析分离用层析系统将洗脱液液以75cm/h的线速度加入层析柱中，用含有2M、pH8的磷酸缓冲液和1M的NaCl以相同的线速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、260nm进行检测。收集含纳豆激酶的活性峰洗脱液，洗脱液于10℃条件下保存备用；5)冷冻干燥收集活性蛋白将收集的活性洗脱液在去离子水中进行透析脱盐32h后，置于-20℃冰箱下冷冻24h将其进行冷冻干燥。干燥时间为48h；实施例31)工程菌发酵从固体培养基上挑取表达纳豆激酶的单菌落接入50ml的种子培养基中，240rpm下摇床培养10小时，按4％接种量接入发酵培养基中，再在30℃、220rpm下发酵罐培养120小时；2)硫酸铵分级沉淀用冷冻离心机将发酵液于4℃下以8000rpm的速度离心20min，收集上清液，在上清液中加入20％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，8000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至60％的饱和度，8000rpm离心收集沉淀，将沉淀重悬于10mM pH6.4的磷酸缓冲液中，8000rpm离心20min收集上清液，于4℃保存备用；3)凝胶层析分离用层析系统将上清液以30cm/h的线速度加入凝胶层析柱中，用10mM的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm和260nm进行检测，收集保留体积为9～15ml处的洗脱液，收集液体积为6ml；4)离子交换层析分离用层析系统将洗脱液液以90cm/h的线速度加入层析柱中，用含有20mM、pH6.4的磷酸缓冲液和1M的NaCl以相同的线速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、260nm进行检测。收集含纳豆激酶的活性峰洗脱液，洗脱液于4℃条件下保存备用；5)冷冻干燥收集活性蛋白将收集的活性洗脱液在去离子水中进行透析脱盐16h后，置于-20℃冰箱下冷冻12h，再将其进行冷冻干燥，干燥时间为48h。
权利要求
1.一种以离子交换层析为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法，其特征在于其方法步骤如下1)硫酸铵分级沉淀用冷冻离心机将发酵液于0～20℃下以2000～10000rpm的速度离心8～15min，收集上清液，在上清液中加入10～40％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，2000～10000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至60～85％的饱和度，2000～10000rpm离心收集沉淀，将沉淀重新溶解于5～100mM、pH5～8的磷酸缓冲液中，2000～10000rpm离心10～30min收集上清液，于0～20℃保存备用；2)凝胶层析分离用层析系统将上清液以10～100cm/h的线速度加入凝胶层析柱中，用10～200mM的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm和260nm进行检测，收集保留体积为9～15ml处的洗脱液，收集液体积为3～6ml；3)离子交换层析分离用层析系统将洗脱液液以15～75cm/h的线速度加入层析柱中，用含有0.2～2M、pH6～8的磷酸缓冲液和0.1～1M的NaCl以相同的线速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、260nm进行检测。收集含纳豆激酶的活性峰洗脱液，洗脱液于0～10℃条件下保存备用；4)冷冻干燥收集活性蛋白将收集的活性洗脱液在去离子水中进行透析脱盐16-32h后，置于-20℃冰箱下冷冻12～24h，再将其进行冷冻干燥，干燥时间为24～48h。
2.根据权利要求1所述的一种以离子交换层析为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法，其特征在于其方法步骤如下1)硫酸铵分级沉淀用冷冻离心机将发酵液于0～4℃下以8000～10000rpm的速度离心8～10min，收集上清液，在上清液中加入10～30％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，8000～10000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至75～85％的饱和度，8000～10000rpm离心收集沉淀，将沉淀重新溶解于10～30mM、pH6～7的磷酸缓冲液中，8000～10000rpm离心15～25min收集上清液，于0～4℃保存备用；2)凝胶层析分离用层析系统将上清液以10～30cm/h的线速度加入凝胶层析柱中，用10～20mM的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm和260nm进行检测，收集保留体积为10～13ml处的洗脱液，收集液体积为3～6ml；3)离子交换层析分离用层析系统将洗脱液液以30～45cm/h的线速度加入层析柱中，用含有0.2～1M、pH6～7的磷酸缓冲液和0.1～5M的NaCl以相同的线速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、260nm进行检测。收集含纳豆激酶的活性峰洗脱液，洗脱液于0～4℃条件下保存备用；4)冷冻干燥收集活性蛋白将收集的活性洗脱液在去离子水中进行透析脱盐18～22h后，置于-20℃冰箱下冷冻14～18h，再将其进行冷冻干燥，干燥时间为36～40h。
3.根据权利要求2所述的一种以离子交换层析为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法，其特征在于其方法步骤如下1)工程菌发酵从固体培养基上挑取表达纳豆激酶的单菌落接入10～200ml的种子培养基中，150～300rpm下摇床培养8～25小时，按1％～5％接种量接入发酵培养基中，再在28～37℃、150～300rpm下发酵罐培养100～150小时，上述所需菌种编号为CGMCC No.1177；2)硫酸铵分级沉淀用冷冻离心机将发酵液于4℃条件下以10000rpm的速度离心20min，离去菌体，收集上清液，在上清液中加入20％饱和度的(NH4)2SO4，静置4小时，再以10000rpm离心25min收集上清液，然后继续在上清液中加入(NH4)2SO4至60％的饱和度，以10000rpm的速度离心25min收集沉淀，将沉淀重悬于10mM pH7.0的磷酸缓冲液中，10000rpm下再离心25min收集上清液，于4℃保存备用；3)凝胶层析分离用自动层析系统将1mL上清液以30.0cm/h的线速度加入柱床高度为12cm的Superdex 75凝胶层析柱中，用10mM的磷酸缓冲液以与进样相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm、260nm下进行检测，收集保留体积为约为50.0ml处的洗脱液，收集液体积为25mL；4)离子交换层析分离用层析系统将活性洗脱峰以2.5mL以75cm/h的线速度加入阳离子交换介质为SP Sepharose Fast Flow，柱高为10cm的XK16/20层析柱中，用含有10mM、pH6.4的磷酸缓冲液和1M NaCl进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、260nm下进行检测，收集含纳豆激酶的活性峰洗脱液，洗脱液于4℃条件下保存备用；5)冷冻干燥将收集的活性洗脱液在去离子水中进行透析脱盐16h后，置于-20℃冰箱下冷冻12h将其进行冷冻干燥。干燥时间为32h。
全文摘要
本发明公开了一种以离子交换层析为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法。它的纯化步骤由粗酶液的制备、凝胶层析和离子交换层析组成，将保存的枯草芽孢杆菌经斜面活化、种子培养基培养、发酵培养基发酵，纳豆激酶由枯草杆菌分泌至发酵液；将发酵培养基离心收集上清发酵液，然后进行(NH
文档编号C12N9/52GK1594560SQ200410025769
公开日2005年3月16日 申请日期2004年6月29日 优先权日2004年6月29日
发明者梅乐和, 高大海, 林东强, 姚善泾 申请人:浙江大学