一种硒酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多糖的制备技术领域，具体为一种硒酸酯化梭柄松苞菇多糖（sCVPs) 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或 其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、 肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。根据世界卫生组织在2014年公布的数据，全球 糖尿病患者人数已经达到3. 47亿。
[0003] 具有药用价值的食用真菌在传统民间药物中被认为是非常重要的治疗药物之一， 并且应用非常普遍。研究表明，食用真菌对疾病的治疗主要是由于它所含有生物活性物质 所引起的。这些食用真菌的活性物质可以使糖尿病患者的肝脏、胰腺等脏器功能恢复正常， 从而促进胰岛素和相关激素的分泌，使得机体的代谢功能恢复。
[0004] 多糖具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病等药用活性。大量研究证明，将多糖硒酸 酯化之后能够显著增加多糖的生物活性，并且糖尿病患者体内硒含量普遍低于正常人，因 此合理补充硒元素有利于缓解糖尿病患者的相关症状，同时可以对糖尿病进行有效预防。 现阶段对多糖进行硒化修饰的方法主要是化学法和生物法，生物法存在这产品质量不均 一，重复性差，培养条件控制困难等缺点；化学法往往为了获得较高硒含量，而以损失富硒 多糖的得率为代价，并且硒转化率也相对较低。目前并没有利用梭柄松苞菇多糖进行硒酸 酯化的研究，值得注意的是梭柄松苞菇多糖的分子量较其他菌类多糖而言较小，而分子量 的大小往往与取代度和生物活性成反比，因此用硒酸酯化的梭柄松苞菇多糖应用于抗糖尿 病的研究必将会为多糖的化学修饰和多糖的生物活性提供新思路和参考。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种以梭柄松苞菇为代表的高效的食用菌多糖硒酸酯化 的方法，，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种硒酸酯化梭柄松苞菇多糖的制 备方法，其特征在于：（1)取新鲜梭柄松苞菇进行预处理；（2)梭柄松苞菇多糖的制备，具 体为：水提取：先用乙醇进行洗涤，然后离心处理，将离心管的沉淀样品干燥，并按料液比 1 : 20与蒸馏水混合，然后进行超声波处理，超声波作用功率为150W，每工作15min，暂停 5min，提取温度80°C，提取时间2. 5h，上述水提取步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄 松苞菇多糖提取液；乙醇沉淀：将梭柄松苞菇多糖提取液用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积 的95 %乙醇溶液，搅拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心处理，然后弃上清液，收集沉淀，冻 干待用；去除蛋白质：按固液比1 : 10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇多糖，然后加入1/4倍体 积的氯仿-正丁醇，充分振荡30min后，再离心处理，获得三层液体，吸取最下层多糖溶液， 重复该去除蛋白质步骤5次；去除小分子物质：将去除蛋白质的多糖提物，流水透析过夜， 透析袋的截留分子量为3000,以去除小分子杂质；再用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩， 与4倍体积的95%乙醇溶液混合，搅拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心处理，离心机转 速5000rpm，时间5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冷冻干燥备用；（3)硒酸酯化 梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：取分子量范围为5. 0X103-1. 0X104Da的500mg梭柄松苞 菇多糖置于三口烧瓶中，加入体积分数为〇. 5%的HN03水溶液100mL，加热、搅拌使梭柄松 苞菇多糖全部溶解，水浴升温至70°C时，分别加入400mgNa2SeO#P1. 44gBaCl2，反应10h; 反应结束后，迅速冷却至室温，用无水Na2C03调整pH值至6,再加入无水Na2S04以沉淀多余 的BaCl2，离心去沉淀，透析，取少量透析液加入维生素C检测，无红色时停止透析，冷冻干燥 后所得粉末即为硒酸酯化梭柄松苞菇多糖。
[0007] 进一步的，新鲜梭柄松苞菇的预处理步骤具体为，
[0008] 清洁：用塑料刮片将新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除，不可用水清洗，不然表面的 多糖会损失；
[0009] 切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个切块大小适中且均匀；
[0010] 冷冻干燥：将梭柄松荀燕块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5%的样品。
[0011] 进一步的，乙醇沉淀步骤和去除蛋白质步骤中的离心处理的离心机转速5000rpm， 时间5min。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1)本专利选用的原料（梭柄松苞菇）在 四川、云南和贵州等地广泛种植，采集方便，价格低廉，并且CVPs已经被证明具有较为突出 的抗糖尿病活性，因此具备进一步被开发利用的潜质；（2)本专利建立了一种高效的sCVPs 的制备方法，其中首次评价了多糖分子量范围对多糖硒酸酯化的影响，最终所得sCVPs的 硒含量、硒转化率和得率分别达到了 174. 22yg/mg、29. 31 %和61. 43%。并且整个制备过 程的反应条件温和，成本低廉，操作简单易于工业推广；(3)动物实验证明，对CVPs进行硒 酸酯化修饰后，sCVPs的生物活性得到显著提高，仅需摄入0. 2g/kg/d剂量的sCVPs，便能够 显著提高糖尿病小鼠血清中各氧化剂的水平，以缓解其氧化应激水平，从而实现对糖尿病 的治疗。
【具体实施方式】
[0013] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例 仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0014] 本发明提供一种硒酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备方法，其特征在于：（1)取新鲜 梭柄松苞菇进行预处理；清洁：用塑料刮片将新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除，不可用水 清洗，不然表面的多糖会损失；切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个切块大小适 中且均勾；冷冻干燥：将梭柄松荀燕块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5%的样品。（2) 梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：水提取：先用乙醇进行洗涤，然后离心处理，将离心管的 沉淀样品干燥，并按料液比1 : 20与蒸馏水混合，然后进行超声波处理，超声波作用功率 为150W，每工作15min，暂停5min，提取温度80°C，提取时间2. 5h，上述水提取步骤重复提 取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液；乙醇沉淀：将梭柄松苞菇多糖提取液用 旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95%乙醇溶液，搅拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心 处理，然后弃上清液，收集沉淀，冻干待用；去除蛋白质：按固液比1 : 10加入蒸馏水溶解 梭柄松苞菇多糖，然后加入1/4倍体积的氯仿-正丁醇，充分振荡30min后，再离心处理， 获得三层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该去除蛋白质步骤5次；去除小分子物质：将去 除蛋白质的多糖提物，流水透析过夜，透析袋的截留分子量为3000,以去除小分子杂质；再 用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，与4倍体积的95%乙醇溶液混合，搅拌0. 5h后，置 于4°C冰箱12h，再离心处理，离心机转速5000rpm，时间5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松 苞菇多糖，冷冻干燥备用；（3)硒酸酯化梭柄松苞菇多糖的制备，具体为：取分子量范围为 5.OX103-1.OX104Da的500mg梭柄松苞菇多糖置于三口烧瓶中，加入体积分数为0.5%的 HN03水溶液100mL，加热、搅拌使梭柄松苞菇多糖全部溶解，水浴升温至70°C时，分别加入 400mgNa2Se0jP1. 44gBaCl2，反应10h;反应结束后，迅速冷却至室温，用无水Na2C03调整 pH值至6,再加入无水Na2S04以沉淀多余的BaCl2，离心去沉淀，透析，取少量透析液加入维 生素C检测，无红色时停止透析，冷冻干燥后所得粉末即为硒酸酯化梭柄松苞菇多糖。
[0015] 上述最优梭柄松苞菇多糖分子量范围为5. 0X103-1. 0X104Da，其确定采用如下方 法，
[0016] (1)多糖酸水解：①取适量梭柄松苞菇多糖样品于具塞试管中，用0.lmol/L三氟 乙酸（TFA)溶解，然后在110°C条件下水解lh，再用分子截留规格为5.0X102的透析袋对 该反应液进行透析，以去除三氟乙酸和其他杂质，并收集透析袋内液体，即为多糖水解液； ②除分子截留规格为1.0X106的透析袋直接对多糖水解进行透析外，其余规格的透析袋 均对上一次透析袋外的多糖水解液进行透析（透析袋规格：1.OX106、5.OX105、3.OX105、 1. 0X105、5. 0X104、3. 0X104、1. 0X104、5. 0X103、3. 0X103、1. 0X103)，收集透析袋内的液 体，冻干后即获得多糖分子量分别为：> 1. 〇X106、5. 0X105-1. 0X106、3. 0X105-5. 0X105、 1.OX105-3.OX105、5.OX104-1.OX105、3.OX104-5.OX104、1.OX104-3.OX104、 5.OX103-1.OX104、3.OX103-5.OX103、1.OX103-3.OX103,10 组不同分子量范围的组分。
[0017] (2)每个组分进行硒酸酯化比较它们的取代度和得率。
[0018] 表1:分子量对多糖的硒酸酯化取代度和得率的影响
[0019]
[0020] 每个数值均表示为三次测试的平均值土标准差（SD)，同一列中不同的字母表示 具有显著差异（P< 〇? 05)
[0021] 由表1可得，多糖的分子量为5. 0X 103-1. 0X 104、3. 0X 103-5. 0X 103、 1. OX 103-3. O