景，同时为 研究相关基因对白酒风味协调性的影响奠定了基础。
[0034] 3、本发明在菌株构建过程中创造性的两次过表达ATFl基因，较常规技术中的一 次过表达取得了预料不到的技术效果-高级醇含量有效降低。重组菌株的主要高级醇含 量，相比BAT2基因敲除同时ATFl基因过表达的重组菌、IAHl基因敲除同时ATFl基因过 表达的重组菌、BAT2基因敲除IAHl基因敲除同时ATFl基因过表达的重组菌分别降低了 12. 1%、34· 8%、9· 9%。
[0035] 4、本发明选育得到的酵母菌株通过Cre/LoxP系统完全剔除了 KanMX抗性基因，不 含外源抗性基因，可以安全的用于工业生产，有广泛的应用前景。
【附图说明】：
[0036] 图1为pUC-PAK质粒构建过程；
[0037] 图2为质粒pUC-PAK的PCR验证：
[0038] 其中：（a)中M为marker ; 1为以pUC-PAK为模板，PGK-F/PGK-R为引物PCR扩增 PGKp-ATFl-PGKt 片段；
[0039] (b)中 M 为 marker ; 1 为以 pUC-PAK 为模板，BAT2_F/BAT2_R 为引物 PCR 扩增 BAT2 上游同源臂-PGKp-ATFl-PGKt-KanMX-BAT2下游同源臂基因片段；
[0040] 图3为BAT2基因的敲除同时ATFl基因的过表达重组菌株的验证：
[0041] 其中：（a)中M为marker ;1、2、3为以重组菌株1的基因组为模板，4为以出发菌株 基因组为模板，以PB-F和PB-R为引物，PCR扩增验证片段；
[0042] (b)中M为marker ;1为以重组菌株1的基因组为模板，2为以重组菌株2的基因 组为模板，以KanMX-F/KanMX-R为引物，PCR扩增验证片段；
[0043] (c)中M为marker ;1、2为以传代前的重组菌株2的基因组为模板，3为以传代后 的重组菌株2的基因组为模板，以Zeocin-F/Zeocin-R为引物，PCR扩增验证片段；
[0044] 图4为IAHl基因敲除、BAT2基因敲除同时ATFl基因两次过表达的重组菌株的验 证：
[0045] 其中：(a)中M为marker ;1为以重组菌株4的基因组为模板，2为以重组菌株3基 因组为模板，以IP-F/IP-R为引物，PCR扩增验证片段；
[0046] (b)中M为marker ;1为以重组菌株4的基因组为模板，2为以重组菌株3的基因 组为模板，以KI-F/KI-R为引物，PCR扩增验证片段。
【具体实施方式】：
[0047] 下面通过具体的实施方案叙述本发明的一种高产酯低产高级醇酿酒酵母及其选 育方法。下述实施例中所用的技术手段，如无特别说明，均为本领域常规方法。
[0048] 实施例1 :高产酯低产高级醇酿酒酵母的构建
[0049] 本实例所用的出发菌株CICC32315。所述大肠杆菌DH5a购自Takara公司。所述 YB)培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2%进口琼脂粉。
[0050] 根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述引物。
[0051 ] 表1本实施例中所用到的引物
[0052]
[0054] 注：下划线部分为酶切位点。
[0055] 表2本实施例中所用的PCR扩增体系
[0057] (1)重组质粒pUC-PAK的构建
[0058] 重组质粒pUC-PAK的构建流程如图1所示；
[0059] 用限制性内切酶Hindlll，分别对质粒pPGKl和载体质粒pUC19进行酶切，切胶 回收质粒PPGKl的酶切产物强启动子PGK1，连接强启动子PGKl和载体pUC19,构建质粒 pUC-P。
[0060] 以出发酵母菌株基因组为模板，ATFI-F和ATFI-R为引物，PCR扩增ATFl基因，PCR 反应条件：951€51^11;941€4〇8,54°(：11^11，72°(：10〇8,30个循环 ；72°(：1〇1^11。用限制性内 切酶XhoI对质粒pUC-P和ATFl基因片段进行酶切，将两者连接构建质粒pUC-PA。
[0061] 以质粒pUG6为模板，KanMX-F和KanMX-R为引物，PCR扩增KanMX基因，PCR反应 条件：95°C 5min ;94°C 40s，56°C lmin，72°C 100s，30 个循环；72°C lOmin。用限制性内切酶 KpnI对质粒pUC-PA和KanMX基因片段进行酶切，将两者连接构建质粒pUC-PAK。
[0062] PCR验证结果如图2所示，其中：(a)中M为marker ;1为以pUC-PAK为模板，PGK-F/ PGK-R 为引物 PCR 扩增 PGKp-ATFl-PGKt 片段；(b)中 M 为 marker ;1 为以 pUC-PAK 为模板， BAT2-F/BAT2-R 为引物 PCR 扩增 BAT2 上游同源臂-PGKp-ATFl-PGKt-KanMX-BAT2 下游同源 臂基因片段。
[0063] (2) BAT2基因的敲除同时ATFl基因的过表达
[0064] 以质粒pUC-PAK为模板，BAT2-F和BAT2-R为引物，PCR扩增获得BAT2上游同源 臂-PGKp-ATFl-PGKt-KanMX-BAT2 下游同源臂基因，PCR 反应条件：95°C 5min ;94°C 40s， 50。(：1111丨11，721€32〇8,30个循环；72。(：1〇11^11。
[0065] 本实施例通过适当的条件诱导酿酒酵母形成子囊孢子，采用Zymolyase酶酶解子 囊胞壁获得子囊孢子，杀死二倍体细胞后经适当稀释涂布于YEH)平板上，培养后形成的小 菌落即可能为单倍体，进一步验证单倍体并确定其接合型。通过杜氏管测定产酒精能力以 及其它发酵性能的筛选，得到综合性能最优的a型和α型单倍体作为出发菌株。
[0066] 以下步骤的操作以a型单倍体为例，通过醋酸锂转化的方法将步骤（2) PCR产物 导入酿酒酵母出发菌株得到重组菌株1，通过G418抗性筛选重组子进行PCR验证，在PGKl 序列内部设计引物PB-F，BAT2基因下游外部设计引物PB-R，用于验证BAT2基因敲除同时 ATFl基因过表达。以PB-F和PB-R为引物，可扩增出大小为2295bp的片段，而出发菌株则 不能扩增得到该片段，PCR验证结果如图3(a)所示。
[0067] 通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株1中获 得重组菌株2-1 ;挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEH)平 板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在ΥΕΗ)平板上生长而在G418抗性平板上不生长的 菌株，提取基因组进行PCR验证，即以重组菌株2-1的基因组为模板扩增KanMX片段，无法 得到1600bp左右的条带，而重组菌株1则能扩增得到该片段，PCR验证结果如图3(b)所示。 将验证正确的酵母单菌落接到YEro液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代 之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAP质粒的重组菌株2,提取酵母质粒，以Zeocin-F/ Zeocin-R为引物进行PCR验证如图3(c)所示。
[0068] (3) IAHl基因的敲除同时ATFl基因的过表达
[0069] 以质粒pUC-PAK为模板，IAHl-F和IAHl-R为引物，PCR扩增IAHl上游同源 臂-PGKp-ATFl-PGKt-KanMX-IAHl 下游同源臂基因 ，PCR 反应条件：95°C 5min ;94°C 40s， 50。(：1111丨11，721€32〇8,30个循环；72。(：1〇11^11。
[0070] 通过醋酸锂转化的方法将步骤（3) PCR产物导入不含pGAPza质粒的重组菌株2中 得到重组菌株3,通过G418抗性筛选重组子进行PCR验证，在IAHl基因上游外部设计引物 IP-F，PGKl序列内部设计引物IP-R ;在KanMX序列内部设计引物KI-F，IAHl基因下游外部 设计引物KI-R，用于验证IAHl基因敲除同时ATFl基因过表达。以IP-F和IP-R为引物， 可扩增出大小为974bp的片段；以KI-F和KI-R为引物，可扩增出大小为1133bp的片段，且 PCR扩增出的片段与预期的目的产物大小一致，而出发菌株则不能扩增得到该片段，PCR验 证结果如图4所示。
[0071] 通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株3中获 得重组菌株4-1 ;挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEH)平 板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEH)平板上生长而在G418抗性平板上不生长的 菌株，提取基因组进行PCR验证，即以重组菌株4的基因组为模板扩增KanMX片段，无法得 到1600bp左右的条带，而重组菌株3则能扩增得到该片段。将验证正确的酵母单菌落接到 YEH)液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到 不含pGAP质粒的重组菌株4,提取酵母质粒进行PCR验证。
[0072] 将a型单倍体换做α型单倍体，重复上述重组菌构建过程。
[0073] 将获得的a型和α型单倍体重组菌株4分别接种于含有5m