专利名称：一种构建和生产限制性内切酶Ecop15I的方法
技术领域：
本发明涉及重组III型限制性Ecop151内切酶共表达质粒的构建、表达与纯 化，属于生物工程领域。通过本发明所提供的方法，获得了纯度较高、活力较 好的重组型Ecopl5I限制性内切酶，为大规模生产提供了有效的途径。同时，所 述的Ecopl51内切酶可以作为基因表达序列分析和相关基因识别的工具，具有很 好的应用价值。
背景技术：
"限制性内切酶" 一般认为是能识别双链DNA上4到8个核苷酸的特异性 序列，且能切割该序列的内切酶的总称。目前，已报道有2900余种限制一修饰 (R/M)系统被鉴别，根据其亚基组成、催化机制、酶切位置、识别序列、辅助 因子等因素，限制性内切酶可分为三大类。I型限制性内切酶是一类兼有限制性 和甲基化活性的多亚基蛋白复合体，可以在远离其识别位点处任意切割DNA链。 II型限制性内切酶是独立于对应甲基化酶的一种限制酶，其在识别位点之中或临 近的确定位点特异性地切开DNA链，产生确定的序列末端、限制片段，II型限 制性内切酶大部分都具有严格的底物特异性，识别4 6bp的回文序列。III型限 制性内切酶是兼有限制、修饰两种功能的酶，主要识别反向重复序列，在识别 位点之外不完全地切开DNA链。
限制性内切酶Ecopl51是大肠杆菌P15质粒编码的III型限制性内切酶，是 由2个Mod亚基和2个Res亚基折叠形成407KDa大小的低聚复合酶。Mod亚 基通过限制与修饰的竞争作用来实现识别和修饰双重功能，其识别未甲基化的、 反向的、非回文结构的序列(5'-CAGCAG-3，)。Ecopl5I在识别位点下游上链(Top strand) 25 26nt位置和下链(Bottom strand) 27或28位置，在辅助因子Mg2+ 和ATP的作用下，酶切DNA序列。特别对DNA具有一对未甲基化的、反向的、 且具有一定空间距离的、对立位置的识别位点，酶切最为有效。其主要用途是 在基因表达分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE )中具有重要作用， 传统的SAGE仅能标签14个碱基序列，而在改进的"longSAGE "方案中也只有21个碱基序列的标签，而Ecopl51可以标签超过25个碱基序列，提高 了鉴定基因的效率和正确率。Ecopl51对基因的结构和表达的修饰发挥了很大的 作用，从而为各种医学、药物和农业应用提供了巨大的潜力。
III型限制性内切酶Ecopl51在基因表达系列分析具有重要作用，但是目前 缺少实现大规模的表达和纯化的方法。目前生产这种酶的方式和一般限制性内 切酶并无不同，其步骤一般是
1、 通过重组DNA技术，从微生物中获得目的基因并加以克隆。 常使用噬菌体感染用于识别和选择限制性酶的克隆，但此法成功率较低。
这种方法是以包含转移限制一修饰系统为最初特征，由质粒装载到大肠杆菌克 隆载体上。此法通过克隆不断增加的限制一修饰系统，包含通过选择有甲基酶 基因活性地克隆，但这一选择系统并不总是得到完全的限制系统，而是只产生 出甲基化酶基因。在构建质粒库后，然后将其在适用宿主上转化，制备含内切 酶的粗提物，通过活性分析筛选出所需的克隆。
2、 采用一些工艺技术对含有限制性内切酶基因的克隆进行过表达。 这些技术能够被单独或结合使用以获得限制性酶最大量的表达，主要有
(1)、启动子通过大肠杆菌能够被很好的识别，直接插入到上游起始部分；(2)、 插入一个位于基因上游的核糖体结合位点；(3)、通过定向诱变或使用密码子自 身合成基因从而改变基因的DNA序列；(4)、使用多聚酶链式反应(PCR)和 合成基因5'端和3'端的杂交引物而放大表达。
3、 在合适的培养基中，用发酵器增值携带该内切酶修饰性和限制性的克隆， 以生产该限制性核酸内切酶，然后经离心收获细胞并经超声振荡破坏之，制得 含限制性内切酶活性的细胞粗提物；
4、 用标准的蛋白质纯化技术如亲和层析或离子交换层析法纯化含限制性内 切酶活性的细胞粗提物。
采用上述传统方法，对于大规模生产III型限制性内切酶EcoP15I存在以下问
题
1. Ec叩15I限制性内切酶是野生型大肠杆菌P15质粒编码的，在没有EcoP151 基因克隆来源或来源较困难的情况下，需要人工合成来获得目的基因。
2. Ecopl5I是一个407KDa大小的低聚复合酶，具有Mod和Res2段基因。在E.coli pl5质粒中，具有Mod和Res两个开放阅读框(ORF)，具有活性的限制性 内切酶实质上是Mod2Res2这样一个四聚体。而采用上述技术无法有效表达III型 限制酶Ecopl5I这样一种结构的酶，因此需要新方法改进表达系统。
3.采用传统方法对EcoP15I进行纯化，产物一般是DNA转甲基酶(Mod2)和限 制性内切核酸酶(Mod2Res2)的混合物。纯化lmg酶， 一般需要7-8升细菌培养液， 并且整个纯化过程需要10-14天，由此得到的产量是0.1mg/g细胞。另一个问题 是，有限的保存稳定性，尤其是工艺上冰冻的EcoP15I融化后是无活性的。
较之上述传统方法，本发明具有以下特色
本发明首先利用重叠PCR的方法，人工合成长片段基因，获得目的基因。 该方法能用于一些来源困难的基因，或来源危险(诸如病毒基因)的基因的人 工合成。Ecopl5I限制性内切酶是大肠杆菌P15质粒编码的，在没有基因克隆来 源或来源较困难的情况下，采用了人工合成的方法，获得目的基因。并且分析 了Ec叩15I基因编码的密码子频率，与大肠杆菌BL21(DE3)密码子频率比较，稀 有密码子出现的频率比较低。
其次，本发明最主要的特色是选择了大肠杆菌共表达的方式，以表达 Ecopl51酶这样具有2个及2个以上单体的蛋白复合体。III型限制性酶Ecopl51 是一个407KDa大小的复合酶，具有2个Mod亚基和2个Res亚基。若单纯融 合2段基因，表达较高分子量的融合蛋白，表达效果不好，且可能由于2段蛋 白单体的融合，引起了折叠结构的改变，影响了蛋白复合体的生物学活性。而 本发明利用共表达的方法可以解决这一问题，并且操作简便易行。
纯化效率较高，纯化lmg酶仅仅需36ml细菌培养液，整个纯化时间需要5-7 天，EcoP15I产量约为5.6-6.6mg/g细胞，产量较高。此夕卜，本发明生产的EcoP151, 放置于4。C和-20T长时间活力保持不变，稳定性较高。
发明内容
本发明提供了一种有效的方法和表达系统，可用于大规模生产m型限制性
内切酶Ecopl51。本发明利用生物工程的方法，根据Genebank中的Ecopl5I基因序 列，设计数十对引物，利用重叠延伸PCR的方法(OverlappingPCR)，人工合成 获得了目标序列(见附图l)。合成好的两段基因再分别亚克隆到具有两个独立
6T7启动子、核糖体结合位点的共表达载体pACYCDuet-l中，在Res亚基C端和Mod 亚基N端分别各融合了6XHisTag。通过镍亲和层析、离子交换层析方法，制备 了纯度高达95%以上、活力与商业化Ecopl5I相似的重组型限制性内切酶。
本法明的主要特色就是构建III型内切酶Ecopl51共表达质粒。目前共表达 的实现途径主要有双/多载体共转化法，双/多顺反子法和双/多启动子载体法等。 对于双/多载体共转化法，寻找具备用不同的抗生素标记、质粒兼容性好的表达 载体较为困难，并且很难有有效的方法来维持质粒间的拷贝数平衡，难于控制 不同亚基的表达量多少。选择利用多顺反子单质粒表达，虽然在基因转录时 mRNA是等量的，但是翻译过程却是相对对立的；而在双顺反子载体中，有研 究表明，翻译水平并不能够平衡，置于IRES (internal ribosome entry site，内部 核糖体进入位点)下游的外源基因的表达量是其上游帽启动翻译基因的20。％ 50% ，即以IRES启动的翻译效率没有帽依赖的翻译效率高。
针对Ecopl51这样的III型限制性内切酶，选择多启动子共表达载体可以同 时表达2个或多个蛋白单体的特点，将限制性内切酶两个单体分别克隆到其两 个独立的表达单元中，同时表达所需蛋白的2个亚基。在表达的过程中2个亚 基互相作用，折叠成具有生物活性的四级结构，这种共表达方式具有无可比拟 的优势。因Ecopl5I区别于II型限制性内切酶，单独的Res亚基是没有酶切活 性，需和Mod形成四级结构的蛋白复合体才能行使其生物学功能。这就要求必 须同时表达和纯化这个蛋白两个亚基，并且控制和保持2个亚基的表达量的相 对平衡。由于大肠杆菌本身对于Ecopl51共表达的这2个亚基不存在翻译的偏好 性，因而不管其基因顺序如何，均可以平衡二者之间的表达量。
这样的表达方式在其它II型限制性内切酶克隆与表达中，也具有很多优点 在之前的II型限制性内切酶克隆与表达中，需提前筛选具有抗此限制酶的，含 有同源甲基化酶的宿主菌。若利用多表达载体，同时表达R-M系统中的2个酶， 表达出的甲基化酶就修饰了宿主菌和质粒的DNA，防止表达出的限制酶对宿主 菌的毒性作用。将其中限制酶融合纯化标签，便能够方便的分离纯化出所需的 酶。
本发明提供了III型限制性内切酶Ecopl5I共表达质粒的构建、表达与纯化的 方法，其基本步骤是(见附图2):1. 基因的合成和克隆
(1)设计融合表达序列从NCBI网站上获得Ecopl5I基因序列(Genbank 号AJ634453)，考虑到方便下游酶蛋白纯化要求，Res亚基C端和Mod亚基N 端各自分别融合带有了 6 X His Tag,并在每段序列两端添加特异酶切位点；
(2 )设计引物根据Overlapping Oligo皿cleotides的原理设计数十对引物，
(3) 合成全长基因并克隆OverlappingPCR的方法人工合成全长基因，分 别平端克隆到pUC57质粒中，测序后选择序列完全正确的全长基因克隆；
(4) 基因的亚克隆将Res和Mod亚基分别先后装到pACYCDuet-l中的 两个表达调控区中，获得了pACYC—P15共表达质粒。
2. Ecopl51的转化和表达
(1) 将pACYC一P15共表达质粒转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，涂 布于含有氯霉素抗性的LB平皿中，挑菌培养，诱导后离心收菌；
(2) 全菌蛋白电泳分析，通过比较电泳条带，选择正确表达Ecopl5I酶条 带并且表达量相对较好的单克隆，作为扩大培养的工程菌；
(3) 优化表达，通过菌浓度(OD600)梯度，IPTG诱导浓度梯度，诱导时 间梯度等作为优化因素，进行正交实验；
(4) 通过SDS-PAGE电泳，比较不同参数下可溶性蛋白的表达量，以确定 大批量纯化的参考条件。
3. Ecopl5I扩大培养和纯化
(1) 接Ecopl5I工程菌，培养于带有氯霉素抗性的LB液体试管中，振荡 培养过夜；
(2) 将过夜菌液转接至2L三角瓶中培养至OD-0.6左右，加入IPTG诱 导，最后离心收集菌体；
(3) Ni柱结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体；离心取上清粗蛋白；将 上清粗蛋白溶液过镍亲和层析纯化柱，分步收集。取纯度和浓度较高的收集样 混合、透析；
(4) 将透析好的蛋白溶液过阴离子DEAE离子交换层析柱，步进式洗脱， 分步收集。取纯度和浓度较高的收集样混合、透析。并用Bradford法，测Ecopl51 总浓度。
图1 .用重叠PCR方法合成Ecop151目标序列。
图2.生产III型限制性内切酶Ecop 151工艺流程图。
图3. Ecopl5IMod和Res亚基的合成与克隆。
图4. Ecop 15I的亚克隆获得共表达载体pACYC—P15质粒。
图5. Ecopl5I镍亲和柱纯化后电泳图。
图6. Ecopl51 DEAE离子交换纯化后电泳图。
图7. Ecopl5I酶切pUC19质粒电泳图。
具体实施方式
实施例l、材料和试剂
1. 材料
质粒和细胞株pUC19、 pUC57为百奥生物技术(南通)有限公司(南通百 奥)产品，共表达载体pACYCDuet-l购于Novagen公司，克隆菌株ToplO与表 达菌株BL21 (DE3)均购于北京天根生物技术有限公司，根据分子克隆CaCl2 法自制感受态，保证效价在106 (CFU/ugpUC19)以上。
2. 试剂-
(1) 工具酶TaqDNA聚合酶，Pfb DNA聚合酶(南通百奥)；限制性酶 类，Smal、 BamHI等(New England Biolabs); T4 DNA连接酶(New England Biolabs);
(2) 生化试剂Yeast、 Typtone、 Tris碱、甘氨酸、SDS、琼脂糖等(上海 生工)；
(3) DNA纯化试剂盒普通型质粒回收试剂盒，琼脂糖凝胶DNA回收试 剂盒(南通百奥)；
(4) 层析填料Ni琼脂糖凝胶亲和填料；DEAE琼脂糖凝胶阴离子交换填 料；CM琼脂糖凝胶阴离子交换填料(北京韦氏博慧)。
实施例2、实验方法 1.基因的人工合成从NCBI网站上获得Ecopl51基因序列(Genbank号AJ634453)，设计融合 表达序列。考虑到方便下游酶蛋白纯化要求，在Ec叩151的Res亚基C端和Mod 亚基N端各自分别融合带有了 6 X His Tag。
根据overlapping oligonucleotides的原理设计数十对引物，两端引物的Res 和Mod片段头尾两端分别添加了KpnI、 XhoI和Bamffl、 Sail的酶切位点，并 在BamHI酶切位点后添加一个G碱基，以确保酶序列在翻译过程中阅读框的正 确。对近3kbRes基因片段，通过中间唯一的BglII酶切位点，将Res片段分为 2段，再用KpnI和BglII和酶切后，用T4连接酶连接，完整的Res基因片段。 两段基因分别合成后，平端克隆到载体pUC57中，42"C热激法转化大肠杆菌 TOP10感受态，进行蓝白斑筛选，再通过菌检PCR方法，初步获得阳性克隆， 进一步利用碱裂解法抽提试剂盒抽提阳性克隆质粒进行测序，对于基因的点突 变和碱基缺失，进行PCR修复，以获得测序结果完全正确的质粒。
2. 基因的亚克隆
利用设计好的酶切位点，采用双酶切的方法，将Res和Mod亚基先后分别 装到pACYCDuet-l中的两个表达调控区中，获得了 pACYC-P15共表达质粒。
3. Ecopl51的表达与纯化
(1) Ecopl51转化与优化表达 将pACYC—P15共表达质粒用42r热激法转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3) 中。涂布于含有氯霉素抗性的LB平皿中，37'C倒置培养过夜。6小时后分别挑 取8个单菌落于4ml含有氯霉素抗性的LB试管中，同时转接未转化BL21(DE3) 于无氯霉素抗性的LB中，37°C、 220rpm振荡培养。6小时后，待菌长到一定浓 度后，吸0.8ml菌液，与0.21111灭菌甘油(80%)混合保存菌种。剩余约3ml的 菌液用终浓度为lmMIPTG诱导3小时后(同时留一管不诱导作为对照)。2个 对照和诱导菌同时离心收菌，用原菌液量的1/10体积的20mMTris-Cl (pH8.0) 重悬离心洗涤沉淀，重复一次。取悬液20ul加入5ul SDS-PAGE上样缓冲液， 煮沸10分钟后电泳。比较电泳表达条带，进而确定正确表达Ecopl5I酶并且表 达量相对较好的单克隆，作为扩大培养的工程菌。进而再通过菌浓度(OD600) 梯度，IPTG诱导浓度梯度，诱导时间梯度等作为优化因素，进行正交实验。通 过SDS-PAGE电泳，比较不同参数下可溶性蛋白的表达量，以确定大批量纯化的条件。
(2) Ecopl51的扩大培养和纯化
吸40ul (1%接菌量)保存在甘油中的工程菌，培养于4ml带有氯霉素抗性 的LB液体试管中。37°C、 220rpm振荡过夜。
约4小时后将过夜菌按1%的接菌量，转接至含氯霉素抗性的LB液体的三 角瓶中，37°C、 220rpm振荡培养，待生长至OD600二0.6左右时，加入IPTG 使其终浓度为0.5mM，诱导4小时，将菌液置于冰水混合物中冷却30分钟；4 °C 、6000rpm离心15分钟，收集的沉淀菌体，用1/10体积4。C预冷的20mM Tris-Cl (pH8.0)重悬洗涤菌体，重复一次后将菌体保存于-20度。
用80ml Ni柱结合缓冲液(50mM Tris-HCl， 500mM NaCl， 1 OmM 2-巯基乙 醇，0.1%TritonX-100， 20mM咪唑，pH8.0)重悬菌体，在4。C条件下超声波破 碎，工作2秒暂停6秒持续30min。 4°C、 13000rpm离心20分钟后，留取上清。 将上清液过Ni结合缓冲液平衡好的Ni柱；用10倍柱床体积的Ni洗涤缓冲液 (含50mM咪唑)洗涤；Ni洗脱缓冲液(含150mM咪唑)洗脱，用1.5ml离心 管分管收集后电泳。选取浓度较高的4管混合。用DEAE结合缓冲液(50mM Tris-HCl， 10mM 2-巯基乙醇，pH8.0)透析过夜。
将透析好的8.7ml蛋白样过平衡好的DEAE阴离子交换柱，用10倍柱床体 积的DEAE洗涤缓冲液洗涤。步进式洗脱，分管收集后电泳。选取浓度高且纯 度较好的3管混合。用保存缓冲液(10mMTris-HCl， 100mMNaCl， lmMDTT， O.lmMEDTA， 50%甘油，pH7.4)透析，获得3.7ml蛋白收集液，保存于-2(TC。 并用Bradford法，样品稀释30倍，BSA作为标准品，测Ecopl5I总浓度。
实施例3、实验结果
(1) pACYC_P15共表达质粒构建结果
Ecopl 51的Res亚基和Mod亚基共人工PCR合成3段基因，分别为Eco一Mod、 Eco—Resl和Eco—ResII (见附图3所示)。三段基因分别通过平端克隆，装载到 pUC57中，获得pMod， pRes_I和pRes一II三个质粒；将pRes」和pRes—II用 BglII和NotI双酶切后，T4连接酶酶连，获得完整的Res片段的质粒。
将pMod质粒与pACYCDuet-1质粒BamHI和Sail双酶切后酶连，获得包
li含Mod亚基的pACYC_Mod质粒，再与pRes—All质粒Kpnl和Xhol双酶切后 酶连，获得包含完整的Ecopl5I两个亚基pACYC—P15质粒(见附图4所示)。
(2) Ecopl5I表达与纯化
利用诱导时间梯度，IPTG诱导浓度梯度，菌浓度梯度，培养温度等作为优 化表达因素，正交实验，获得了培养及诱导温度为37°C，诱导菌浓度为对数生 长期中期，即OD600二0.6左右时，以IPTG终浓度为0.5mM诱导，3小时后离 心收菌。
经过Ni亲和层析，将单管收集的蛋白液进行SDS-PAGE电泳得到了 Ecopl51 的较好的纯化效果(见附图3)。由附图5可知，2条表达条带的分子量在74KDa 和110Kda左右，与预计结果一致，证明该条带是纯化的Ecop151。其中泳道l 4蛋白量要普遍高于其他泳道，选取这4管混合透析，进一步进行DEAE离子交 换层析层析纯化(见附图4)。由附图6可知，3 5泳道的蛋白量和蛋白纯度要 高于其他泳道，选择这3管用保存缓冲液透析后-2(TC保存。利用Bandscan软件 对SDS-PAGE图片进行分析，Ecopl51的表达量(两个亚基总量)约占E.coli总蛋 白的15%左右。经过第一次Ni亲和层析纯化后，就已经达到了 95%以上的纯 度，再经过DEAE阴离子交换层析纯化后，2个亚基的纯度均在97%以上。
用Bradford法，Ni亲和层析后蛋白收集液的浓度在6.6mg/ml,总蛋白量近 60mg; DEAE离子交换层析后蛋白收集液的浓度在5.6mg/ml。 800ml菌液共获 得22mg左右的蛋白。
(3) Ecopl51的活性检测
将纯化的Ecopl51梯度酶切pUC19质粒，37。C酶切30min后，65°C20min 灭活。NEB的Ecopl51作为正对照，如附图7所示，纯化的Ecopl51酶与NEB 的酶，在0.5ul时，具有同样的酶活力。
(4) Ecopl5I稳定性分析 将保存于储存缓冲液中的Ecopl5I酶，放置于4。C和-20。C， 4周后，经蛋白
SDS-PAGE电泳，没有发现降解。酶切pUC19检测，活力基本保持不变。氨基酸序列表SEQUENCE LISTING
<110>百奥生物技术(南通)有限公司
<120> —种构建和生产限制性内切酶Ecop151的方法
<130> 无
<160> 2
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 658
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223>人工序列描述重组Ecopl5IMod亚基
<220>
<221〉 DOMAIN <222> (5)..(10)
<223> 6个组氨酸镍亲和层析标签 <400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Gin Asp Pro Met Lys15 10 15
Lys Glu Thr He Phe Ser Glu Val Glu Thr Ala Asn Ser Lys Gin Leu 20 25 30
Ak Val Leu Lys Ala Asn Phe Pro Gin Cys Phe Asp Lys Asn Gly Ala
35 40 45
Phe lie Gin Glu Lys Leu Leu Glu lie lie Arg Ala Ser Glu Val Glu
50 55 60
Leu Ser Lys Glu Ser Tyr Ser Leu Asn Trp Leu Gly Lys Ser Tyr Ala 65 70 75 80
Arg Leu Leu Ala Asn Leu Pro Pro Lys Thr Leu Leu Ala Glu Asp Lys
85 卯 95
Thr His Asn Gin Gin Glu Glu Asn Lys Asn Ser Gin His Leu Leu lie 訓 105 110
Lys Gly Asp Asn Leu Glu Val Leu Lys His Met Val Asn Ala Tyr Ala
115 120 125
Glu Lys Val Lys Met lie Tyr lie Asp Pro Pro Tyr Asn Thr Gly Lys
130 135 140
Asp Gly Phe Val Tyr Asn Asp Asp Arg Lys Phe Thr Pro Glu Gin Leu 145 150 155 160
Ser Glu Leu Ala Gly lie Asp Leu Asp Glu Ala Lys Arg lie Leu Glu
165 170 175
Phe Thr Thr Lys Gly Ser Ser Ser His Ser Ala Trp Leu Thr Phe lie
180 185 190
Tyr Pro Arg Leu Tyr lie Ala Arg Glu Leu Met Arg Glu Asp Gly Thr
195 200 205
He Phe lie Ser lie Asp His Asn Glu Phe Ser Gin Leu Lys Leu Val
210 215 220
Cys Asp Glu He Phe Gly Glu Gin Asn His Val Gly Asp Leu Val Trp 225 230 235 240Lys Asn Ala Thr Asp Asn Asn Pro Ser Asn lie Ala Val Glu His Glu
245 250 255
Tyr lie lie Val Tyr Thr Lys Asn Lys Glu Gin Leu lie Ser Glu Trp
260 265 270
Lys Ser Asn lie Ser Asp Val Lys Asn Leu Leu Val Asn lie Gly Glu
275 280 285
Glu Phe Ala Ser Lys Tyr Thr Gly Asn Glu Leu Gin Glu Lys Tyr Thr
290 295 300
Gin Trp Phe Arg Glu His Arg Ser Glu Leu Trp Pro Leu Asp Arg Tyr 305 310 315 320
Lys Tyr lie Asp Lys Asp Gly lie Tyr Thr Gly Ser Gin Ser Val His
325 330 335
Asn Pro Gly Lys Glu Gly Tyr Arg Tyr Asp lie lie His Pro Lys Thr
340 345 350
Lys Lys Pro Cys Lys Gin Pro Leu Met Gly Tyr Arg Phe Pro Leu Asp
355 360 365
Thr Met Asp Arg Leu Leu Ser Glu Glu Lys lie lie Phe Gly Asp Asp
370 375 380
Glu Asn Lys lie lie Glu Leu Lys Val Tyr Ala Lys Asp Tyr Lys Gin 385 3卯 395 400
Lys Leu Ser Ser Val He His Leu Asp Gly Arg Val Ala Thr Asn Glu
405 410 415
Leu Lys Glu Leu Phe Pro Glu Met Thr Gin Pro Phe Thr Asn Ala Lys 420 425 430
Thr lie Lys Leu Val Glu Asp Leu lie Ser Phe Ala Cys Asp Gly Glu
435 440 445
Gly lie Val Leu Asp Phe Phe Ala Gly Ser Gly Thr Thr Ala His Thr
450 455 460
Val Phe Asn Leu Asn Asn Lys Asn Lys Thr Ser Tyr Gin Phe lie Thr
15465 470 475 480
Val Gin Leu Asp Glu Pro Thr Lys Asp Lys Ser Asp Ala Met Lys His
485 490 495
Gly Tyr Asn Thr lie Phe Asp Leu Thr Lys Glu Arg Leu lie Arg Ala
500 505 510
Ser Lys Lys Asn Arg Asp Gin Gly Phe Lys Val Tyr Gin Leu Met Pro
515 520 525
Asp Phe Arg Ala Lys Asp Glu Ser Glu Leu Thr Leu Ser Asn His Thr
530 535 540
Phe Phe Asp Asp Val Val Leu Thr Pro Glu Gin Tyr Asp Thr Leu Leu 545 550 555 560
Thr Thr Tip Cys Leu Tyr Asp Gly Ser Leu Leu Thr Thr Pro lie Glu
565 570 575
Asp Val Asp Leu Gly Gly Tyr Lys Ala His Leu Cys Asp Gly Arg Leu 580 585 590
Tyr Leu lie Ala Pro Asn Phe Thr Ser Glu Ala Leu Lys Ala Leu Leu
595 600 605
Gin Lys Val Asp Ser Asp Lys Asp Phe Ala Pro Asn Lys Val Val Phe
610 615 620
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Leu Lys Ser Tyr Ala Asn Lys Lys Ser lie Glu Leu Asp Leu Val Val
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Arg Asn
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<211> 994
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<213> Artificial<220>
<223>人工序列描述重组Ecopl5IRes亚基 <220>
<221> DOMAIN
<222> (989)..(994)
<223> 6个组氨酸镍亲和层析标签
<400> 2
Met Ala Asp Leu Asn Tip lie Ser Ala Gly His Ala lie Ala Asp Val 15 10 15
Gly Thr Met Ser Lys Gly Phe Thr Leu Glu Lys Asn Leu Pro His Gin 20 25 30
Lys Ala Gly Val Asp Ala Val Met Asn Val Phe Val Ser Ala Thr Pro
35 40 45
His Leu Thr Asp Asn Val Ala Val Arg Leu Leu Ala Asn Pro Glu Leu
50 55 60
Lys Leu Ser Glu Gin Gin Tyr Tyr Asn Asn lie Lys Asn Val Gin Ala 65 70 75 80
Phe Asn Gly lie Ala His Ser Lys Asp Asn His Asn Ala Lys Ser Asn
85 卯 95
lie lie Asp Val Ser Met Glu Thr Gly Thr Gly Lys Thr Tyr Thr Tyr
100 105 110
lie Lys Thr lie Phe Asp Leu Asn Lys Ser Phe Gly lie Asn Lys Phe
115 120 125
lie He He Val Pro Thr Leu Ser lie Lys Ala Gly Thr Val Asn Phe
130 135 140
Leu Lys Ser Asp Ala Leu Lys Glu His Phe Arg Asp Asp Tyr Lys Arg 145 150 155 160
Glu Leu Arg Thr Tyr Val Val Glu Ser Gin Lys Asn Ala Gly Lys Asn165 170 175
Thr Lys Ser Tyr Met Pro Gin Ala lie His Asp Phe Val Glu Ala Ser
180 185 190
Asn Phe Asn Lys Lys Tyr lie His Val Leu Val He Asn Ser Gly Met
195 200 205
lie Asn Ser Lys Ser Leu Thr Asp Thr Tyr Asp Thr Gly Leu Leu Asp
210 215 220
Asn Gin Phe Asn Thr Pro Val Asp Ala Leu Arg Ala Val Lys Pro Phe 225 230 235 240
He He lie Asp Glu Pro His Arg Phe Pro Thr Gly Lys Lys Thr Tip
245 250 255
Glu Asn lie Glu Lys Phe Asn Ala Gin Tyr lie He Arg Tyr Gly Ala
260 265 270
Thr Phe Ser Glu Gly Tyr Lys Asn Leu Val Tyr Arg Leu Thr Ala Val
275 280 285
Asp Ala Phe Asn Asp Asp Leu Val Lys Gly lie Asp Ala Tyr lie Glu
290 295 300
Asp lie Val Gly Asp Gly Asn Ala Asn Leu Lys Phe Val Lys Ser Asp 305 310 315 320
Gly Lys Glu Ala Thr Phe Glu Leu Asn Glu Asn Asn Asn Lys Lys Ser
325 330 335
Phe Lys Leu Ala Lys Gly Glu Ser Leu Ser Lys Thr His Ser Ala He
340 345 350
His Asp Leu Thr Leu Asp Ala Leu Asn Lys Ser Thr Ala Val Leu Ser
355 360 365
Asn Gly lie Glu Leu Lys lie Gly Ser Ser lie Asn Pro Tyr Ser Tyr
370 375 380
Asp Gin Thr Leu Ala Asp Asn Met Met Arg Lys Ala Val Lys Glu His 385 390 395 400Phe Lys Leu Glu Lys Glu Leu Leu Thr Gin Arg Pro Arg lie Lys Pro
405 410 415
Leu Thr Leu Phe Phe lie Asp Asp lie Glu Gly Tyr Arg Asp Gly Asn
420 425 430
Asp lie Ser Gly Ser Leu Lys Thr Lys Phe Glu Glu Tyr Val Leu Ala
435 440 445
Glu Ala Asn Glu Leu Leu Lys Thr Glu Gin Asp Ala Phe Tyr Lys Asn
450 455 460
Tyr Leu Glu Lys Thr Val Thr Asn lie Ser Ser Val His Gly Gly Tyr 465 470 475 480
Phe Ser Lys Asp Asn Ser Asp Lys Asp Asp Lys lie Glu Gin Glu lie
485 490 495
Asn Glu Ie Leu His Asp Lys Glu Leu Leu Leu Ser Leu Asp Asn Pro 500 505 510
Arg Arg Phe lie Phe Ser Lys Trp Thr Leu Arg Glu Gly Trp Asp Asn
515 520 525
Pro Asn Val Phe Gin lie Cys Lys Leu Arg Ser Ser Gly Ser Thr Thr
530 535 540
Ser Lys Leu Gin Glu Val Gly Arg Gly Leu Arg Leu Pro Val Asn Glu 545 550 555 560
Tyr Met Cys Arg Val Lys Asp Arg Asn Phe Thr Leu Lys Tyr Tyr Val
565 570 575
Asp Phe Thr Glu Lys Asp Phe Val Asp Ser Leu Val Lys Glu Val Asn 580 585 590
Glu Ser Ser Phe Lys Glu Arg Val Pro Ser Lys Phe Thr Gin Glu Leu
595 600 605
Lys Glu Gin lie Met Ala Gin Tyr Pro Glu Leu Ser Ser Arg Ala Leu
610 615 620
Met Asn Glu Leu Phe Asn Asp Glu lie lie Asp Asp Asn Asp Asn Phe
19625 630 635 640
Lys Asp Ser Asp Ala Tyr Ser Arg Leu Lys Ser Lys Tyr Pro Ala Ala
645 650 655
Phe Pro lie Gly Val Lys Pro Gly Lys lie Lys Lys Ala Thr Asp Gly
660 665 670
Lys Arg Arg Thr Lys Met Arg Val Gly Lys Phe Ser Glu Leu Lys Glu
675 680 685
Leu Trp Asp Leu lie Asn Gin Lys Ala Val lie Glu Tyr Lys lie Asn
690 695 700
Ser Glu Ser Glu Phe Leu Ser He Phe Lys Ser Phe Met Leu Glu Glu 705 710 715 720
Thr Glu Arg Phe Thr Lys Ser Gly Val His Thr Arg lie Asp Lys lie
725 730 735
Tyr lie His Asn Asp Met Ala Met Ser Lys Ser lie Val Ser Asp Asp
740 745 750
Asp Asp Phe Ala Lys Leu Asn Thr Met Ser Tyr Arg Glu Phe Leu Asp
755 760 765
Asn Leu Ser Gin Thr lie Phe Val Lys His Gly Thr Leu His Lys Val
770 775 780
Phe Cys Asp lie Lys Asp Thr lie Asn lie Thr Glu Tyr Leu Asn lie 785 7卯 795 800
Gin Thr lie Arg Lys lie Lys Ser Gly Phe Ser Lys Tyr Leu Leu Asn
805 810 815
Asn Ser Phe Asn Lys Phe Ser Leu Gly Tyr Asn Leu lie Ser Gly Ser
820 825 830
lie His Pro Thr Lys Phe Thr Asn Ala Asp Gly Asn Pro Leu Gly Glu
835 840 845
Val Leu Ser Ser Asp Leu Gly Val Leu Gin Asp Asn Ala Lys Ala Pro 850 855 860Leu Asp Thr Tyr Leu Phe Glu Glu Val Phe Tyr Asp Ser Glu Leu Glu865 870 875 880Arg Arg Asn lie Thr Asp Arg Glu lie Gin Ser Val Val Val Phe Ser885 890 895Lys He Pro Lys Asn Ser lie Lys lie Pro Val Ala Gly Gly Tyr Thr900 905 910Tyr Ser Pro Asp Phe Ala Tyr Val Val Lys Thr Ala Glu Gly Asp Tyr915 920 925Leu Asn Phe lie lie Glu Thr Lys Asn Val Asp Ser Lys Asp Ser Leu930 935 940Arg Leu Glu Glu Lys Arg Lys lie Glu His Ala Gin Ala Leu Phe Asn 945 950 955 960Gin He Ser Gin Ser Val Lys Val Glu Phe Arg Thr Gin Phe Ala Asn965 970 975Asp Asp lie Tyr Gin Leu lie Lys Ser Ala Leu Pro His His His His980 985 990His His2权利要求
1、一种构建III型限制性内切酶EcoP15I共表达质粒(pACYC_P15)的方法，步骤包括(1)人工合成包含Res亚基和Mod亚基的3段基因，分别为Eco_Mod、Eco_ResI和Eco_ResII，3段基因分别通过平端克隆，装载到pUC57中，获得pMod，pRes_I和pRes_II三个质粒；将pRes_I和pRes_II用BglII和NotI双酶切后，T4连接酶酶连，获得完整的Res片段的pRes_All质粒；(2)将pMod质粒与pACYCDuet-1质粒BamHI和SalI双酶切后酶连，获得包含Mod亚基的pACYC_Mod质粒，再与pRes_All质粒KpnI和XhoI双酶切后酶连，获得包含完整的Ecop15I两个亚基pACYC_P15质粒。
2、 根据权利要求l的方法，亚基的末端(N端或C端)各融合了层析标签。
3、 根据权利要求1或2，融合的层析标签是组氨酸镍(Ni+)亲和层析标签(6XHisTag)。
4、 根据权利要求1的方法，质粒为过表达质粒。
5、 根据权利要求1或4， 一种包含质粒的宿主细胞。
6、 一种生产III型限制性内切酶EcoP15I的方法，步骤包括(1) 用重叠PCR方法合成EcoP15I基因；(2) 构建EcoP15I共表达质粒pACYC—P15;(3) Ecopl51的转化和表达；(4) Ecopl5I大规模培养和表达；(5) Ecopl5I纯化。
7、 根据权利要求6，合成EcoP15I基因根据步骤(1)包括(1) 设计表达序列，融合纯化标签，并在序列两端添加酶切位点；(2) 设计引物，合成Res和Mod全长基因，分别克隆到pUC57质粒中；(3) 亚克隆到过表达载体pACYCDuet-l中，获得表达Ecop151的全长基因。
8、 根据权利要求6，纯化EcoP15I蛋白根据步骤(5)包括(1)镍柱结合缓冲液重悬离心后菌体，超声波破碎菌体，离心取上清粗蛋白；(2) 过镍亲和层析纯化柱，分步收集；(3) 取纯度和浓度较高的收集样混合、透析；(4) 过阴离子DEAE离子交换层析柱，步进式洗脱，分步收集；(5) 取纯度和浓度较高的收集样混合，透析，测EcoplSI总浓度。
9、 根据权利要求1-6的任何一项，利用Ecopl5I作为DNA分析，基因表达的 序列分析和/或相关基因的识别。
10、 根据权利要求9，基因表达可用来描述细胞，组织，器官和/或生物体。
11、 根据权利要求IO，生物体为宿主或病原体。
全文摘要
本发明提供了一种构建和生产重组III型限制性内切酶Ecop15I的方法。III型限制性内切酶Ecop15I在基因表达系列分析具有重要作用，而传统方法难以实现大规模的表达和纯化。本发明利用基因重组的方法，人工合成融合有纯化标签的Ecop15I的2个亚基片段，分别克隆到原核共表达载体pACYCDuet-1的两个独立表达单元中。在IPTG诱导下，具有独立的T7启动子、核糖体结合位点、起始密码子和终止密码子表达单元在大肠杆菌中，同时独立表达酶的2个亚基，并折叠成具有生物学活性的复合结构。再通过Ni亲和层析和DEAE离子交换层析的方法进行纯化。最终得到了产量较高，活力和稳定性较好的重组型Ecop15I内切酶，从而为大规模生产提供了有效的途径。
文档编号C12N15/55GK101538579SQ200810019839
公开日2009年9月23日 申请日期2008年3月19日 优先权日2008年3月19日
发明者孙云成, 雪 戴, 朱远源, 陆毅祥, 莉 陈, 兵 黄 申请人:百奥生物技术(南通)有限公司