专利名称：羊栖菜硒多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种多糖的制备方法。
背景技术：
近年来，合成硒多糖的方法主要有以下几种
(I)将SeO32-取代硫酸酯多糖中的硫酸酯-SO3-把硒加到多糖中，以及其他如SeOCl2与多糖振荡反应等，但这些方法仍存在硒结构相对单一，且硒含量不高等不足。以灵芝硒多糖为例，将吡啶30ml加入附有冷凝管和搅拌装置的IOOml三颈瓶中，边搅拌边加入三氧化硒-吡啶2. 5 3. Og,在热水浴中加热至90°C，再加入多糖粉末O. 5g，恒温搅拌，冷却至室温；振荡反应液用3mol/L的NaOH溶液调至中性，加入95%乙醇，析出灵芝硒多糖。因为吡 啶有强烈刺激性气味，因此此种方法要求在通风条件下进行，操作繁琐。(2)将硼氢化钠还原硒粉得到Se2_或-SeSe-，然后与卤代羧酸在碱性条件下振荡反应制备出相应的羧酸硒醚和二硒醚，用乙酸硒醚与邻氨基苯甲酸或水杨酸振荡反应以引入其他基团，最后与多糖中的羟基进行酰化振荡反应，合成出含硒醚、二硒醚结构新的硒多糖，此方法既可以在多糖中引入不同种类硒的结构。以麒麟菜多糖为例，首先用NaBH4还原硒粉得Se2_或-SeSe _，然后在碱性水溶液中与氯乙酸、3_氯丙酸和对溴甲基苯甲酸在室温下振荡反应，制得相应的羧酸硒醚，收率分别为51. 9 %、62. 6 %和58. 6 %，以及丙酸和对甲基苯甲酸二硒醚，收率67. 8 %和72. I %。用乙酸硒醚分别与邻氨基苯甲酸和水杨酸振荡反应引入其他基团，收率73. 6%和69. 8 %。最后这些合成的化合物通过形成酰氯与麒麟菜多糖中的羟基醚化得到含硒醚或二硒醚结构的新型硒多糖。此方法过程繁琐，多糖损失大，结构破坏严重，所用试剂为有毒试剂，在实际生产应用中价值不大。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有合成硒多糖的方法操作繁琐、有刺激性气味及所用试剂有毒的技术问题，提供了一种羊栖菜硒多糖的制备方法。羊栖菜硒多糖的制备方法按照以下步骤进行
一、向IOOml体积分数为O.5%的HNO3水溶液中加入Ig羊栖菜多糖，得到多糖溶液；
二、将亚硒酸钠加入到多糖溶液中，得到混合溶液，混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为0.4 I. 2g lg，然后在50°C 90°C水浴的条件下振荡反应6 10h，冷却，然后加入NaCO3调节pH值为5 6，离心，然后透析至透析液加入抗坏血酸检测后无红色停止透析，加热浓缩，冷冻干燥，即得羊栖菜硒多糖。本发明方法操作简单、无刺激性气味，所用试剂无毒环保，所制备的羊栖菜多糖能明显抑制S18tl肉瘤在荷瘤小鼠上的生长，显著提高S18tl荷瘤小鼠胸腺指数、脾指数及ConA诱导的脾淋巴细胞增殖，提高荷瘤小鼠NK细胞活性及腹腔巨噬细胞的吞噬活性。提高机体免疫功能是羊栖菜多糖抑制肿瘤生长的机制之一。羊栖菜多糖还可调节或恢复S18tl荷瘤小鼠红细胞多种生理生化功能。激光共聚焦扫描技术测定荷瘤小鼠红细胞内[Ca2Ii的变化，运用相关试剂盒测定红细胞膜表面唾液酸含量和Na+、K+-ATPase及Ca2+、Mg2+-ATPase活性的变化，用流式细胞仪分析红细胞膜电位水平的变化，采用高效毛细管电泳法测定红细胞电泳合淌度的变化。结果现实羊栖菜多糖能降低荷瘤小鼠红细胞内[Ca2Ii，升高膜表面唾液酸的含量，增强膜表面Na+、K+-ATPaSe及Ca2+、Mg2+-ATPase的活性，提高红细胞膜电位水平，提高红细胞的电泳合淌度。羊栖菜多糖也可通过诱导肿瘤细胞凋亡起到抗肿瘤作用。羊栖菜多糖可阻滞MCF7细胞由GcZG1期进入S期，升高细胞凋亡指数(APO)，同时上调Fas、FasLmRNA的表达。羊栖菜多糖对人胃癌细胞SGC-7901和人直肠癌C0L0-205有较好的疗效。羊栖菜多糖可阻滞SGC-7901人胃癌细胞内GノG1期进入S期，升高细胞凋亡指数(AP0%)。使SGC-7901细胞内[Ca2Ii先升高然后下降，给予CaCl2后，[Ca2+ L又升高。提示羊栖菜多糖通过升高肿瘤细胞内[Ca2Ii启动肿瘤细胞凋亡机制而达到抗肿瘤 的作用，[Ca2Ii升高时Ca2+来源于细胞内钙库释放。采用Westernblot法測定P53基因表达，研究羊栖菜多糖对肿瘤细胞P53基因表达的影响。羊栖菜多糖可显著诱导肿瘤细胞野生型P53水平的増加，从而达到抗肿瘤的作用。羊栖菜多糖对HL-60细胞具有显著生长抑制作用，并呈量效和时效关系，药物浓度为300 mg/L和500 mg/L作用HL-60细胞后，观察到典型的细胞凋亡形态学特征，DNA凝胶电泳呈现梯状条带，DNA直方图出现IG1峰。在一定浓度范围内，SFPS诱导细胞凋亡的作用呈现浓度和时间依赖性，同时G2/M期细胞比例增多。结论SFPS抗肿瘤作用与诱导细胞凋亡和G2/M期细胞阻滞有夫。
图I是具体实施方式
六中所用羊栖菜多糖放大500倍的扫描电镜照片；
图2是具体实施方式
六中所用羊栖菜多糖放大1000倍的扫描电镜照片；
图3是具体实施方式
六中所用羊栖菜多糖放大2000倍的扫描电镜照片；
图4是具体实施方式
六中所用羊栖菜多糖放大5000倍的扫描电镜照片；
图5是具体实施方式
六中所得羊栖菜硒多糖放大2000倍的扫描电镜照片；
图6是具体实施方式
六中所得羊栖菜硒多糖放大3000倍的扫描电镜照片；
图7是具体实施方式
六中所得羊栖菜硒多糖放大20000倍的扫描电镜照片；
图8是具体实施方式
六中所得羊栖菜硒多糖放大5000倍的扫描电镜照片；
图9是实验一中振荡反应时间对羊栖菜硒多糖振荡反应的影响 图10是实验ニ中振荡反应温度对羊栖菜硒多糖振荡反应的影响 图11是实验三中亚硒酸钠与羊栖菜多糖质量比对羊栖菜硒多糖振荡反应的影响图； 图12是实验四中固定水平=X3=O振荡反应时间和振荡反应温度交互作用的响应面；
图13是实验四中固定水平=X3=O振荡反应时间和振荡反应温度交互作用的等值线图；图14是实验四中固定水平=X2=O振荡反应时间和亚硒酸钠与羊栖菜多糖质量比交互作用的响应面；
图15是实验四中固定水平=X2=O振荡反应时间和亚硒酸钠与羊栖菜多糖质量比交互作用的等值线 图16是实验四中固定水平=X1=O振荡反应温度和亚硒酸钠与羊栖菜多糖质量比交互作用的响应面；
图17是实验四中固定水平=X1=O振荡反应温度和亚硒酸钠与羊栖菜多糖质量比交互作用的等值线图。图18是浓度为O. 2mg/ml的羊栖菜多糖水溶液中羊栖菜多糖的粒度分布 图19是浓度为O. 2mg/ml的羊栖菜硒多糖(实验六制备的)水溶液中的粒度分布 图20是浓度为O. 02mg/ml的羊栖菜多糖水溶液中羊栖菜多糖的粒度分布 图21是浓度为O. 02mg/ml的羊栖菜硒多糖(实验六制备的)水溶液中羊栖菜多糖的粒度分布图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式羊栖菜硒多糖的制备方法按照以下步骤进行
一、向IOOml体积分数为O.5%的HNO3水溶液中加入Ig羊栖菜多糖，得到多糖溶液；
二、将亚硒酸钠加入到多糖溶液中，得到混合溶液，混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为0.4 I. 2g lg，然后在50°C 90°C水浴的条件下振荡反应6 10h，冷却，然后加入NaCO3调节pH值为5 6，离心，然后透析至透析液加入抗坏血酸检测后无红色停止透析，加热浓缩，冷冻干燥，即得羊栖菜硒多糖。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中所述的混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为O. 6g lg。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中所述的混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为O. 9g Ig0其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中所述的混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为Ig Igo其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中在60°C水浴的条件下振荡反应。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中在70°C水浴的条件下振荡反应。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中在80°C水浴的条件下振荡反应。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中的振荡反应时间为7h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中的振荡反应时间为8h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中的振荡反应时间为9h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
i^一 本实施方式羊栖菜硒多糖的制备方法按照以下步骤进行
一、向IOOml体积分数为O.5%的HNO3水溶液中加入Ig羊栖菜多糖，得到多糖溶液；
二、将亚硒酸钠加入到多糖溶液中，得到混合溶液，混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为0.8g lg，然后在70°C水浴的条件下振荡反应8h，冷却，然后加入NaCO3调节PH值为5，离心，然后透析至透析液加入抗坏血酸检测后无红色停止透析，加热浓縮，冷冻干燥，即得羊栖菜硒多糖。由图18-20可知在同一浓度(如都在0. 2mg/ml或都在0. 02mg/ml)下，羊栖菜硒多糖的粒径要比未硒结合的羊栖菜多糖的粒径小，一方面说明经过反应，羊栖菜多糖部分被水解成单糖或者寡糖，这些单糖或寡糖通过透析膜除去，因此羊栖菜硒多糖粒径比未结合的羊栖菜多糖粒径小；另一方面，一般来说，粒径变小后更加容易被胃肠道吸收和利用。在不同浓度时羊栖菜硒多糖在两个浓度项下的粒径是不一样的，稀的溶液中粒径更加小，说明羊栖菜硒多糖在稀溶液中分散的更开，也更加利于吸收。采用下述实验验证各因素对制备羊栖菜硒多糖的影响
实验ー
羊栖菜硒多糖的制备方法按照以下步骤进行
一、向IOOml体积分数为0. 5%的HNO3水溶液中加入Ig羊栖菜多糖，得到多糖溶液；
ニ、将亚硒酸钠加入到多糖溶液中，得到混合溶液，混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为0. 8g lg，然后在70°C水浴的条件下分别振荡反应6し711、811、911、1011，冷却，然后加入NaCO3调节pH值为5，离心，然后透析至透析液加入抗坏血酸检测后无红色停止透析，加热浓缩，冷冻干燥，即得羊栖菜硒多糖。由图9可知随着振荡反应时间的增加，羊栖菜硒多糖的硒含量不断提高，但8h之后硒含量降低，主要因为随着振荡反应时间延长，多糖在酸性环境下水解，因此选取7 9h为振荡反应优化条件。实验ニ
羊栖菜硒多糖的制备方法按照以下步骤进行
一、向IOOml体积分数为0. 5%的HNO3水溶液中加入Ig羊栖菜多糖，得到多糖溶液；
ニ、将亚硒酸钠加入到多糖溶液中，得到混合溶液，混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为0. 8g Ig，然后分别在50°C、60°C、70°C、80°C、90°C水浴的条件下振荡反应8h，冷却，然后加入NaCO3调节pH值为5，离心，然后透析至透析液加入抗坏血酸检测后无红色停止透析，加热浓缩，冷冻干燥，即得羊栖菜硒多糖。由图10可知，随着温度的升高，羊栖菜硒多糖硒含量也随之増大；但温度升高到70で之后羊栖菜硒多糖硒含量反而下降，这是因为在高温下羊栖菜结构被破坏，从而确定提取温度为70°C 90°C。实验三
羊栖菜硒多糖的制备方法按照以下步骤进行
一、向IOOml体积分数为0. 5%的HNO3水溶液中加入Ig羊栖菜多糖，得到多糖溶液；
ニ、将亚硒酸钠加入到多糖溶液中，得到混合溶液，混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为 0.4 g lg、0.6 g lg、0.8 g lg、1.0 g lg、1.2g lg,然后在 70°C水浴的条件下振荡反应8h，冷却，然后加入NaCO3调节pH值为5，离心，然后透析至透析液加入抗坏血酸检测后无红色停止透析，加热浓缩，冷冻干燥，即得羊栖菜硒多糖。由图11可知随着质量比増大，羊栖菜硒多糖硒含量也随之増大；但在亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为增至0. Sg Ig之后，羊栖菜硒多糖硒含量上升不明显，因此确定亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为O. 6 l.Og Igo实验四响应曲面实验
一、3响应曲面实验设计
通过单因素实验确定出不同提取温度、提取时间及液料比时羊栖菜多糖提取的较优范围，利用Box-Behnken中心组合设计,设计3因素3水平的响应曲面实验。振荡反应时间(h)、振荡反应温度(°C)、亚硒酸钠与羊栖菜多糖质量比(g/g)及提取次数，分别用X1^X 2、X3表示，并以-1、0、+ I代表变量的水平，按方程Xi =( Xi - X。)/ ΛΧ对自变量进行编码，其中，X i为变量的编码值，Xi为变量的真实值，Xtl为实验中心点变量的真实值，ΛΧ为变量的变化步长，响应值Y为黄芪多糖提取率，实验因素与水平见表I (中心组合实验Box Behnken方案设计的因素及水平编码)。表I - V V i ； J- p .；
糊_ X!靈蕩歡 时 >0 mmRmmf X3 Ha2Seo3.多糖
__議 ___Cgg1)_
-I76006
O8700.3
+1930U
二、响应面实验结果及分析
I、实验结果
响应实验结果见表2(羊栖菜硒多糖响应曲面方案及结果)。表2共有17个实验点，其中的12个为析因点，另5个为零点，自变量取值在Xp X2、X3所构成的顶点即为析因点；区域的中心点为零点，其中零点实验重复做5次，用以估算实验的误差。表 2
序号卜振荡反应时间/h IX,振荡反应时间/°C|X,Na,SeO,:多糖/(g ·g—1) |硒含量/(mg/g)—
1-I (7) '-I (60)_0 (0.8)2. 1007
2'l (9) '-I (60)_0 (0.8)2.6787
3-I (7) ' I (80)~0 (0.8)2.7755
4'l (9) ■ I (80)_0 (0.8)2.6281
5-I (7) _0 (70)1 (0.6)2.6735
6·1 (9) ~0 (70)1 (0.6)3.0104
7-I (7) ~0 (70)~ I (I. O)2.8999
8·1 (9) ~0 (70)~ I (I. O)3.0398
9O (8) '-I (60)~-1 (0.6)2.3591
10O (8) ' I (80)1 (0.6)2.9632
11O (8) '-I (60)— 1 (1.0)2.7944
12O (8) ' I (80)~ I (I. O)3. 0563
13O (8) 'O (70)~ 0 (0.8)3.2837
14O (8) ~0 (70)~ 0 (0.8)3.2276
15O (8) ~0 (70)~0 (0.8)3.2163
16O (8) 'O (70)_0 (0.8)3.2392
17|θ (8) |θ (70)|θ (0.8)丨3.32852、拟合模型的建立及显著性分析
利用Design Expert 7. O软件对表2实验数据进行多元回归拟合，得羊栖菜硒多糖硒含量(Y)对振荡反应时间(X1)、振荡反应温度(X2)、亚硒酸钠与羊栖菜多糖质量比(X3)的二次多项回归模型方程为
Y=3. 26 + 0. IlX1 + 0. 19X2 + 0. 098X3 — 0. ISX1X2 — 0. 049XA — 0. 086X2X3 — 0. SOX12 —0. 4IX22 - 0. 053XS2
对该模型进行显著性检验结果及回归模型系数显著性检验结果见表3 (回归方程的方差分析結果)。从表3中可知该模型极显著(P < 0. 0001) ；C. V. %为2. 08，R2和AdjR2分别为
0.9862和0. 9684，因此说明该模型的拟合度良好。方程中X1J2 J3J1X2 J2X3J12J22对响应值的影响非常的显著，其他因素间的交互影响相对较小。表权利要求
1.羊栖菜硒多糖的制备方法，其特征在于羊栖菜硒多糖的制备方法按照以下步骤进行 一、向IOOml体积分数为0.5%的HNO3水溶液中加入Ig羊栖菜多糖，得到多糖溶液； 二、将亚硒酸钠加入到多糖溶液中，得到混合溶液，混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为0.4 I. 2g lg，然后在50°C 90°C水浴的条件下振荡反应6 10h，冷却，然后加入NaCO3调节pH值为5 6，离心，然后透析至透析液加入抗坏血酸检测后无红色停止透析，加热浓缩，冷冻干燥，即得羊栖菜硒多糖。
2.根据权利要求I所述羊栖菜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤二中所述的混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为0.6g lg。
3.根据权利要求I所述羊栖菜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤二中所述的混合溶 液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为0. Sg Igo
4.根据权利要求I所述羊栖菜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤二中所述的混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为0.9g lg。
5.根据权利要求I所述羊栖菜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤二中所述的混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为Ig Igo
6.根据权利要求I所述羊栖菜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤二中在6(T80°C水浴的条件下振荡反应。
7.根据权利要求I所述羊栖菜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤二中在70°C水浴的条件下振荡反应。
8.根据权利要求I所述羊栖菜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤二中的振荡反应时间为7 9h。
9.根据权利要求I所述羊栖菜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤二中的振荡反应时间为8h。
全文摘要
羊栖菜硒多糖的制备方法，它涉及一种多糖的制备方法。本发明为了解决解决现有合成硒多糖的方法操作繁琐、有刺激性气味及所用试剂有毒的技术问题。本方法如下一、向100ml体积分数为0.5%的HNO3水溶液中加入1g羊栖菜多糖，得到多糖溶液；二、将亚硒酸钠加入到多糖溶液中，得到混合溶液，混合溶液中亚硒酸钠与羊栖菜多糖的质量比为0.4～1.2g﹕1g，然后在50℃～90℃的条件下反应6～10h，冷却，然后加入NaCO3调节pH值为5～6，离心，然后透析至透析液加入抗坏血酸检测后无红色停止透析，加热浓缩，冷冻干燥，即得羊栖菜硒多糖。本发明方法操作简单、无刺激性气味，所用试剂无毒环保。
文档编号C08B37/00GK102850465SQ20121038356
公开日2013年1月2日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者季宇彬, 于淼, 东方 申请人:哈尔滨商业大学, 季宇彬