一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法
【专利摘要】本发明涉及一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法，所述质量分析方法利用HPLC-柱后衍生-荧光检测法对褐藻多糖硫酸酯进行含量分析，其色谱条件为：色谱柱采用至少一根以上适合多糖的分离范围为2,000–1,000,000道尔顿的色谱柱组成；流动相采用50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH6.7）-乙腈（87:17，V/V）；HPLC柱温为室温；流速为0.1mL/min–1.0mL/min。本发明具有灵敏度高、重现性好、稳定性好等优点，适用于褐藻多糖硫酸酯的含量测定和药代动力学研究。
【专利说明】一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药生物检测领域，具体涉及一种褐藻多糖硫酸酯的的质量分析方 法。
【背景技术】
[0002] 褐藻多糖硫酸酯是一类硫酸化多糖，存在于部分海洋褐藻和海洋无脊椎动物中， 首先由Kylin在1913年用稀酸从掌状海带中提取出来。Kylin将提取物水解后分离出L-岩 藻糖，他将这种多糖命名为fucoidin，现根据多糖的命名原则一般定名为fucoidan，中文 名称为褐藻多糖硫酸酯，也被称为岩藻多糖、岩藻聚糖、岩藻聚糖硫酸酯或褐藻糖胶。现在 人们对褐藻多糖硫酸酯的组成有较为清晰的了解，它是一类化学组成和结构非常复杂的多 糖，以岩藻糖和硫酸基为主，随着褐藻的种类不同还含有少量半乳糖、木糖、糖醛酸等其他 成分。
[0003] 褐藻多糖硫酸酯是具有多种生物活性的一类类肝素多糖，现已报道褐藻多糖硫酸 酯具有抗凝血、提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、以及用于治疗慢性肾 衰、糖尿病肾病、心肌缺血和帕金森病等多种疾病。
[0004] 含量测定是药物可靠性的重要依据。目前测定褐藻多糖硫酸酯含量的主要方法有 半胱氨酸硫酸法、Cameron法、气相色谱法和液相色谱法。这些方法都需要将待分析的褐藻 多糖硫酸酯样品先水解，再分离或衍生化，间接测定褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖的含量， 因操作繁琐，对定量分析不方便。而且由于不同褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量有所不同， 依据岩藻糖来确定褐藻多糖硫酸酯的含量难免会有所偏差。
[0005] 同时，药物开发必须对药物的体内代谢产物和代谢机理进行研究，确保药物在体 内的活性和安全性，也能够指导新药设计、优选给药方案、改善药物剂型等。褐藻多糖硫酸 酯经体内代谢后，血清、器官等生物组织中药物浓度低，在分析前还要去除蛋白质、类脂等 其他影响结果测定的杂质，这必然造成褐藻多糖硫酸酯药物一定程度的损失，使分析样品 中药物浓度更低。所以要进行这些样品的微量检测，难度很大，致使褐藻多糖硫酸酯的药代 动力学研究一直进展缓慢。之前采用的半胱氨酸硫酸法、Cameron法由于检测限度高，不能 用于微量分析。
[0006] 气相色谱法和液相色谱法需将褐藻多糖硫酸酯水解为岩藻糖，再进行色谱分析。 由于岩藻糖在强酸条件下不稳定，导致水解后的岩藻糖测定结果重现性差、误差较大，难以 对生物样品中微量褐藻多糖硫酸酯进行准确分析。这就要求建立一种高灵敏度、重现性好 的微量分析方法，检测体内样品的褐藻多糖，为药代动力学研究提供条件。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种高灵敏度、重现性好、稳定性佳的褐藻多糖硫酸酯质量 分析方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方 法，所述质量分析方法利用HPLC-柱后衍生-荧光检测法对褐藻多糖硫酸酯进行含量分析， 其色谱条件为：色谱柱采用至少一根以上适合多糖的分离范围为2, 000 - 1，000, 000道 尔顿的色谱柱组成；流动相采用50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6. 7)-乙腈（87:17, V/ V) ;HPLC 柱温为室温；流速为 0· 1 mL/min - 1. 0 mL/min ; 柱后衍生条件：衍生试剂：50 - 500 mmol/L盐酸胍；反应液：0. 1 - 2.0 mol/L氢氧 化钠；衍生液流速：〇. 2-0. 5 mL/min ;冷却液：0. 5 mol/L氢氧化钠；冷却液流速：0. 1 - 0. 5 mL/min ;柱后反应器温度：70-130 °C ; 荧光检测条件：激发波长Ex=255 nm ;检测器发射波长Em=430 nm ; 检测方法采用外标法，以高纯度褐藻多糖硫酸酯作为标准。
[0009] 其中，所述质量分析方法还有生物样品前处理步骤：将血清或组织匀浆液中加入 0. 1-1.0 mol/L氯化钠；根据褐藻多糖硫酸酯分子量大小，采用截留分子量大于褐藻多糖 硫酸酯分子量范围的膜进行超滤离心。
[0010] 优选的，色谱条件为：色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ(300 mmX7. 6 mm);柱 温箱温度：室温；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6. 7) -乙腈（87:17, V/V);高 效液相系统的流速：〇· 5 mL/min ;进样体积：20 μ L。
[0011] 柱后衍生条件： 反应系统条件：衍生反应液浓度：〇. 5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流 速：0. 3 mL/min ;冷却液：0. 5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0. 3 mL/min ;柱后反应器温度： 125。。。
[0012] 荧光检测条件：检测器激发波长Ex=255 nm ;检测器发射波长Em=430 nm ;PMT=14 或17。
[0013] 优选的，所述质量分析方法的色谱条件为：色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ (300 mmX7.6 mm)，加保护住：Shodex Asahipak GS-2G 7B (50mmX7. 6mm);柱温箱温度： 室温；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6. 7) -乙腈（87:17, V/V);高效液相系统 的流速：〇. 5 mL/min ;进样体积：20 μ L ; 检测器激发波长Ex=255 nm ;检测器发射波长Em=430 nm ;ΡΜΤ=14或17 ; 衍生反应系统条件： 衍生反应液浓度：0.5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3 mL/ min ;冷却液：0. 5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0. 3 mL/min ;柱后反应器温度：125°C。
[0014] 与现有技术相比，本发明首次建立了一种利用HPLC-柱后衍生-荧光检测法对褐 藻多糖硫酸酯进行含量测定的方法。该方法具有灵敏度高、重现性好、稳定性好等优点，适 合用于褐藻多糖硫酸酯的含量测定和药代动力学研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是褐藻多糖硫酸酯盐酸胍衍生物的最佳激发光谱和最佳发射光谱。
[0016] 图2是褐藻多糖硫酸酯盐酸胍衍生物的三维荧光谱图。
[0017] 图3是不同盐酸胍浓度对衍生褐藻多糖硫酸酯荧光强度的影响。
[0018] 图4是不同氢氧化钠浓度对褐藻多糖硫酸酯衍生效率的影响。
[0019] 图5是不同温度对衍生后荧光效率的影响。
[0020] 图6是血清中不同浓度褐藻多糖硫酸酯色谱图（PMT=14)。
[0021] 图7是柱后衍生法测定血清中褐藻多糖硫酸酯浓度标准曲线。
[0022] 图8是兔单次静脉注射褐藻多糖硫酸酯的药时曲线。
[0023] 图9是单次静脉注射50mg/Kg褐藻多糖硫酸酯拟合曲线。
[0024] 图10是兔血清单次静脉注射褐藻多糖硫酸酯的药时色谱图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
[0026] 实施例1，褐藻多糖硫酸酯的制备 将500 g海带除去泥沙，用20倍水在高压锅中提取3小时，控制温度10(Tl05°C，提取 2次。除去藻体，合并2次提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，向浓缩液中加入2 mol/L MgCl2 使MgCl2终质量浓度为0. 05 mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20%，搅拌生 成沉淀，离心除去沉淀，取上清液，用3500Da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液，冻干得褐 藻多糖，得率为1.85%。
[0027] 取上述冻干得到的褐藻多糖溶于水，配成浓度为2. 5%的水溶液，上样到以 DEAE-Sepharose-CL_6B 为载体柱层析，依次用 0.1 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl、1.0mol/ L NaCl、1.5 mol/L NaCl和2.0mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，收集各洗脱液，分别透析、冻 干。其中由1.0m〇l/L NaCl洗脱所得的白色絮状沉淀即为纯化的褐藻多糖硫酸酯。
[0028] 实施例2,羊栖菜褐藻多糖硫酸酯的制备 将500 g羊栖菜，用20倍水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105°C，提取2次。 除去藻体，合并2次提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入2 mol/L MgCl2使MgCl2终质量 浓度为〇. 05 mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20%，搅拌生成沉淀，离心除去 沉淀，上清液，用3500Da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液，冻干得羊栖菜粗褐藻多糖硫 酸酯，得率为3.29%。
[0029] 实施例3,高效液相-柱后荧光衍生法测定褐藻多糖硫酸酯含量的条件优化与测 定 本实施例中所用褐藻多糖硫酸酯样品为实施例1中所制备的纯化的褐藻多糖硫酸酯。
[0030] (1)最佳激发波长和发射波长的确定。
[0031] 以盐酸胍为衍生试剂的反应液配制：在试管中分别加入褐藻多糖硫酸酯样品，盐 酸胍，氢氧化钠及硼砂，使得终浓度分别为褐藻多糖硫酸酯5 μ g/mL，盐酸胍浓度50 mmol/ L，氢氧化钠浓度为0. 5 mol/L，硼砂2 %。同时以空白作为对照。在110°C反应30 min，冷 却至室温。使用二维和三维扫描确定最佳激发和发射波长。实验结果如附图1和图2。图 1是褐藻多糖硫酸酯盐酸胍衍生物的最佳激发光谱和最佳发射光谱，图2是褐藻多糖硫酸 酯盐酸胍衍生物的三维荧光谱图。通过实验确定最佳激发波长和最佳发射波长分别为激发 波长Ex=249nm ;发射波长Em=435nm。
[0032] (2)最佳反应体系条件的优化 色谱条件： 色谱柱：以倍压管代替；进样体积：20 μ L ;流动相：水；流动相流速：0. 5 mL/min ;衍 生液流速：〇. 3 mL/min ;冷却液：0. 3mL/min ;检测器激发波长Ex=249nm ;检测器发射波长 Em=435nm; PMT=14 或 17。
[0033] 衍生反应液配制： 褐藻多糖硫酸酯样品的配制：采用实施例1中所制备纯化的褐藻多糖硫酸酯，配制浓 度为1 mg/mL的母液，分别稀释到5 μ g/mL和10 μ g/mL。不同浓度盐酸胍、氢氧化钠，以 及反应温度如表1，采用单一变量进行选择最佳反应条件。实验结果如附图3、图4和图5 所示。图3是不同盐酸胍浓度对衍生褐藻多糖硫酸酯荧光强度的影响，图4是不同氢氧化 钠浓度对褐藻多糖硫酸酯衍生效率的影响，图5是不同温度对衍生后荧光效率的影响。通 过条件优化确定盐酸胍浓度为50-50 m mol/L ;氢氧化钠浓度为0· 1 - 2. 0 mol/L ;反应温 度为 70-130 ° C。
[0034] 表1高效液相-柱后荧光衍生法优化衍生反应条件选择
【权利要求】
1. 一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法，其特征在于，所述褐藻多糖硫酸酯的质量分 析方法利用HPLC-柱后衍生-荧光检测法对褐藻多糖硫酸酯进行含量分析，其色谱条件为： 色谱柱采用至少一根以上适合多糖的分离范围为2, 00(Tl，000, 000道尔顿的色谱柱组成； 流动相采用50臟〇1/1磷酸二氢钾缓冲液（？!16.7)-乙腈（87:17，￥八〇 ;流速为0.111117 min - 1. 0 mL/min ;柱温为：20_40°C ; 柱后衍生条件：衍生试剂：50 - 500 mmol/L盐酸胍；反应液：0. 1 - 2.0 mol/L氢氧 化钠；衍生液流速：〇. 2-0. 5 mL/min ;冷却液：0. 5 mol/L氢氧化钠；冷却液流速：0. 1 - 0. 5 mL/min ;柱后反应器温度：70-130 °C ; 荧光检测条件：激发波长Ex=255 nm ;检测器发射波长Em=430 nm ; 检测方法采用外标法，以高纯度褐藻多糖硫酸酯作为标准。
2. 如权利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯的的质量分析方法，其特征在于，应用于药代 动力学分析时，生物样品前处理步骤为：将血清或组织匀浆液中加入O.fl.O mol/L氯化 钠；根据褐藻多糖硫酸酯分子量大小，采用截留分子量大于褐藻多糖硫酸酯分子量范围的 膜进行超滤离心。
3. 如权利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯的的质量分析方法，其特征在于，所述质量分 析方法的色谱条件为：色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ (300 mmX7. 6 mm);柱温箱温 度：室温；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6. 7) -乙腈（87:17, V/V);高效液相 系统的流速：〇. 5 mL/min ;进样体积：20 μ L ; 柱后衍生条件： 反应系统条件：衍生反应液浓度：0.5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流 速：0. 3 mL/min ;冷却液：0. 5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0. 3 mL/min ;柱后反应器温度： 125。。； 荧光检测条件：检测器激发波长Ex=255 nm;检测器发射波长Em=430 nm;PMT=14或17。
4. 如权利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯的的质量分析方法，其特征在于，所述质量分 析方法的色谱条件为：色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ(300 mmX7. 6 mm),加保护住： Shodex Asahipak GS-2G 7B(50mmX7. 6mm);柱温箱温度：室温；流动相：50 mmol/L 磷酸二 氢钾缓冲液（pH 6· 7) -乙腈（87:17, V/V);高效液相系统的流速：0· 5 mL/min ;进样体积： 20 μ L ； 检测器激发波长Ex=255 nm ;检测器发射波长Em=430 nm ;ΡΜΤ=14或17 ; 衍生反应系统条件： 衍生反应液浓度：〇. 5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0. 3 mL/ min ;冷却液：0. 5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0. 3 mL/min ;柱后反应器温度：125°C。
【文档编号】G01N30/88GK104280490SQ201310275429
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】张全斌, 张文静, 金维华, 王晶 申请人:南通中国科学院海洋研究所海洋科学与技术研究发展中心, 中国科学院海洋研究所