利用菜籽饼粕制备l-阿拉伯糖的方法

利用菜籽饼粕制备l-阿拉伯糖的方法
【专利摘要】本发明公开了利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法，具体步骤如下：将菜籽饼粕用体积分数为70～80%的乙醇溶液脱脂脱色，然后加水提取，过滤收集滤液和滤渣，将滤渣再用NaOH溶液提取，然后用HCl溶液将pH调至4.9～5.1，离心收集上清液，合并水提液和碱提液，得菜籽粗多糖；将所得菜籽粗多糖用大孔吸附树脂D3520层析柱纯化后进行醇沉，再用DE-52纤维素柱纯化，得菜籽阿拉伯聚糖，最后将菜籽阿拉伯聚糖发酵，并用甲醇沉淀得粗L-阿拉伯糖，再用重结晶法提纯得L-阿拉伯糖，制得的L-阿拉伯糖得率为3.35%，纯度为97.6%。
【专利说明】利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品领域，特别涉及利用菜籽饼柏制备L-阿拉伯糖的方法。
【背景技术】
[0002]L-阿拉伯糖是一种新型的低热量甜味剂，其典型的生理功能是降低肠道内蔗糖转化酶活性，对蔗糖的代谢转化具有显著阻断作用，已被应用于减肥、控制糖尿病等方面，是国际上公认的健康食品添加剂。同时，L-阿拉伯糖还用于治疗白血病、癌症以及抗乙肝的药物原料。目前，日本厚生省和美国食品药品监督管理局已经批准L-阿拉伯糖为食品和药品的健康添加剂；而美国医疗协会也已将L-阿拉伯糖列入抗肥胖剂的营养补充剂或非处方药；2008年5月，中华人民共和国卫生部批准L-阿拉伯糖为新资源食品。L-阿拉伯糖在食品行业的普及应用无疑将成为新的行业热点。目前，全世界L-阿拉伯糖年需求量大约为I万吨，每年还以15%的速度递增。但受原料供应、分离纯化技术的限制，产量上不去，价格居高不下。日本和欧美的市场销售价为10万-12万美元/吨。而在国内，生产L-阿拉伯糖的主要企业有11家，总产能在500吨/年，产量较低，价格也相当昂贵，因此限制了阿拉伯糖的应用，但市场前景极为看好。
[0003]菜籽饼柏是来源油菜籽榨油后的副产物。我国油菜籽产量居世界第一位，每年油菜籽制油后所产生的菜籽饼柏达600-700万吨。菜籽饼柏是一个可再生生物质资源库，其蕴含的半纤维素多糖，还含有含有丰富的蛋白质、酚类化合物、植酸、糖类物质等，而这些成分都具有较高利用价值，其中半纤维素多糖是由L-阿拉伯糖等多种单糖组成。目前，我国菜籽饼柏利用相当有限，仅用作肥料或按少量比例添加作反刍动物和淡水鱼养殖的饲料。国内外不少学者以菜籽饼柏为饲料，研究了其对鱼类、畜类及禽类等多种动物生长和生理生化等方面的影响。结果普遍表明，少量短时喂养对动物生长表现正常，但是大量长时喂养就会产生不利影响。直接原因 是菜籽饼柏中含有多种抗营养因子及毒素，如硫代葡萄糖苷、芥酸、植酸、单宁、粗纤维、抗蛋白酶因子等，它们的存在影响了菜籽饼柏作为饲料的利用价值。但是如果这些成分能够分离出来并加以利用，将大大提高菜籽饼柏的附加值及综合利用率。如果将菜籽饼柏全部利用，每年可生产至少15万吨的L-阿拉伯糖，相当于目前全国L-阿拉伯糖总产量的300多倍。国内菜籽饼柏价格为2000元/吨，而L-阿拉伯糖的价格高达50万-80万元/吨，生产L-阿拉伯糖的同时，还可以得到饲用浓缩蛋白、植酸(盐)、多酚等产品。因此，急需一种利用菜籽饼柏制备L-阿拉伯糖的方法，该方法的应用能够提高榨油副产物菜籽饼柏的附加值，拓宽制备L-阿拉伯糖的原材料，提高L-阿拉伯糖的总产量,降低其生产成本。

【发明内容】

[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用菜籽饼柏制备L-阿拉伯糖的方法，其工艺简单，便于工业化生产。
[0005]为实现上述发明目的，技术方案为:[0006]利用菜籽饼柏制备L-阿拉伯糖的方法，包括如下步骤:
[0007]a.将菜籽饼柏加入体积分数为70~80%的乙醇溶液，然后在70~90°C下脱脂脱色，过滤收集滤渣，烘干，粉碎，得预处理菜籽饼柏；
[0008]b.将步骤a所得预处理菜籽饼柏加水在温度为90~100°C条件下提取，过滤收集滤液和滤渣，滤液记为提取液A ;将滤渣加入质量分数为4%~6%的NaOH溶液中，在温度为55~65°C条件下提取，然后加入浓度为2~4mol/L HCl溶液将pH调至4.9~5.1，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖；
[0009]c.将步骤b所得菜籽粗多糖用大孔吸附树脂D3520层析柱纯化，上样量相当于柱体积20~24倍，以流速为1.5~2.5柱体积/h洗脱，收集洗脱液，得菜籽多糖；
[0010]d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35~40%，然后在转速为4000~6000r/min条件下离心15~20min,弃沉淀,将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75~80%，再在转速为4000~6000r/min条件下离心15~20min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析48~72小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品；
[0011]e.将步骤d所得菜籽阿拉伯聚糖粗品用DE-52纤维素柱纯化，先用IOOmL蒸馏水洗脱，再用200mL浓度为0.lmol/L的NaCl溶液洗脱，最后用200mL浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.lmol/L的NaCl洗脱液，透析，减压浓缩，冻干，得到菜籽阿拉伯聚糖；
[0012]f.将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖中用质量分数为1.5~2.0%的硫酸酸解，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.0~7.0，待反应液冷却至30~35°C时加入1.0~1.5g酵母，在30~35°C条件下发酵2~3天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%~85%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤，得到粗L-阿拉伯糖；
[0013]g.将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为50%~60%，并调节pH至6.0~7.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为90~95%，加入L-阿拉伯糖晶体，4°C下恒温结晶32~48小时，真空抽滤，45°C~55°C下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。
[0014]优选的，所述步骤a是将菜籽饼柏按每克菜籽饼柏加入15~20mL体积分数为70~80%的乙醇溶液，然后在70~90°C下脱脂脱色2~3小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2~3次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼柏。
[0015]优选的，所述步骤a是将菜籽饼柏按每克菜籽饼柏加入20mL体积分数为80%的乙醇溶液，然后在80°C下脱脂脱色2小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼柏。
[0016]优选的，所述步骤b是将步骤a所得预处理菜籽饼柏按固液比为25~30mL/g加水，然后在温度为90~100°C条件下提取，过滤收集滤液和滤渣，滤液记为提取液A ;将滤渣加入质量分数为4%~6%的NaOH溶液，再在温度为55~65°C条件下提取，然后加入浓度为2~4mol/L HCl溶液将pH调至4.9~5.1，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖。
[0017]优选的，所述步骤b是将步骤a所得预处理菜籽饼柏按固液比为28mL/g加水，然后在温度为94°C条件下，过滤收集滤液和滤渣，滤渣再加水重复提取2次，合并3次滤液，记为提取液A ;将滤渣按料液质量体积比为20:1加入质量分数为5%的NaOH溶液，再在温度为60°C条件下提取2小时，然后加入浓度为4mol/L HCl溶液将pH调至5，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖。
[0018]优选的，所述步骤d是将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35%，然后在转速为4000r/min条件下离心15min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75%，再在转速为6000r/min条件下离心15min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析72小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品。
[0019]优选的，所述步骤f是将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖按每克加入400mL质量分数为2.0%的硫酸，搅拌均匀，在温度为80°C条件下酸解5小时，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.0，待反应液冷却至30°C时加入1.5g酵母，在30°C条件下发酵3天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤3次，得到粗L-阿拉伯糖。
[0020]优选的，所述步骤g是将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加50 V的水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为60%，并调节pH至7.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为95%，加入L-阿拉伯糖晶体，4°C下恒温结晶48小时，真空抽滤，45°C下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。
[0021]更优选的，所述步骤c中，所述大孔吸附树脂D3520层析柱由以下方法制备，将大孔吸附树脂D3520用体积分数为90~95%乙醇浸泡24~48h，充分溶胀，再用无水乙醇提取8~12小时，然后湿法装柱，树脂裝至柱高2/3~3/4处，用体积分数为90~95%的乙醇洗至流出液加水不变白色浑浊，再用水洗尽乙醇，然后用质量分数为4%~6%的HCl溶液以4~6柱体积/h流速进行酸洗后浸泡2~4h，继续用水以4~6柱体积/h流速洗至中性，最后用质量分数为4%~6%Na0H溶液以4~6BV/h流速进行碱洗，用水洗至中性，得大孔吸附树脂层析柱。
[0022]更优选的，所述步骤e 中，所述DE-52纤维素柱由以下方法制备:称取30g DE-52纤维素，用400~500mL浓度为0.5mol/L NaOH处理30~60min,抽滤,水洗至pH8~9 ;再以400~500mL浓度为0.4~0.6mol/L HCl处理30~60min,抽滤,水洗至pH6~7,然后以浓度为0.4~0.6mol/L NaOH处理后用湿法装柱法装柱而得。
[0023]本发明的有益效果在于:本发明公开了利用菜籽饼柏制备L-阿拉伯糖的方法，利用水和碱液将菜籽饼柏中的菜籽多糖充分提取出来，然后过大孔吸附树脂D3520层析柱，利用大孔吸附树脂D3520的弱极性充分去除蛋白和色素，同时能够避免对多糖被大孔树脂吸附；因此获得的菜籽多糖收率高；将菜籽多糖采用分步醇沉，先用体积分数为35-40%的乙醇沉淀以去除杂质，然后再用质量分数为75-80%的乙醇沉淀将菜籽阿拉伯聚糖沉淀下来，然后过DE-52纤维素柱并用浓度为0.lmol/L的NaCl洗脱，将菜籽阿拉伯聚糖洗脱下来，最后采用酸解、酵母发酵、结晶等工艺，得到高纯度的L-阿拉伯糖。
【专利附图】

【附图说明】
[0024]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0025]图1为利用菜籽饼柏制备L-阿拉伯糖的工艺路线图。
[0026]图2为菜籽阿拉伯聚糖浓缩物在DE-52纤维素柱上的洗脱曲线。
[0027]图3为乙酰酯衍生物气相色谱图(A:标准品色谱图；B:菜籽阿拉伯聚糖水解物色谱图、C:L-阿拉伯糖色谱图；1.L-鼠李糖；2.L-岩藻糖；3.L-阿拉伯糖；4.D-木糖；5.D_甘露糖；6.D-葡萄糖；7.D-半乳糖)。【具体实施方式】
[0028]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0029]一、实验材料和仪器
[0030]菜籽饼柏由重庆市利农一把手农业科技有限责任公司提供；大孔吸附树脂D3520购自安徽三星树脂科技有限公司；DE-52纤维素购自英国Whatman公司；L_鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-木糖、D-甘露糖购自美国Sigma-Aldrich公司；苯酚、硫酸、甲醇、氢氧化钠购自成都市科龙化工试剂厂；高活性干酵母购自安琪酵母股份有限公司。UV-9100型紫外可见分光光度计购自北京瑞利分析仪器公司；FA2004型电子天平购自上海恒平科学仪器有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅购自金坛市富华仪器有限公司；ALPHAl-4/LD型真空冷冻干燥机购自德国Marin Christ公司；N6890型气相色谱分析仪购自美国Agilent公司。
[0031]二、分析方法
[0032]1、总糖含量测定方法
[0033]总糖含量的测定采用改良的苯酚-硫酸法。
[0034]2、阿拉伯糖含量测定方法
[0035]采用盐酸-地衣酚法。
[0036]3、多糖中单糖组成及纯度分析
[0037]采用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法(GC)测定单糖组分。
[0038]三、利用菜籽饼柏制备L-阿拉伯糖的方法
[0039]利用菜籽饼柏制备L-阿拉伯糖的方法，其工艺路线如图1所示，具体步骤如下:
[0040]制备方法1:
[0041]a.将菜籽饼柏按每克菜籽饼柏加入20mL体积分数为80%的乙醇溶液，然后在80°C下脱脂脱色2小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼柏；
[0042]b.将步骤a所得预处理菜籽饼柏按固液比为28mL/g加水，然后在温度为94°C条件下，过滤收集滤液和滤渣，滤渣再加水重复提取2次，合并3次滤液，记为提取液A ;将滤渣按料液质量体积比为20:1加入质量分数为5%的NaOH溶液，再在温度为60°C条件下提取2小时，然后加入浓度为4mol/L HCl溶液将pH调至5，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖；
[0043]c.将步骤b所得菜籽粗多糖加入活化的24mmX 600mm规格的大孔吸附树脂D3520层析柱，以去除溶液中的游离蛋白及酚类等色素物质，为了进一步纯化可以将重复此步骤3次，上样量相当于柱体积24倍，以流速为1.5柱体积/h洗脱，收集洗脱液，得菜籽多糖；
[0044]d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35%，然后在转速为4000r/min条件下离心15min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75%，再在转速为6000r/min条件下离心15min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析72小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品；以提取前菜籽柏质量计算，菜籽阿拉伯聚糖粗品得率分别为5.55%， 其总糖含量为82%，蛋白质含量为4.7% ；[0045]e.将步骤d所得菜籽阿拉伯聚糖粗品用DE-52纤维素柱纯化，先用IOOmL蒸馏水洗脱，再用200mL浓度为0.lmol/L的NaCl溶液洗脱，最后用200mL浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.lmol/L的NaCl洗脱液(如图2所示)，透析，减压浓缩，冻干，得到菜籽阿拉伯聚糖；其总糖含量为93%，阿拉伯聚糖含量为75%，蛋白质含量为2.8% ；
[0046]f.将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖按每克加入400mL质量分数为2.0%的硫酸，搅拌均匀，在温度为80°C条件下酸解5小时，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.0，待反应液冷却至30°C时加入1.5g酵母，在30°C条件下发酵3天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤3次，得到粗L-阿拉伯糖；利用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法(GC)测定粗L-阿拉伯糖，结果如图3所示。
[0047]g.将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加50°C的水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为60%，并调节pH至7.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为95%，加入L-阿拉伯糖晶体，4°C下恒温结晶48小时，真空抽滤，45°C下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。利用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法(GC)测定L-阿拉伯糖纯度，结果如图3所示。
[0048]结果表明，利用本发明制备的L-阿拉伯糖的纯度为97%，得率为3.0%。
[0049]制备方法2:
[0050]a.将菜籽饼柏按每克菜籽饼柏加入15mL体积分数为70%的乙醇溶液，然后在90°C下脱脂脱色3小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理3次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼柏；
[0051]b.将步骤a所得预处理菜籽饼柏按固液比为25mL/g加水，然后在温度为100°C条件下，过滤收集滤液和滤渣，滤渣再加水重复提取42次，合并4次滤液，记为提取液A ;将滤渣按料液质量体积比为25:1加入质量分数为4%的NaOH溶液，再在温度为55°C条件下提取3小时，然后加入浓度为2mol/L HCl溶液将pH调至5.1，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜`籽粗多糖；
[0052]c.将步骤b所得菜籽粗多糖加入活化的24mmX 600mm规格的大孔吸附树脂D3520层析柱，以去除溶液中的游离蛋白及酚类等色素物质，为了进一步纯化可以将重复此步骤3次，上样量相当于柱体积24倍，以流速为3柱体积/h洗脱，收集洗脱液，得菜籽多糖；
[0053]d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为40%，然后在转速为5000r/min条件下离心20min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为80%，再在转速为5000r/min条件下离心20min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析48小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品；以提取前菜籽柏质量计算，菜籽阿拉伯聚糖粗品得率为5.57%，其总糖含量为85%，蛋白质含量为4.3% ；
[0054]e.将步骤d所得菜籽阿拉伯聚糖粗品用DE-52纤维素柱纯化，先用IOOmL蒸馏水洗脱，再用200mL浓度为0.lmol/L的NaCl溶液洗脱，最后用200mL浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.lmol/L的NaCl洗脱液(如图2所示)，透析，减压浓缩，冻干，得到菜籽阿拉伯聚糖；其总糖含量为90.7%，阿拉伯糖含量为74%，蛋白质含量为2.6% ；
[0055]f.将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖按每克加入质量分数为1.5%的硫酸400mL，搅拌均匀，在温度为90°C条件下酸解4小时，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.5，待反应液冷却至34°C时加入1.0g酵母，在34°C条件下发酵2天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤3次，得到粗L-阿拉伯糖；[0056]g.将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加45°C的水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为50%，并调节pH至6.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为90%，加入L-阿拉伯糖晶体，4°C下恒温结晶32小时，真空抽滤，50°C下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。利用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法(GC)测定L-阿拉伯糖纯度，其纯度为98%，得率为2.93%。
[0057]制备方法3:
[0058]a.将菜籽饼柏按每克菜籽饼柏加入ISmL体积分数为75%的乙醇溶液，然后在70°C下脱脂脱色2.5小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼柏；[0059]b.将步骤a所得预处理菜籽饼柏按固液比为30mL/g加水，然后在温度为90°C条件下，过滤收集滤液和滤渣，滤渣再加水重复提取2次，合并3次滤液，记为提取液A ;将滤渣按料液质量体积比为15:1加入质量分数为6%的NaOH溶液，再在温度为65°C条件下提取
2.5小时，然后加入浓度为3mol/L HCl溶液将pH调至4.9，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖；
[0060]c.将步骤b所得菜籽粗多糖加入活化的24mmX 600mm规格的大孔吸附树脂D3520层析柱，以去除溶液中的游离蛋白及酚类等色素物质，为了进一步纯化可以将重复此步骤2次，上样量相当于柱体积18倍，以流速为2.5柱体积/h洗脱，收集洗脱液，得菜籽多糖；
[0061]d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为40%，然后在转速为5000r/min条件下离心20min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为80%，再在转速为5000r/min条件下离心20min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析48小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品；以提取前菜籽柏质量计算，菜籽阿拉伯聚糖粗品得率分别为5.55%，其总糖含量不低于80%，蛋白质含量不高于5% ；
[0062]e.将步骤d所得菜籽阿拉伯聚糖粗品用DE-52纤维素柱纯化，先用IOOmL蒸馏水洗脱，再用200mL浓度为0.lmol/L的NaCl溶液洗脱，最后用200mL浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.lmol/L的NaCl洗脱液(如图2所示)，透析，减压浓缩，冻干，得到菜籽阿拉伯聚糖；其总糖含量为91.5%，阿拉伯聚糖含量为73.4%，蛋白质含量为2.86% ；
[0063]f.将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖按每克加入质量分数为1.8%的硫酸400mL，搅拌均匀，在温度为85°C条件下酸解4.5小时，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.5，待反应液冷却至35°C时加入1.2g酵母，在35°C条件下发酵2天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤3次，得到粗L-阿拉伯糖；
[0064]g.将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加55°C的水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为55%，并调节pH至6.5，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为90%，加入L-阿拉伯糖晶体，4°C下恒温结晶32小时，真空抽滤，55°C下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。利用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法(GC)测定L-阿拉伯糖纯度，其纯度为98.7%，得率为2.6%。
[0065]本发明中，大孔吸附树脂D3520层析柱由以下方法制备，将大孔吸附树脂D3520用体积分数为90~95%乙醇浸泡24~48h，充分溶胀，再用无水乙醇提取8~12小时，然后湿法装柱，树脂裝至柱高2/3~3/4处，用体积分数为90~95%的乙醇洗至流出液加水不变白色浑浊，再用水洗尽乙醇，然后用质量分数为4%~6%的HCl溶液以4~6柱体积/h流速进行酸洗后浸泡2~4h，继续用水以4~6柱体积/h流速洗至中性，最后用质量分数为4%~6%Na0H溶液以4~6BV/h流速进行碱洗，用水洗至中性，得大孔吸附树脂D3520层析柱。
[0066]本发明中，DE-52纤维素柱由以下方法制备:称取30g DE-52纤维素，用400~500mL浓度为0.5mol/L NaOH处理30~60min，抽滤，水洗至pH8~9 ;再以400~500mL浓度为0.4~0.6mol/L HCl处理30~60min,抽滤,水洗至pH6~7,然后以浓度为0.4~
0.6mol/LNa0H处理后用湿法装柱法装柱而得。
[0067]四、测定不同大孔吸附树脂的去杂质效果
[0068]将具有吸附色素和蛋白质能力的DlOl、D3520、D4020、DM130、DM301、D101、X-5等8种型号的大孔吸附树脂,做动态吸附试验。装24mmX 250mm层析柱,填料柱体积40mL。加入50mL步骤b提取的菜籽粗多糖过柱,流速lmL/min,收集液定容至100mL。测定动态吸附前后色素和蛋白质的含量。色素的测定以溶液在420nm处的吸光度表示，蛋白质的测定采用考马斯亮蓝染色法。
[0069]脱色率的测定方法:样品溶液采用IM HCl溶液和IM NaOH溶液调pH至7.0，以5000rpm/min转速离心20min，然后采用可见分光光度计在420nm测定吸光值。脱色率的计算公式如下:
[0070]脱色率(%)= (A1-A2) /A1X 100
[0071]式中ApA2分别是样品溶液在大孔吸附树脂吸附前后的吸光值，结果如表1所示。
[0072]表1不同树脂对菜籽多糖提取液中色素的动态吸附性能比较
[0073]
【权利要求】
1.利用菜籽饼柏制备L-阿拉伯糖的方法，其特征在于，包括如下步骤: a.将菜籽饼柏加入体积分数为70~80%的乙醇溶液，然后在70~90°C下脱脂脱色，过滤收集滤渣，烘干，粉碎，得预处理菜籽饼柏； b.将步骤a所得预处理菜籽饼柏加水在温度为90~100°C条件下提取，过滤收集滤液和滤渣，滤液记为提取液A ;将滤渣加入质量分数为4%~6%的NaOH溶液中，在温度为55~65°C条件下提取，然后加入浓度为2~4mol/L HCl溶液将pH调至4.9~5.1，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖； c.将步骤b所得菜籽粗多糖用大孔吸附树脂D3520层析柱纯化，上样量相当于柱体积20~24倍，以流速为1.5~2.5柱体积/h洗脱，收集洗脱液，得菜籽多糖； d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35~40%，然后在转速为4000~6000r/min条件下离心15~20min,弃沉淀,将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75~80%，再在转速为4000~6000r/min条件下离心15~20min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析48~72小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品； e.将步骤d所得菜籽阿拉伯聚糖粗品用DE-52纤维素柱纯化，先用IOOmL蒸馏水洗脱，再用200mL浓度为0.lmol/L的NaCl溶液洗脱，最后用200mL浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.lmol/L的NaCl洗脱液，透析，减压浓缩，冻干，得到菜籽阿拉伯聚糖； f.将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖用质量分数为1.5~2.0%的硫酸酸解，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.0~7.0，待反应液冷却至30~35°C时加入1.0~1.5g酵母，在30~35°C条件下发酵2~3天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%~85%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤，得到粗L-阿拉伯糖； g.将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为50%~60%，并调节pH至6.0~7.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为90~95%，加入L-阿拉伯糖晶体，4°C下恒温结晶32~48小时，真空抽滤，45°C~55°C下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤a是将菜籽饼柏按每克菜籽饼柏加入15~20mL体积分数为70~80%的乙醇溶液，然后在70~90°C下脱脂脱色2~3小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2~3次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼柏。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述步骤a是将菜籽饼柏按每克菜籽饼柏加入20mL体积分数为80%的乙醇溶液，然后在80°C下脱脂脱色2小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼柏。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤b是将步骤a所得预处理菜籽饼柏按固液比为25~30mL/g加水，然后在温度为90~100°C条件下提取，过滤收集滤液和滤渣，滤液记为提取液A ;将滤渣加入质量分数为4%~6%的NaOH溶液，再在温度为55~65°C条件下提取，然后加入浓度为2~4mol/L HCl溶液将pH调至4.9~5.1，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述步骤b是将步骤a所得预处理菜籽饼柏按固液比为28mL/g加水，然后在温度为94°C条件下，过滤收集滤液和滤渣，滤渣再加水重复提取2次，合并3次滤液，记为提取液A ;将滤渣按料液质量体积比为20:1加入质量分数为5%的NaOH溶液，再在温度为60°C条件下提取2小时，然后加入浓度为4mol/L HCl溶液将PH调至5，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤d是将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35%，然后在转速为4000r/min条件下离心15min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75%，再在转速为6000r/min条件下离心15min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析72小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤f是将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖按每克加入400mL质量分数为2.0%的硫酸，搅拌均匀，在温度为80°C条件下酸解5小时，然后加入氢氧化钡溶液将PH调至6.0，待反应液冷却至30°C时加入1.5g酵母，在30°C条件下发酵3天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤3次，得到粗L-阿拉伯糖。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤g是将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加50°C的水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为60%，并调节pH至7.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为95%，加入L-阿拉伯糖晶体，4°C下恒温结晶48小时，真空抽滤，45°C下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于:所述步骤c中，所述大孔吸附树脂D3520层析柱由以下方法制备，将大孔吸附树脂D3520用体积分数为90~95%乙醇浸泡24~48h，充分溶胀，再用无水乙醇提取8~12小时，然后湿法装柱，树脂裝至柱高2/3~3/4处,用体积分数为90~95%的乙醇洗至流出液加水不变白色浑浊,再用水洗尽乙醇,然后用质量分数为4%~6%的HCl溶液以4~6柱体积/h流速进行酸洗后浸泡2~4h，继续用水以4~6柱体积/h流速洗至中性，最后用质量分数为4%~6%NaOH溶液以4~6BV/h流速进行碱洗，用水洗至中性，得大孔吸附树脂层析柱。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于:所述步骤e中，所述DE-52纤维素柱由以下方法制备:称取30g DE-52纤维素，用400~500mL浓度为0.5mol/L NaOH处理30~60min,抽滤,水洗至pH8~9 ;再以400~SOOmT,浓度为0.4~0.6mol/L HCl处理30~60min,抽滤,水洗至pH6~7,然后以浓度为0.4~0.6mol/L NaOH处理后用湿法装柱法装柱而得。
【文档编号】C08B37/00GK103468761SQ201310442009
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】朱建飞, 代紫薇, 蒋艳, 唐春红 申请人:重庆工商大学