专利名称：一种耐高温l-阿拉伯糖异构酶及其基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及源自嗜热脂肪芽孢杆菌(^8ac/〃w Weara决wmo; /w7wW IAM11001 的一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶及其编码的基因序列，耐高温L-阿拉伯糖异构 酶工程菌的构建，以及耐高温L-阿拉伯糖异构酶的高效表达和纯化的方法，属 于生物工程技术领域。
技术背景D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂。D-塔格糖 属于天然稀有糖的一种，在许多食品中都发现少量存在，如高温灭菌牛奶、奶 酪、酸奶及其它奶制品等。2000年美国食品与药物管理局(FDA)确定D-塔格 糖为普遍公认安全食品(GRAS)，并正式批准作为甜味剂用于食品饮料业以及 医药制剂中；随后联合国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂委员会 (JECFA)第57次会议批准D-塔格糖作为食品添加剂；欧盟也于2003年批准 D-塔格糖在欧洲上市。目前，国内对于D-塔格糖生产的研究还处于起步阶段，国外对其研究已较 为深入，生产方法主要有两种化学法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是 由化学法生产的。由于化学法生产一方面存在许多不利因素，如化学污染物多， 碱性条件下异构化反应副产物多，分离困难等；另一方面由于消费者消费观念 的转变，对天然食品的需求日益增长，因此近年来对塔格糖生产的研究集中在 生物法上。研究发现L-阿拉伯糖异构酶(EC5.3丄4，縮写为L-AI)可以催化D-半乳糖转化为D-塔格糖，是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。D-半乳 糖与D-塔格糖之间异构反应的平衡受温度影响很大，较高温度条件下(60'C以 上)更有利于D-塔格糖的生成，因此耐热性的L-阿拉伯糖异构酶将具有更好的 应用前景。 发明内容本发明的目的是提供一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶及其编码的基因序列， 耐高温L-阿拉伯糖异构酶工程菌的构建，以及耐高温L-阿拉伯糖异构酶的高效 表达和纯化的方法。该耐高温L-阿拉伯糖异构酶在较高温条件下具有较好的活 性和稳定性，对于新型功能性甜味剂D-塔格糖的工业化生产具有广泛的应用前 景和经济意义。本发明的技术方案 一种来源于嗜热脂肪芽孢杆菌68a"7/w他aro沩ermo/^7"W IAM11001的耐高温L-阿拉伯糖异构酶，其基因核苷酸序列 为SEQIDNO: 1。嗜热脂肪芽孢杆菌r5"cz'〃ws Weflfra//^ww/ /n7M^ IAM11001巳在文献半乳 糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件，无锡轻工大学学报第21 巻第5期2002年9月中公开，本发明人承诺该微生物在20年内向公众发放。所述的耐高温L-阿拉伯糖异构酶，其氨基酸序列为SEQIDNO: 2。所述的耐高温L-阿拉伯糖异构酶的表达方法(1) 构建含有耐高温L-阿拉伯糖异构酶基因的表达质粒 取嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001总DNA溶液3 pL作为模版，以包含B"mHI和iol的酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，经PCR扩增得到所要的DNA 片段；引物1: 5'-TGATGGATCCCATGCTGTCATTACGTCCT-3，引物2: 5,-TATATACTCGAGTTACCGCCCCCGCCAGAATAC隱3'PCR反应条件为94°C 5min， 一个循环；94°C 60s， 56°C 60s， 72°C 90s，三十五个循环；最后72。C延伸10min;回收PCR产物，经限制性内切酶BamHI和^oI进行双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-22b ( + )，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-22b(+)-araA;(2) 将该重组质粒转化至宿主细胞中将重组质粒pET-22b(+)-araA转化 至感受态大肠杆菌BL21中，涂布含有50 pg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基 上，37 'C培养18-24 h得到初步阳性克隆;(3) 经抗性培养基筛选得到阳性克隆分别挑取初步阳性克隆于5 mL含 有50 (ig/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37°C， 200 rpm培养过夜，提取 质粒，经限制性内切酶^mHI和J^oI酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表 SEQIDNO: 1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-22b(+)-araA，具有该质粒的 菌落为阳性克隆，命名为工程菌BL21-AI;对重组质粒pET-22b(+)-"raA进行测序，结果表明插入片段为一个含有1491 bp，编码一个由496个氨基酸组成的蛋白质。本发明的有益效果本发明提供了一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶及其编码 的基因序列，耐高温L-阿拉伯糖异构酶工程菌的构建，以及耐高温L-阿拉伯糖 异构酶的高效表达和纯化的方法。该耐高温L-阿拉伯糖异构酶在较高温条件下 具有较好的活性和稳定性，对于新型功能性甜味剂D-塔格糖的工业化生产具有 广泛的应用前景和经济意义。
图l重组质粒pET-22b(+)-araA的构建示意图。
具体实施方式
实施例1嗜热脂肪芽胞杆菌(^"c///^ Wearaf/2^wc^/H7^y> IAM11001总DNA的提取取新鲜的嗜热脂肪芽胞杆菌^Bacz7^ WearaAmwo; MwW IAM11001湿菌 体20g，悬于10mL50mMTris-HCl缓冲液中(pH8.0)。加入少量溶菌酶和8 mL 0.25 mM EDTA (pH 8.0)，混匀后37 °〇静止20 min。 加入2mL10。/。十二烷基磺酸钠(SDS)， 55 。C静止5 min。 分别依次用等体积酚、氯仿各抽提一次。 取最后一次的上清，加入2倍体积的乙醇，回收DNA。 用70%乙醇、无水乙醇分别依次洗涤沉淀。沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液(10 mM Tris， 1 mM EDTA， pH 8.0)，加入3 piL 10 mg/mLRNase， 37 。C保温l h。分别依次用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清加入2倍体积的乙醇，回收 DNA。用70%乙醇、无水乙醇分别依次洗涤沉淀。沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液(10 mM Tris， 1 mM EDTA， pH 8.0), -20 。C保存备用。实施例2耐高温L-阿拉伯糖异构酶基因的克隆1. 取嗜热脂肪芽孢杆菌总DNA溶液3pL作为模版，以下列核苷酸序列作 为引物(包含SamHI和loI的酶切位点)，经PCR扩增得到所要的DNA片段。引物序列如下引物1: 5 ，陽TGATGGATCCCATGCTGTCATTACGTCCT画3' 弓I物2: 5 ，-TATATACTCGAGTTACCGCCCCCGCCAGAATAC-3 ， PCR反应条件为94 。C 5 min， 一个循环；94 °C 60 s, 56 °C 60 s, 72 °C 90 s，三十五个循环；最后72。C延伸10min。2. 回收PCR产物，经限制性内切酶Samffl和；^oI进行双酶切，与经过同 样双酶切的质粒pET-22b ( + )，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pET-22b(+)-翻A。3. 将重组质粒pET-22b(+)-araA转化至感受态大肠杆菌BL21中，涂布含有 50 pg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基上，37 。C培养18-24 h得到初步阳性克 隆。4. 分别挑取初步阳性克隆于5 mL含有50 pg/mL氨节抗生素的LB液体培 养基中，37°C， 200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶S"mHI和 双酶切质粒，根据电泳结果判断具有该DNA片段(序列表中SEQIDNO: 1) 的质粒为重组质粒pET-22b(+)wraA，具有该质粒的菌落为阳性克隆，命名为工程菌BL21-AI。5.对重组质粒pET-22b(+)-araA进行测序，结果表明插入片段为一个含有 1491 bp，编码一个由496个氨基酸组成的蛋白质。实施例3耐高温L-阿拉伯糖异构酶基因在工程菌中的高效表达 工程菌BL21-AI在含有50 pg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37 °C， 200 rpm培养过夜，转接至新鲜的氨苄抗生素的LB液体培养基中，37 °C ， 200 rpm 培养至OD值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.5 mM的异丙基-13-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 3(TC诱导表达4h达到最高诱导量。实施例4重组耐高温L-阿拉伯糖异构酶的纯化及其特性 诱导表达后所得菌体于50mMpH7.5Tris-HCl缓冲液中，超声波细胞破碎， 离心后的上清液为重组L-阿拉伯糖异构酶粗酶液。粗酶液经截流分子量为 10,000 Da的超滤膜浓縮后，浓縮液再经DEAE-Sepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B层析柱对重组蛋白进行纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并 显示重组L-阿拉伯糖异构酶蛋白的分子量为59KDa，重组酶反应作用的温度为 60-80 。C， pH为7.0-8.0。序 列 表<210〉 SEQ ID NO: 1 <211> 1491 <212> DNA<213> 嗜热脂肪芽胞杆菌(^ac/〃a^/earaAwmop/2z7w^ IAMllOOl<400> 1已tgctgtcattacgtccttatg已attttggtttgtgacaggaagtcagcacttgtacgga60gaagaagcgtcgaag￡Lacattcaagaatcatggtcaatgaatggaatcgc120g3ttCggtgtttccgttcccattcgttttctgacgacgcc3g3gg^3tC180cggcgcgtttgccttgaggcgaMgcgagcgaacaatgtgccggcgttgtC3C3tgg￡Ltg240catacgttctcgccagcgaaaatgtggattggcggccttttggELgttgaga^asccgttai300ttgcatcttcacacccagtttaaccgtggtattccgtgggacagcatcgatatgg已cttt3608ccaatcsgctcacggtgacg3ttt3tCggtgcgagaatg420ggagttgcccgg咖gtggtcgttggtcattgggs卿cccag犯gtccgcgagcggctg480gCg^￡Ltgg￡Ltgcggacggccgtcgcctttgcgga鄉ccgacatcttaaagttgcccgt540ttcggcgataacatgcgtgaagtggcggtaacggaaggggacaaagtgggagcgcaaatt600caattcggctggtcgatcaacggttatggc3ttgggg3tttggtgcaatctattcgcgat660gtttctgaacaaagcgttaacgaactgcttccgaactgtatg3C3ttgt3720cctgctggccgtcaagatggaccggttcgcgagtcgatccgtgagcaggcgcggattgag780cttgggttaaaagcctttttgca卿cggg犯cttcactgcctttacgacgacgtttgaa840gatttgcacggcatg犯gcaacttccaggactagcggttcaacggcttatggc卿ggga900tatggatttggcggcg犯ggcgactgg犯aacggctgctctcgttcggtt960atggcggatggcaaagg犯catcgttxatggaagactacacgtaccactttgagccgggc1020aatcgaactgattcttggcgcgcatatgctcg犯gtatgcccgacgattgccgcaacccgg1080ccgcgcatcgaagtccatccgctttcgatcggtggaaaagaagatccagcccgtctcgtg1140tttgacggcggcg郷gtgctgcggtcaatgcttcgttgattgacttaggacaccgtttc1200cgtctcattgtcaatgaagtcgatgc已gtgatgagatgccgaaactgcct1260gttgcgcgcattctatggaagccgcgcccatcgctccgcgsttcggccgaagcatggatt1320ttagccggcggagcgcatcacacatgcttctcgtttgcggtcacggctgaacagctgcaa1380gactttgcgg,tggcgggcattgaatgcgtcgtgatcagtccgtctcg1440tccttc犯aaatgaactgaaatggaacgaagtattctggcgggggcgg"U1491<210> SEQ ID NO: 2<211> 496<212> PRT<213> 嗜热脂肪芽胞杆菌rBacz7/wwfearoAermop/zz7MW IAMllOOl<400> 2Met Ceu Ser Leu Arg 5Gin His Leu Tyr Gly 20Ser Arg lie Met Val 35Phe Pro Phe Val Phe 50Arg Arg Val Cys Leu 65Val Val Thr Trp Met 80Gly Gly Leu Leu Glu 95Gin Phe Asn Arg Gly 110Met Asn Leu Asn Gin 125lie Gly Ala Arg Met 140Trp Glu Asp Pro Glu 155Thr Ala Val Ala Phe 170Phe Gly Asp Asn Met 185Val Gly Ala Gin lie 200lie Gly Asp Leu Val 215Val Asn Glu Leu Leu 230Pro Ala Gly Arg Gin 245Gin Ala Arg lie Glu 260Asn Phe Thr Ala Phe 275Lys Gin Leu Pro Gly 290Tyr Gly Phe Gly Gly 305Pro Tyr Glu Phe Trp 10Glu Glu Ala Leu Lys 25Asn Glu Trp Asn Arg 40Lys Ser Val Val Thr 55Glu Ala Asn Ala Ser 70His Thr Phe Ser Pro 85Leu Arg Lys Pro Leu 100lie Pro Trp Asp Ser 115Ser Ala His Gly Asp 130Gly Val Ala Arg Lys 145Val Arg Glu Arg Leu 160Ala Glu Ser Arg His 175Arg Glu Val Ala Val 190Gin Phe Gly Trp Ser 205Gin Ser lie Arg Asp 220Asp Glu Tyr Ala Glu 235Asp Gly Pro Val Arg 250Leu Gly Leu Lys Ala 265Thr Thr Thr Phe Glu 280Leu Ala Val Gin Arg 295Glu Gly Asp Trp Lys 310Phe Val Thr Gly Ser 15Gin Val Glu Glu His 30Asp Ser Val Phe Pro 45Thr Pro Glu Glu lie 60Glu Gin Cys Ala Gly 75Ala Lys Met Trp lie 90Leu His Leu His Thr 105lie Asp Met Asp Phe 120Arg Glu Tyr Gly Phe 135Val Val Val Gly His 150Ala Lys Trp Met Arg 165Leu Lys Val Ala Arg 180Thr Glu Gly Asp Lys 195lie Asn Gly Tyr Gly 210Val Ser Glu Gin Ser 225Leu Tyr Asp lie Val 240Glu Ser lie Arg Glu 255Phe Leu Gin Asp Gly 270Asp Leu His Gly Met 285Leu Met Ala Glu Gly 300Thr Ala Ala Leu Val 315Arg LeuGlu AspGly AlaPro ArgPro AlaAla SerGlu ValVal AlaAla GluSer PheAla GlySer PheArg 496Met Tyr His lie Arg Leu Asp Arg Ala Ala lie LysLys Thr Met Glu Leu lie Ala lie Trp Val Glu AsnVal 320 Tyr 335 Leu 350 Val 365 Val 380 Asp 395 Val 410 Leu 425 lie 440 Thr 455 Cys 470 Glu 485Met His Glu His Phe Leu Lys Trp Leu Ala Val LeuAla Phe Val Pro Asp Gly Pro Lys Ala Glu Val LysAsp Glu Cys Leu Gly His Glu Pro Gly Gin lie TrpGlyProProSerGlyArgHisArgGlyLeuAsnAsnLys 325 Gly 340 Thr 355 lie 370 Glu 385 Phe 400 Glu 415 Pro 430 Ala 445 Gin 460 Glu 475 Glu 490Gly Thr Asn Glu lie Ala Gly Gly Gly Ala Arg Leu Met Pro Ser Leu His His Asp Phe His Thr Val PheSer PheLeu lieAla ThrLys GluAla Vallie ValLys LeuArg AspThr CysAla GluSer ValTrp ArgMet 330 Leu 345 Arg 360 Asp 375 Asn 390 Asn 405 Pro 420 Ser 435 Phe 450 Met 465 Ser 480 Gly 49权利要求
1、一种来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)IAM11001的耐高温L-阿拉伯糖异构酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO1。
2、 如权利要求1所述的耐高温L-阿拉伯糖异构酶，其氨基酸序列为SEQID NO: 2。
3、 如权利要求l所述的耐高温L-阿拉伯糖异构酶的表达方法，其特征是(1) 构建含有耐高温L-阿拉伯糖异构酶基因的表达质粒取嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001总DNA溶液3 pL作为模版，以包含S謂HI 和的酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，经PCR扩增得到所要的DNA 片段；引物h 5'画TGATGGATCCCATGCTGTCATTACGTCCT-3，引物2: 5'-TATATACTCGAGTTACCGCCCCCGCCAGAATAC-3'PCR反应条件为94°C 5min， 一个循环；94°C 60s， 56°C 60s， 72°C 90s，三十五个循环；最后72。C延伸10min;回收PCR产物，经限制性内切酶Samffl和WoI进行双酶切，与经过同样双,切的质粒pET-22b (+)，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET匿22b(+)-調A;(2) 将该重组质粒转化至宿主细胞中将重组质粒pET-22b(+)-araA转化 至感受态大肠杆菌BL21中，涂布含有50 (ig/mL氨苄抗生素的LB固体培养基 上，37。C培养18-24 h得到初步阳性克隆；(3) 经抗性培养基筛选得到阳性克隆分别挑取初步阳性克隆于5 mL含 有50 pg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37°C, 200 rpm培养过夜，提取 质粒，经限制性内切酶^^HI和;^oI酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表 SEQIDNO: 1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-22b(+)-araA，具有该质粒的 菌落为阳性克隆，命名为工程菌BL21-AI;对重组质粒pET-22b(+)-araA进行测序，结果表明插入片段为一个含有1491 bp，编码一个由496个氨基酸组成的蛋白质。
全文摘要
一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶及其基因序列，属于生物工程技术领域。本发明提出一种来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐高温L-阿拉伯糖异构酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO1，其氨基酸组成为SEQ ID NO2。本发明还公开了耐高温L-阿拉伯糖异构酶基因工程菌株的构建及耐高温L-阿拉伯糖异构酶的高效表达和纯化的方法。本发明提供的耐高温L-阿拉伯糖异构酶在较高温条件下具有较高的活性和稳定性，具有广泛的应用前景和经济意义。
文档编号C12N9/90GK101215554SQ200810019109
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月8日 优先权日2008年1月8日
发明者波 江, 沐万孟, 程丽芳 申请人:江南大学