一种高产岩藻多糖酶的海洋交替假单胞菌及其应用的制作方法

本发明属于海洋微生物筛选技术领域，具体涉及一种高产岩藻多糖酶的海洋交替假单胞菌及其应用。

背景技术：

岩藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是褐藻细胞壁含有的一种水溶性多糖，主要由L-岩藻糖和不同硫酸酯化的L-岩藻糖组成。此外，还含有一定量的D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸，少量的D-木糖和L-阿拉伯糖，是一种化学组成和结构都十分复杂的高分子量的酸性多糖化合物。研究发现，该类多糖具有抗氧化、降血脂、抗凝血、抗病毒、抗肿瘤、增强机体免疫力等各种生物学活性，且其生理活性与多糖分子量、硫酸根的含量及其取代位置有重要关系。因此，要深入研究该类多糖的构效关系，就需要对多聚糖进行降解，而该类多糖的定向降解有赖于特定降解酶的获得。利用该多糖降解酶获得系列寡糖，并从寡糖结构层面阐明其作用靶点，这是创新药物及系列功能寡糖制品开发的重要途径。

为了实现上述目标，岩藻多糖降解酶的获得至关重要。但由于该类酶存在活力较低等问题，该酶的商业化生产始终没有实现，因此筛选高活力产酶微生物菌株仍是一个重要的课题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株高产岩藻多糖降解酶菌株，从而推动了岩藻寡糖的制备及应用，以弥补现有技术的不足。

本发明的第一个目的在于提供一株产岩藻多糖酶的交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)OU03株，该微生物菌株保存在位于北京市海淀区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13477，保藏日期为2016年12月22日。

本发明的微生物菌株用于生产岩藻多糖降解酶；

本发明还提供了一种用于诱导上述海洋微生物表达产生岩藻多糖降解酶的培养基，培养基的基本碳源为岩藻多糖硫酸酯；该菌株诱导产生的大部分酶活都集中在胞内，有利于后续活性酶的富集。

作为实施例的具体记载，所述的培养基的配方如下：岩藻多糖硫酸酯2g/L，蛋白胨1g/L，用海水配制后调节pH为7.6-7.8。

本发明另一个方面是提供一种制备岩藻多糖降解酶的方法，是使用筛选的菌株进行发酵制备岩藻多糖降解酶。

本发明筛选的菌株所产生的岩藻多糖降解酶可以降解岩藻多糖硫酸酯，产生具有潜在生物学活性的寡聚岩藻糖硫酸酯。该微生物具有发酵周期短，酶活性高，且多数活性为胞内酶活，有利于后续样品的收集及保存，为其工业化应用奠定了基础。

附图说明

图1：OU03菌的生长曲线图，

图2：诱导后OU03不同部位岩藻多糖酶降解活性图(DNS法)，

图3：诱导培养OU03产生的岩藻多糖酶的C-PAGE分析图，其中A为胞内酶；B为发酵液。

具体实施方式

本发明从海洋无脊椎动物消化腺来源的共生微生物中筛选获得了一株高产专一性的岩藻多糖酶的菌株，且多数活性为胞内酶活，有利于后续利用该菌株所产的酶进行规模化制备岩藻寡糖硫酸酯。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述

实施例1：微生物的筛选及鉴定

1、微生物的筛选

在无菌条件下对活扇贝、海胆及鲍鱼进行解剖，分离出它们的消化腺，在提取的海洋生物消化腺以及烂海带中加入无菌生理盐水，浸提后获得扇贝、海胆、鲍鱼消化腺以及烂海带的组织悬浊液。分别取组织悬浊液1-2mL接入岩藻多糖硫酸酯液体选择培养基A中，并于25℃、150rpm振荡培养箱中进行培养。24h后对各菌株的产岩藻多糖酶活性进行测定，选择有酶活性的菌液100-200μL涂布到岩藻多糖硫酸酯固体选择培养基B上。将培养板置于25℃培养箱中进行培养。从平板上挑取生长状态良好的菌落接种于岩藻多糖硫酸酯液体选择培养基D中，于摇床中振荡培养。24h后对各菌株的产岩藻多糖酶活性进行测定，选择酶活性高的菌株进行后续筛选。

培养基配方如下：

液体选择培养基A：岩藻多糖2g/L，蛋白胨1g/L，过膜海水配置，pH 7.6-7.8。

固体选择培养基B：在液体培养基D的基础上，补加琼脂。液体发酵培养基：岩藻多糖1g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，K₂HPO4 0.2g/L，MgSO₄ 0.05g/L，过膜海水配置，pH 7.6-7.8。

对酶活性高的菌株的降解岩藻多糖硫酸酯的产物进行分析，最终筛选出产岩藻多糖酶活性最高，酶解产物单一性高的菌株。

该微生物保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13477，保藏日期为2016年12月22日。

2、菌株OU03的16S rRNA基因的扩增、序列测定及分析

采用细菌基因组提取试剂盒(Tiangen)提取已筛选到的高活性菌株的基因组，以此为模板，扩增该菌株的16S rRNA基因。采用以下引物：

27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

PCR反应按照以下条件进行：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸90s共进行35个循环，之后68℃延伸10min。获得的RCR产物经胶回收试剂盒(Omega)纯化后，与pMD19-T载体(Takara)连接，转化E.coli Top 10感受态细胞，挑取阳性克隆进行DNA测序。

菌株16S rRNA的进化树分析显示其与Pseudoalteromonassp的亲缘关系最近。

实施例2：微生物的发酵产酶

1、发酵培养

将筛选得到的高活性菌株进行发酵培养，获得该微生物在岩藻多糖硫酸酯培养基中的生长曲线。

按1-3％的接种量，将种子液接入岩藻多糖硫酸酯液体发酵培养基中，25-37℃，150rpm摇床中培养，在不同时间收集发酵液，以未接菌的培养基作为空白对照，测定菌液600nm处吸光值，绘制该菌的生长曲线(图1)。结果发现该菌在岩藻多糖硫酸酯培养基中，大约在18-24小时内达到生长的平台期，此时OD₆₀₀＝5.3左右。这作为将来菌体收集的最佳时间。

2、不同部位酶的提取及活性测定(以下操作均在4℃条件下进行)

①胞外酶：将发酵液在20,000g条件下离心30min。将离心后的上清透析到50mMTris-HClpH7.5，200mMNaCl缓冲液中。

②胞内酶：上一步中发酵液离心后的菌体用50mMTris-HClpH7.5，200mMNaCl缓冲液重悬，之后进行超声破碎(超声3s，间隔5s，总时间15min)，超声破碎后的液体在20,000g条件下离心20min，收集离心后的上清即为提取的胞内酶。

采用DNS检测还原糖的方法对提取的酶组份进行活性测定。分别以葡萄糖和岩藻多糖硫酸酯为碳源诱导OU03菌株产酶，将提取的胞内酶和胞外酶(发酵液冻干粉)各100μL分别加入200μL 0.2％的岩藻多糖硫酸酯溶液中，25℃反应12h左右，酶解反应的缓冲液为50mMTris-HCl pH7.5 200mMNaCl。反应结束后，取200μL反应液加入等体积DNS，100℃加热5min显色，12000rpm离心5min，取上清200μL检测520nm处的吸光值，结果如图2所示。测定结果表明，该菌的岩藻多糖酶是由岩藻多糖硫酸酯的诱导产生的，且岩藻多糖酶多位于细胞内。

3、酶解产物的电泳分析

用提取的胞内和胞外的粗酶对岩藻多糖硫酸酯进行降解，以加入同体积灭活酶作为对照，反应结束后采用PAGE法对降解产物进行分析。降解后样品和上样缓冲液(10％蔗糖，0.01％酚红)混合，选用6％浓缩胶和27％分离胶，电极缓冲液为50mMTris-HCl 2mM EDTA pH8.7，200V电泳2小时，电泳结束后用阿利新蓝染料结合银染进行染色。

结果如图3所示，酶解产物在电泳图中有明显的条带出现，说明有低聚糖产生，表明在该菌的细胞内提取物中有明显的岩藻多糖酶活性。

4、酶解产物的质谱分析

酶解产物的制备

酶解反应的缓冲液为50mMTris-HCl(pH7.5200mMNaCl)，将提取的胞内酶15mL和胞外酶20mL(发酵液冻干粉)分别加入35mL0.2％的岩藻多糖硫酸酯水溶液中，25℃反应48h。反应结束后，100℃加热10min对酶进行灭活，12000rpm室温离心20min，收集上清液即为酶解产物。

酶解混合液经过G10凝胶柱脱盐，收集糖组分，洗脱液浓缩后冷冻干燥，用适量乙腈/水溶解后进行质谱分析。然后利用质谱测试测定样品分子量。测定结果证明酶解产物中含有分子量为324Da，550Da，696Da和776Da的组分，经过计算后表明其对应的分别是1个Fuc2S，2个Fuc3S，3个Fuc3S和3个Fuc4S，这进一步证明了该微生物分泌的酶具有降解岩藻多糖硫酸酯的活性。