一株高产酯低产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建与应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，具体涉及一株高产酯低 产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法与应用。
【背景技术】：
[0002] 白酒是中国特有的蒸馏酒，独特风味，备受喜爱。高级醇和酯类是白酒中非常重要 的成分，和其它风味物质以一定的比例共存于酒体中，互相配合、补充、衬托和制约，发挥各 自的特点形成不同香型和不同风格的白酒。酯类物质种类较多，在白酒中大多以乙酯形式 存在，具有水果样芳香和口味，是酒芳香的主要担体，使人产生喜悦感。白酒中大部分酯对 酒的风味都有积极作用，提高酒中酯类物质的含量可以增进酒的风味，改善酒的品质。高级 醇味道大多似酒精，持续的时间长，有后劲，含量的多少和各种醇之间的比例对白酒的风味 有着重要的影响。适量的高级醇和协调的组分比可以赋予白酒特殊的香味，衬托出酯的香 气，使酒的口感协调、柔和。倘若高级醇含量不足，酒味将变得稀薄单调，口感不饱满；反之， 高级醇含量过高会使酒产生异杂味，影响酒的风味和品质。另外，高级醇在人体内的氧化速 度比乙醇慢，停留时间较乙醇长，其对人体的毒害作用远远高于乙醇。因此，白酒中高级醇 的含量必须控制在合适的范围内。
[0003] 如何提高白酒中酯的含量和降低高级醇的含量，一直都是我国普通白酒企业和相 关科研单位研究的重要课题。国内大部分研究都是通过优化发酵工艺、蒸馏工艺和勾兑技 术使白酒中尚级醇和酯的构成及量比关系达到最理想的状态，导致我国尚档白酒存在耗粮 高、生产周期长、效率低、成本高等问题。而构建高产酯低产高级醇酿酒酵母工程菌株，才可 以从根本上解决酯含量较低而高级醇含量较高的问题，也是工业微生物育种的发展方向。
[0004] 酿酒酵母在白酒发酵过程中生成酒精的同时，产生了一定量的高级醇以及少量的 酯类。研究表明，ATFl基因编码的醇乙酰基转移酶是乙酸乙酯、乙酸异戊酯等乙酸酯类合 成的关键酶，并存在于细胞膜上，该酶催化醇类和乙酰辅酶A形成乙酸酯。Lilly等人用工 业菌株过表达ATF1，用葡萄汁发酵培养基进行发酵，葡萄酒中的乙酸乙酯浓度提高了 3-10 倍，乙酸异戊酯浓度提高了 4-12倍。IAHl基因编码乙酸异戊酯水解酶，对清酒的研究发现， IAHl基因缺失的清酒酵母菌株所产乙酸异戊酯的浓度远高于野生清酒酵母菌株，乙酸异丁 酯的产量较野生清酒酵母菌株也有增加。采用分子育种技术提高调控酯合成的酶活性，减 弱或抑制调控酯分解的酶活性，是提高酯生成量有效的措施。在生成高级醇的氨基酸分解 代谢途径中，由BAT2基因编码的氨基酸转氨酶的缺失可以阻断或减弱氨基酸转变成α -酮 酸的量，进而可以减少缬氨酸生成异丁醇和亮氨酸生成异戊醇的量。采用分子育种技术减 弱或抑制调控高级醇合成的酶活性，从而切断了或减弱了高级醇代谢途径，是降低高级醇 生成量有效的措施。
[0005] 在高级醇和酯的代谢途径中，醇类与酰基辅酶A可以缩合生成酯，而酵母产生的 酯水解酶催化酯水解生成醇类。ΒΑΤ2基因的缺失通过降低异丁醇、异戊醇等高级醇前体物 的量降低高级醇的产量；而ATFl基因的过表达通过提高醇类和乙酰辅酶A形成乙酸酯的 量，提高酯类含量的同时进一步的降低了高级醇的含量；IAHl基因的缺失通过降低相关乙 酸酯的分解又进一步提高乙酸酯的含量。已有研究通过在啤酒酵母中敲除BAT2基因同时 过表达ATFl基因，高级醇总量降低了 27. 3%，乙酸酯提高了 6. 96倍。
[0006] 公布号为201110094875. 9的中国发明专利通过在黄酒酵母中敲除IAHl基因同时 过表达ATFl基因，乙酸乙酯产量提高了 20. 9倍，乙酸异戊酯和乙酸异丁酯也有提高，同时 异戊醇降低了 49%。在白酒和黄酒高产酯低产高级醇酵母菌株选育的相关研究中，尚没有 同时调控尚级醇代谢和酯代谢相关关键基因的报道。
[0007] 因此，本发明通过完全敲除氨基酸转氨酶编码基因 BAT2的和乙酸异戊酯水解酶 编码基因 IAH1，同时两次过表达醇乙酰基转移酶编码基因 ATF1，选育高产酯低产高级醇酿 酒酵母工业菌株，满足酿酒酵母应用相关领域对酵母的较高要求，为白酒行业带来显著的 经济效益。
【发明内容】
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[0008] 本发明解决的技术问题之一是提供一株高产酯低产高级醇酿酒酵母。
[0009] 所述高产酯低产高级醇酿酒酵母是在出发酵母菌株中完全敲除编码氨基酸转氨 酶的BAT2基因和编码乙酸异戊酯水解酶的IAHl基因，同时两次强启动子PGKl过表达编码 醇乙酰基转移酶的ATFl基因所得。
[0010] 所述BAT2基因其Gene ID为：853613,核苷酸序列如序列表中SEQ NO: 1所示；
[0011] 所述IAHl基因其Gene ID为：854293,核苷酸序列如序列表中SEQ NO: 2所示；
[0012] 所述ATFl基因其Gene ID为：854559,核苷酸序列如序列表中SEQ NO: 3所示；
[0013] 所述启动子PGKl其Gene ID为：850370,核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 4所 示；
[0014] 优选的，所述出发酵母菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)CICC32315， 保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可购买获得。
[0015] 本发明解决的另一个技术问题是提供一种高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株的构 建方法，包括如下步骤：
[0016] (1)过表达ATFl基因的重组片段的构建
[0017] ①用限制性内切酶Hindlll，分别对质粒pPGKl和载体质粒pUC19进行酶切，切 胶回收质粒PPGKl的酶切产物强启动子PGK1，连接强启动子PGKl和载体pUC19,构建质粒 pUC-P ；
[0018] ②以出发酵母菌株基因组为模板，PCR扩增ATFl基因，用限制性内切酶XhoI对质 粒pUC-P和ATFl基因片段进行酶切，将两者连接构建质粒pUC-PA ;
[0019] ③以质粒pUG6为模板，PCR扩增KanMX基因，用限制性内切酶KpnI对质粒pUC-PA 和KanMX基因片段进行酶切，将两者连接构建质粒pUC-PAK ;
[0020] (2)敲除BAT2基因同时过表达ATFl基因
[0021 ] ①以质粒pUC-PAK为模板，PCR扩增获得含有BAT2上游同源臂、PGKl强 启动子、ATFl基因、KanMX基因和BAT2下游同源臂的基因片段（BAT2上游同源 臂-PGKp-ATFl-PGKt-KanMX-BAT2 下游同源臂）；
[0022] ②制备出发酿酒酵母菌株CICC32315的单倍体，筛选出各项发酵性能综合最优的 a型和α型单倍体分别作为出发菌株，以下步骤操作以a型为例；
[0023] ③将步骤（2)-①得到的PCR产物导入出发酵母菌株a型单倍体中，获得BAT2基 因的敲除同时ATFl的过表达的重组菌株1 ;
[0024] ④用pGAP质粒去除步骤（2)-③获得菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX基因 的重组菌株2-1，传代得到不含pGAP质粒的重组菌株2 ;
[0025] (3) IAHl基因的敲除同时过表达ATFl基因
[0026] ①以质粒pUC-PAK为模板，PCR扩增获得含有IAHl上游同源臂、PGKl强 启动子、ATFl基因、KanMX基因和IAHl下游同源臂的基因片段（IAHl上游同源 臂-PGKp-ATFl-PGKt-KanMX-IAHl 下游同源臂）；
[0027] ②将步骤（3)-①得到的PCR产物导入不含pGAP质粒的重组菌株2中，获得BAT2 基因敲除，IAHl基因敲除，同时ATFl两次过表达的重组菌株3 ;
[0028] ③用pGAP质粒去除步骤（3)_②获得菌株中的KanMX基因，获得不含抗性基因， IAHl敲除、BAT2敲除同时ATFl两次过表达的重组菌株4-1，传代得到不含pGAP质粒的重 组菌株4 ;
[0029] ④以a型单倍体作出发菌株重复上述步骤，将a型和α型单倍体分别作为出发菌 株得到的重组菌株4进行融合，得到双倍体重组菌株5,即本发明所述的高产酯低产高级醇 酿酒酵母菌株。
[0030] 所述重组菌株可通过上述方法构建，所涉及具体操作方法已有很多文献报道，如 Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。
[0031] 有益效果：
[0032] 1、本发明提供了一种高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株，既克服了普通酿酒酵母由 于酯产量低导致的风味不协调，同时降低了对人体有不良影响的高级醇的产量。
[0033] 2、本发明提供的高产酯低产高级醇酿酒酵母在保持良好发酵性能的前提下，完全 敲除氨基酸转氨酶编码基因 BAT2和乙酸异戊酯水解酶编码基因 IAH1，同时醇乙酰基转移 酶编码基因 ATFl的表达量显著提高，达到了高产酯低产高级醇的目的，本发明所述的酿酒 酵母重组菌株，在其它发酵性能不受影响的情况下，玉米浓醪发酵4天，主要酯（乙酸乙酯、 乙酸异戊酯、乙酸异丁酯）含量达到1303. 6mg/L，乙酸乙酯的含量是出发菌株的52倍，主要 高级醇（异丁醇、异戊醇、正丙醇、苯乙醇）含量为151. 8mg/L，较出发菌株降低了 61.4%。 为酿造出风味优良且更有利于健康的白酒奠定了理论基础，具有广阔的市场前