青岛结缕草与沟叶结缕草杂交后代真实性的分子鉴定方法

专利名称：：青岛结缕草与沟叶结缕草杂交后代真实性的分子鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及结缕草属植物杂交后代真实性的分子鉴定方法，属于生物
技术领域：
。专用于青岛结缕草和沟叶结缕草杂交后代真实性鉴定的快速准确检测。二、
背景技术：
杂交育种作为一种传统育种方法已相当成熟，是植物遗传改良中常用的技术策略，利用草坪草性状差异明显的亲本进行杂交育种是选育优质、优良新品系的重要途径。结缕草的开花习性为雌蕊先熟，雄蕊后熟，郭海林等的研究表明结缕草的自交结实率0.0~54%，平均为16.15%，因此杂交后代有可能混杂有部分的自交种。据此，需要首先对结缕草的杂交后代进行真实性的鉴定，以筛选出真正的杂种为后面的优良杂交品种选育提供基础。多年来，许多育种工作者通过田间植株形态来鉴定杂交后代，但形态特征容易受环境条件的影响，不能真实、准确地反应其后代的遗传变异。也有用细胞学、同工酶电泳等方法进行鉴定的报道，但细胞学鉴定的方法只适用于亲本材料具有不同倍性染色体的植物，且费时、费力，要求高、操作复杂等，结缕草属植物染色体数目均为2n=40，且染色体均为短棒状，很难加以鉴定。而同工酶鉴定的重复性及可靠性不够好，影响检测的准确性，而使其广泛应用受到了限制。因此，寻找一种稳定可靠又快速简便的植物杂交后代的鉴定方法迫在眉睫。DNA是生物的遗传物质，DNA的多态性是生物多样性的本质内容。目前，随着分子标记技术的不断发展和广泛应用，国内外在植物杂交育种的后代鉴定中也越来越多地应用各种分子标记技术，如RAPD、SSR、ISSR、AFLP等分子标记。但RAPD标记受反应条件的影响较大，重复性差；SSR单个标记提供的信息量较少，引物具有物种特异性，开发难度也大，成本较高；ISSR标记的扩增条件需要较长时间的摸索，且多为共显性标记；AFLP标记操作复杂，要求严格，成本高等不足之处。一种基于PCR的新型分子标记技术-一SRAP(Sequence-relatedAmplifiedPolymorphism)标记的发明和应用弥补了以上分子标记的不足且具备了它们的优点。此技术是由美国加里弗尼亚大学，蔬菜系Li和Quiros于2001年在芸薹属植物中开发提出的。SRAP标记是根据基因外显子中丰富的GC含量和内含子、启动子中丰富的TA含量的特点，利用独特的引物设计对ORFs(Openreadingframes,开放阅读框架)进行扩增，因不同个体间的外显子、内含子和启动子的不同而产生多态性。SRAP标记简单、稳定可靠、重复性好、多态性高、在基因组中分布均匀、引物非特异性、少量引物可组配多种引物对等优点使其在多种植物中得到广泛的应用。但目前SRAP标记在植物杂交后代鉴定中的应用甚少，更未见用于青岛结缕草和沟叶结缕草杂交后代真实性鉴定。结缕草(M^/aWilld)是一种多年生暖季型草坪草，因其具有抗性强、耐践踏、弹性好、养护要求低、适应性广、寿命长等优良特征，被世界公认为是一种优良的草坪草。青岛结缕草(Zojw'a.)印om'caSteud.cv.Qingdao)是我国草坪育种者通过系统选育的方法选育出的新品种，具有可通过种子种植，生长速度较快，抗寒性较好等优点，但叶色灰绿，密度较低，枯萎期较早，质地较粗糙；沟叶结缕草品种Diamond(MarcumW"/,1998)特点是叶细草密，色泽宜人，枯萎期较晚，但其抗寒性较差，成坪速度慢。利用坪用性状差异明显的亲本进行杂交育种是选育优质、优良新品系的重要途径。因此通过二者杂交，以期获得色泽较好、绿期长、质地较好、抗寒性较强的优良杂交后代新品系。如能在杂交后代新品系的综合鉴定之前，采用快速、准确的杂种鉴定方法，对杂交后代的真实性进行鉴定，从而为育种工作的进一步开展奠定基础。本发明采用非特异性分子标记一SRAP标记对青岛结缕草和沟叶结缕草两亲本及其后代进行了分子水平的多态性分析，从本研究的SRAP分析结果中可以看出，SRAP标记鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠，因此该分子标记非常适合用于青岛结缕草和沟叶结缕草植物杂交后代真实性的室内鉴定，也可用杂S结缕草品种鉴定和纯度分析。三、
发明内容技术问题本发明的目的是解决现有技术中结缕草属植物杂交后代真实性的田间鉴定检测方法和其它分子鉴定所需时间长，消耗大、准确性差的问题，提供青岛结缕草和沟叶结缕草杂交后代真实性的分子鉴定方法，对青岛结缕草和沟叶结缕草杂交后代进行SRAP分子标记鉴定，快速、准确。技术方案检测青岛结缕草和沟叶结缕草杂交后代的SRAP引物，包括引物对Mel+Eml正向引物5，-TGAGTCCAAACCGGATA-3，反向引物5'-G今CTGCGTACGAATTCAA-3';禾口引物对Me4+Em8正向引物5，-TGAGTCCAAACCGGACA-3，反向引物5'-GACTGCGTACGAATTGCC-3，；和引物对Me5+Em5正向弓l物5'-TGAGTCCAAACCGGTGC-3'反向引物5，-GACTGCGTACGAATTAAC-3'。上述引物对用于结缕草属杂交后代真实性的鉴定方法，其特征在于，利用上述三对引物对青岛结缕草和沟叶结缕草杂交组合的后代进行鉴定首先用Mel+Eml引物对对杂交后代进行鉴定，扩增结果有父本Z123的特异性条带280bp的被确定为真杂种，其余没有特异性条带280bp的后代用于下一步鉴定；接着用Em4+Em8引物对对上述没有特异性条带280bp的后代进行第二次鉴定，结果有父本特异带155bp和135bp的被确定为真杂种，其余没有父本特异带155bp和135bp的后代用于下一步鉴定；再用Me5+Em5引物对对上述没有父本特异带155bp和135bp的后代进行第三次鉴定，结果有父本的特异条带270bp的被确定为真杂种；其余则为假杂种。上述鉴定过程中其材料基因组D^A的提取方法为将叶片在液氮中研磨后，加入DNA提取液搅匀，65。C水浴lhr;冷却至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀后在摇床上摇动lhr;3000rpm离心30min;取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇使DNA沉淀，-201:放置1小时；挑出DNA，加入70%乙醇洗涤1-2次；吹干DNA，加入TE在室温下溶解；加入3mlTE溶解DNA后，再次加入氯仿/异戊醇混匀，6000rpm离心；取上清液加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，-20。C放置lhr;离心后倒掉上清液，钩出沉淀，用70%的乙醇洗涤l-2次；吹干沉淀后，加入TE溶解，-2(TC保存；所用DNA提取缓冲液为Buffer缓冲液，包括1MTris-HCLpH8.0，0.5MEDTA中pH8.0，5MNaCl，20%SDS，NaBisulfate;SRAP-PCR反应体系包括25ng模板DNA，25mMMg2+0.6^L，2.5mMdNTP0.8(iL,2pMSRAP引物对l.OiaL，0.5UTaqDNA聚合酶1.0|aL，10xBufferl|aL，ddH205.1^iL，总体积为lOpL;.SRAP-PCR扩增程序为:94。C预变性4min;94。C变性min，37。C退火lmin，72°C延伸10sec，5个循环;94。C变性lmin，50。C退火lmin，72。C延伸10sec，35个循环;循环结束后72'C延伸7min，4'C保存。有益效果本发明与现有技术相比，其优点表现在(1)提供了非特异的Mel+Eml引物对、Me4+Em8引物对、Me5+Em5引物对共三对引物来鉴定青岛结缕草和沟叶结缕草杂交后代的真实性。(2)提供了一个最佳结缕草属SRAP分子标记反应体系来鉴定青岛结缕草和沟叶结缕草的杂交后代真实性，同时该体系也降低成本，因其它分子标记的应用多为20pL或25(iL体积，而本试验中的SRAP反应体系的总体积为10pL，包括25ng模板DNA，25mMMg2+0.6nL，2.5mMdNTP0.8nL，2pMSRAP引物对l.O(jL，0,5UTaqDNA聚合酶l.OpL，10xBufferlpL，ddH205.1pL。同时，试验结果也表明该体系可以扩增出丰富、清晰、稳定、可靠的谱带，具有较高的多态性。(3)SDS法(SodiumDodecylSulfate,十二垸基硫酸钠)提取结缕草属植物DNA，方便易行、且提取的DNA浓度和质量高。(4)速度快用SRAP分子标记鉴定结缕草属杂交后代的真实性具有有重要的作用。结缕草的开花习性为雌蕊先熟，雄蕊后熟，经研究表明结缕草的自交结实率0.0~54%，平均为16.15%,因此杂交后代有可能混杂有部分的自交种，这就影响了育种工作的进一步开展。如能在后面的优良杂交品种选育时，采用快速、准确的杂种鉴定方法，对已有的杂交后代材料进行真实性鉴定，将为结缕草属优良新品系的选育奠定基础。而正常的田间鉴定试验需要测量大量的外部性状，包括生殖性状和营养性状，投入的时间长，人力物力也大，且易受环境因素影响，不能准确、真实地反映后代的遗传情况。该发明只需提出后代材料的DNA，用已筛选好的SRAP引物进行分子标记鉴定，结缕草属植物杂交后代真实性的分子鉴定体系，应用该体系可以很快地鉴定出后代的真实性。(5)准确率高SRAP标记具有简单、稳定可靠、重复性好、多态性高、在基因组中分布均匀、引物非特异性、少量引物可组配多种引物对等优点，很容易通过PCR快速扩增和高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本发明在筛选的40对引物中，有22对在双亲种表现出了多态，具有丰富的多态性，为分子水平鉴定杂交后代的真实性提供了便利。通过进一步筛'选，采用了三对SRAP引物对后代进行真实性鉴定，从而增加了鉴定的可靠性，且分子鉴定不受环境因素的影响，真正从DNA水平上鉴定杂交后代的遗传情况，提高了准确性。(6)实用简单本方法鉴定结缕草属植物杂交后代真实性的整个程序，只是几次机械式的加样过程，易于操作，具有更好的商业化应用前景。四图l两个亲本及九个杂交后代材料基因组DNA的检测结果A.亲本及杂交后代基因组DNA原液电泳图B.稀释为50ngL的亲本基因组DNA及杂交后代DNA电泳检测图图2杂交组合青岛结缕草X沟叶结缕草F,代的SRAP分析注A:Mel+gml引物对第一次鉴定，后代03-2，03-5，03-7，03-9，03-11在以Marker为标准的280bp处有父本Z123的特异性条带；B:Me4+Em8引物对第二次鉴定，后代03-4，03-8，03-10在155bp和135bp处有父本特异带；C:Me5+Em5引物对第三次鉴定，03-6在270bp处有父本的特异条带。五具体实施方式(一)引物的筛选(1)材料的准备青岛结缕草Z022(Zya/om'c"Steud.cv.Qingdao)与沟叶结缕草Z123(Z^e//a)(见参考文献刘建秀等.我国结缕草种质资源结实性的初步研究[J].草业学报，2003'12(2):70-75;KennethB.Marcum，SharonJ.Anderson,M.C.Engelke.SaltGlandIonSecretion:ASalinityToleranceMechanismamongFiveZoysiagrassSpecies[J〗.CropSci，1998，38:806掘)的9个杂交后代种子用30%的Na0H处理80分钟后，在培养皿培养发芽，'待小苗长到1.5-2cm时将其移入穴盘，有一定生物量时将其移栽到花盆，满盘时移植到试验地。(2)材料基因组DNA的提取采用SDS法(SodiumDodecylSulfete,十二烷基硫酸钠)。将叶片(一般3克左右)在液氮中研磨后，移入冷冻的离心管中，并于-2(TC保存；根据样品量加入适当的DNA提取液，搅匀，65'C水浴lhr;冷却至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀后在摇床上摇动lhr左右；3000rpm离心30min;取上清液加入2倍体积预冷的无^乙醇使DNA沉淀，-2(TC放置1小时；挑出DNA，加入适量的70%乙醇洗涤l-2次；吹干DNA，加入适量TE在室温下溶解；加入3mlTE溶解DNA后，再次加入氯仿/异戊醇(24:1)混匀，6000rpm离心；取上清液加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，-20'C放置lhr;离心后倒掉上清液，钩出沉淀，用70%的乙醇洗涤1-2次；吹千沉淀后，加入适量TE溶解，-20'C保存。所用DNA提取缓冲液为Buffer缓冲液，包括1MTris-HCL(pH8.0)，0.5MEDTA(pH8.0)，5MNaCl，20%SDS，NaBisulfate。(3)基因组DNA质量和浓度检测采用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量和浓度。取2pLDNA、2nLDDH2O与2pL0.25。/。的溴酚兰，将其混合后，上样于0.8%琼脂糖凝胶(含有溴化乙锭(EB)染色剂)，同时取已知的50ng"L的人DNA作参照，在1XTAE的电泳缓,冲液中进行水平板电泳，电泳电压为IOOV，时间90min左右。电泳结束后，在上海培清科技有限公司JS-380自动凝胶图像分析仪上观测，确定DNA浓度并拍照。最后将样品DNA浓度均稀释到50ng4iL并于-2(TC保存，以便使用(图l)。(4)SRAP-PCR扩增程序及扩增产物的检测SRAP-PCR反应体系包括25ng模板DNA，25mMMg2+0.6(iL，2.5mMdNTP0.8(jL，2pMSRAP引物对l.O(iL,0.5UTaqDNA聚合酶l.OpL，10xBufferlpL，ddH205.1pL，总体积为10pL，混合均匀后于PCR扩增仪上进行PCR扩增。SRAP-PCR扩增程序为94。C预变性4min;94。C变性min，37。C退火lmin，72°C延伸10sec，5个循环;94'C变性lmin,50。C退火lmin,72'C延伸10sec，35个循环;循环结束后72。C延伸7min，4'C保存。(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增结束后，在扩增产物中加入2pL6xlaodingBuffer缓冲液混匀，上样于10%的聚丙烯酰胺凝胶中，在1XTBE的电极缓冲液中电泳检测。电泳电压为250V，时间2.5h左右。(6)采用银染的办法进行染色，其染色步骤如下:360ml水+40ml乙醇+2ml冰乙酸的固定液中固定12min;400ml水+0.8gAgNO3溶液染色12min;用蒸馏水冲洗一次，加入400ml水与10%硫代硫酸钠80uL，稍加晃动，约30s;用蒸馏水冲洗一次，然后在4ml甲醛+6gNaOH+400ml水的染色液中染色到带清楚为止，约2030min。(7)SRAP引物的筛选根据步骤(4)中SRAP-PCR反应体系，随机选取5条正向引物(Mel、Me2、Me3、Me4、Me5)和8条反向引物(Eml、Em2、Em3、Em4、Em5、Em6、Em7、Em8)(引物来源见参考文献LiG,QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphism(SRAP)，anewmarkersystembasedonasimplePCRreaction:itsapplicationtomappingandgenetagginginBraM/ca[J].TheoreticalandAppliedGenetics，2001，103:455-461.陈锋，张洁夫，陈松，等.甘蓝型油菜隐性核不育基因的SRAP标记[J].江苏农业学报，2007，23(4):283-288.刘雅辉等.小麦抗叶锈病基因ZW9的SRAP标记[J].华北农学报，2007，22(4):193-196.)，共组合成40对SRAP引物，其序列和引物对见表l、表2。对青岛结缕草和沟叶结缕草两亲本材料进行多态性SRAP引物对筛选，从中选出三对扩增条带较清晰、带型较丰富的引物，且在这三对引物的扩增结果中，父本沟叶结缕草Z123具有母本青岛结缕草Z022所没的特异性条带即1、25、39号引物对Mel+Eml对'正向引物5，-TGAGTCCAAACCGGATA-3，反向引物5，-GACTGCGTACGAATTCAA陽3';禾口Me4+Em8对正向引物5'-TGAGTCCAAACCGGACA-3'反向引物5，-GACTGCGTACGAATTGCC-3';禾口Me5+Em5对正向引物5，-TGAGTCCAAACCGGTGC-3，反向引物5'-GACTGCGTACGAATTAAC-3'用于青岛结缕草和沟叶结缕草(Z022xZ123)杂交后代真实性的鉴定。表1SRAP引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表250对SRAP引物对<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(二)杂种鉴定利用筛选出的三对引物对青岛结缕草和沟叶结缕草03(Z022xZ123)杂交组合的9个后代进行鉴定，首先用1号引物(Mel+Eml)对其组合的后代进行鉴定(图2-A)，扩增结果表明后代03-2，03-5，03-7，03-9，03-11在以Marker为标准的280bp处有父本Z123的特异性条带，被鉴定为真杂种；然后用39号引物(Me4+Em8)对未鉴定出的后代进行第二次鉴定(图2-B)，结果显示，后代03-4，03-8，03-10在155bp和135bp出有父本特异带，被鉴定为真杂种；接着用25号引物(Me5+Em5)对后代03-6再次鉴定(图2-C)，发现03-6在270bp处有父本的特异条带，被鉴定为真杂种。因此，利用不同的三对引物对03(Z022xZ123)组合共9个后代的鉴定结果表明，这9个后代因在三对引物中都具有父本的特异条带而被确定为真杂种。序列表<110>江苏省中国科学院植物研究所<120>青岛结缕草与沟叶结缕草杂交后代真实性的分子鉴定方法<130>说明书<140>00<141>2008-03-05<160>6<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>17<212>DNA<213>人工合成<220><221>引物对Mel+Eml正向引物<222>(1)..(17)'<223><400>1tgagtccaaaccggata17<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成<220><221>引物对Mel+Eml反向引物<222>(1)..(18)<223><400>2gactgcgtacgaattcaa18<210>3<2ii>n<212>DNA<213>人工合成<220><221>引物对Me4+Em8正向引物<222>(1)..(17)<223><400>3tgagtccaaaccggaca17<20>4<211>18<212>DNA<213>人工合成<220><221>引物对Me4+Em8反向引物<222>(1)..(18)<223><400>4gactgcgtacgaattgcc<210>5<211>17<212>DNA<213>人工合成<220><221>引物对Me5+Em5正向引物<222>(i)"(n)<223><400>5tgagtccaaaccggtgc<210>6<211>18<212>D"NA<213>人工合成<220><221>引物对Me5+Em5反向引物<222>(1)..(18)<223><400>6gactgcgtacgaattaac权利要求1、检测青岛结缕草和沟叶结缕草杂交后代的SRAP鉴定引物，包括引物对Me1+Em1正向引物5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’反向引物5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’；和引物对Me4+Em8正向引物5’-TGAGTCCAAACCGGACA-3’反向引物5’-GACTGCGTACGAATTGCC-3’；和引物对Me5+Em5正向引物5’-TGAGTCCAAACCGGTGC-3’反向引物5’-GACTGCGTACGAATTAAC-3’。2、权利耍求1所述引物用于青岛结缕草和沟叶结缕草杂交后代真实性的鉴定方法，其特征在f，用权利要求1所述的三对引物对青岛结缕草和沟叶结缕草杂交组合的后代进行鉴定首先用Mel+Eml引物对对杂交后代进行鉴定，扩增结果有父本Z123的特异性条带280bp的被确定为莨杂种，其余没有特异性条带280bp的后代用于下一步鉴定；接着用Em4+Em8，l物对对上述没有特异性条带280bp的后代进行第二次鉴定，结果有父本特异带155bp和135bp的被确定为真杂种，其余没有父本特异带155bp和135bp的后代用于下一步鉴定；再用Me5+Em5引物对对上述没有父本特异带155bp和135bp的后代进行第三次鉴定，结果有父本的特异条带270bp的被确定为真杂种；其余则为假杂种。3、根据权利耍求2所述的鉴定方法，其特征在于-，材料基闪组DNA的提取方法为将叶片在液氮中研磨后，加入DNA提取液搅匀，65'C水浴lhr;冷却至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀后在摇床上摇动lhr;3000rpm离心30min;取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇使DNA沉淀，-20。C放置l小时；挑出DNA，加入70°/。乙醇洗涤卜2次；吹干DNA，加入TE在室温下溶解；加入3mlTE溶解DNA后，再次加入氯仿/异戊醇混匀，6000卬m离心；取上清液加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，-20"放置11^;离心后倒掉上清液，钩出沉淀，用70%的乙醇洗涤1-2次；.吹干沉淀后，加入TE溶解，-20'C保存；所用DNA提取缓冲液为Buffer缓冲液，包括1MTris-HCLpH8.0，0.5MEDTApH8.0，5MNaCl，20%SDS,NaBisulfate;SRAP-PCR反应体系包括25ng模板DNA，25mMMg2+0.6nL，2.5mMdNTP0.8|aL，2|_iMSRAP弓l物对1.0iaL，0.5UTaqDNA聚合酶l.OnL,lOxBufferl^L,ddH205.1nL，总体积为10|iL;SRAP-PCR扩增程序为:94'C预变性4min;94。C变性min，37。C退火lmin，72'C延伸10sec，5个循环；94。C变性lmin，50。C退火lmin，72。C延伸10sec，35个循环；循环结束后72'C延伸7min，4'C保存。全文摘要本发明涉及一种鉴定结缕草属植物杂交后代真实性的方法，属于生物
技术领域：
。专用于青岛结缕草与沟叶结缕草杂交后代真实性的快速准确鉴定。以9个结缕草杂交后代及两亲本青岛结缕草和沟叶结缕草的基因组DNA为模板，筛选出三对SRAP引物即在父本中能扩增出母本所没有的特异带的引物。把父母本和后代一起进行PCR扩增、电泳，根据F₁代中是否能扩增出父本特异带而进行鉴定。结果表明9个杂交后代都具有父本特异带，被鉴定为真下的杂种。由此建立了青岛结缕草和沟叶结缕草杂交后代真实性的分子鉴定体系，应用该体系可以很快鉴定出结缕草属杂交后代的真实性，亦可用于杂交品种指纹图谱构建和纯度鉴定。文档编号C12Q1/68GK101240340SQ20081001973公开日2008年8月13日申请日期2008年3月13日优先权日2008年3月13日发明者刘建秀,薛丹丹,郭海林,郭爱桂申请人:江苏省中国科学院植物研究所