一种梅奇酵母菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物新资源及微生物应用技术领域，特别涉及一种梅奇酵母菌及其 应用。
【背景技术】
[0002] 我国桃园面积超过900万亩，是世界上桃有效种植面积第一大国；年产桃超过40 万吨，是世界上桃产量第一大国。北京桃产量位居国内前8名，仅北京平谷一地，桃种植面 积就达22万亩（1.47万公顷）之多；桃产业已成为平谷县的经济支柱产业，一些桃子及相 关加工产品已经出口到欧盟、日本等国家。2000年以来北京桃褐腐病大面积增加，且逐年加 重；其中2005年发病较重的桃园，桃果受害，大量脱落，采摘时未见显症的果实，在采摘2-3 天后，50%以上的果实因褐腐病侵染而腐烂，给果农造成了严重的经济损失。2012年北京市 植保站桃褐腐病调查结果显示，北京各郊区县桃产区均有桃褐腐病发生，而且桃子在采后 的运输和贮藏期间发病率都在30%以上；这大大降低了果实的食用价值和市场价值，严重 影响了北京桃产业的发展。
[0003] 应用杀菌剂防治采后病害是降低果品损失的重要手段，目前国内应用于果实采后 病害防治的化学药剂主要为SO 2和噻苯咪唑（Thiabendazole)。SO 2的广泛使用常常会带来 环境污染，而且在常距离运输和长期的果实贮藏中，其杀菌效果会随时间而迅速丧失；噻苯 咪唑虽然对果实采后真菌病害有较好的防治效果，但对病原细菌没有效果，而且其使用后 残效期较长，不易降解，会影响高端果品的对外出口；更重要的是，噻苯咪唑的大范围应用 容易使得一些病原菌产生抗药性。生物杀菌剂相对于化学农药而言有天然优势，避免了农 药残留、环境污染、抗药性等问题，而且低毒、环保、持效，自然界生态兼容性较好，是化学 农药试剂应用最有前景的替代手段之一。
[0004] 梅奇酵母菌属酵母菌在自然环境中普遍存在，主要存在于含糖量较为丰富的果实 表面和花上，是植物微生态系统中的优势微生物种群之一。该菌生长速度快，营养简单，生 长力强。在作为生防菌应用方面，它拥有自己独特的优势：1)对环境的污染较少，不产生毒 素；2)不产生抗生素，对人类相对比较安全；3)相对于其他真菌而言，不产生致敏孢子；4) 所需营养比较简单；5)适合商业化大规模生产。因此，它具有很好的应用前景。
[0005] 本发明成功获得了 一株抑制桃采后褐腐病菌及桃采后褐腐病的梅奇酵母菌，经试 验验证，该酵母菌对桃褐腐病菌的抑菌圈直径为IOmm以上，说明所述梅奇酵母菌具有稳 定、高效的抗菌性能。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一新种梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.)。
[0007] 本发明的目的也在于提供一种病原菌抑制剂，其活性成分为上述梅奇酵母菌和/ 或其的代谢物。
[0008] 本发明的目的也在于提供一种病害抑制剂，其活性成分为上述梅奇酵母菌和/或 其的代谢物。
[0009] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.)，菌株号为QHL-12-3,其在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 10463。
[0010] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.) QHL-12-3 的 5. 8S rDNA、ITS1/ITS2 基因序 列，26S rDNA基因序列分别如SEQ ID No. 1和No. 2所示。
[0011] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.) QHL-12-3的26S rDNA基因序列进化树分 析如图1所示。
[0012] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3,从果实表面分离得到。
[0013] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3的形态学特征为：菌体营养细胞 呈球形，卵形或近球形，单边或多边出芽生殖；20°C下，在Yro培养基和PDA培养基上生长 48小时后，菌落为奶油状、乳白色不透明，扁平或圆形，边缘整齐，菌落无褶皱，如图2和图3 所示。
[0014] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. )QHL-12-3的生理生化特征：可进行葡萄 糖、麦芽糖弱发酵，不可进行棉子糖、乳糖、蔗糖、半乳糖和海藻糖发酵；碳源同化方面：葡 萄糖、山梨糖、蔗糖、麦芽糖、蜜二糖、海藻糖、纤维二糖、木糖、核糖、松三糖、乙醇、葡萄糖 醇、丙三醇、甘露醇、核糖醇、水杨酸、氨基葡萄糖、十六烷和可溶性淀粉为阳性，菌粉、乳酸、 甲醇、肌醇、乳糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醇、赤藓糖醇、柠檬酸为阴性。 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.)QHL-12_3在含有5% (质量含量）氯化钠的培养基 中均可正常生长，于含有10% (质量含量）氯化钠的培养基中可生长；于pH 4. 0-5. 5的 培养基中均可正常生长，在环境温度为4°C下生长势弱，在40°C以上不可生长；最佳适宜生 长温度为16_20°C ;在不含维生素的培养基上不能生长。所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.) QHL-12-3产生有机酸，这是生防菌的关键性生防指标。
[0015] 本发明的目的还在于提供上述梅奇酵母菌和/或其代谢物在抑制病原菌、制备病 原菌抑制剂，抑制病害、制备病害抑制剂中的应用。
[0016] 上述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3的应用中，所述病原菌为桃采后 褐腐病菌；所述病害为桃采后褐腐病。
[0017] 其中，所述桃米后褐腐病菌为 Monilinia fructicola、Monilinia Iaxa 或 Monilinia fructigena。
[0018] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3的代谢物可从梅奇酵母菌 (Metschnikowia sp.)QHL-12_3 的发酵液中获得。
[0019] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. )QHL-12_3的代谢物的制备方法为：将保 藏的梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.)从PDA固体斜面接种2环至200ml的YPD液体 培养基中，于20 °C -25 °C，150-200rpm条件下，恒温振荡培养24h-48h，得到梅奇酵母菌 (Metschnikowia sp.) QHL-12-3的发酵液；将培养好的发酵液，分装于50ml的离心管中，在 4°C和5000rpm条件下，离心5-10min，上清液即梅奇酵母菌代谢物；
[0020] PDA固体培养基的主要成分：马铃薯：20%，葡萄糖：2%，琼脂：2%，蒸馏水；
[0021] Yro液体培养基的主要成分为：酵母提取物：1%，葡萄糖：2%，胰蛋白胨：2%，蒸 馏水。
[0022] 本发明的有益效果为：获得的梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3是一株 新的梅奇酵母菌菌株，它对桃采后褐腐病菌和桃采后褐腐病均具有抑制作用。在所选择的 植物病原真菌中，对桃褐腐病菌的抑菌圈直径达到IOmm以上，说明所述梅奇酵母菌具有稳 定、高效的抗菌性能。所述的梅奇酵母菌及其代谢物可以在抑制桃褐腐病菌、制备桃褐腐病 菌制剂；抑制桃褐腐病害，制备桃褐腐病害制剂中应用。
[0023] 生物材料保藏说明
[0024] 分类命名：梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.);菌株编号：QHL-12-3
[0025] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0026] 保藏机构简称：CGMCC
[0027] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0028] 保藏日期：2015年01月30日
[0029] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 10463.
【附图说明】
[0030] 图1.基于26S rDNA基因序列构建的进化树，进化树分析结果表明梅奇酵母菌 QHL-12-3代表的种为一独立分支，梅奇酵母菌QHL-12-3为一新种。
[0031] 图2.梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3在YH)培养基上生长3天后的 显微照片。
[0032] 图3.梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3在PDA培养基上生长3天后的 显微照片。
[0033] 图4.梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3在PDA培养基上对桃褐腐病菌 (Monilinia fructicola)的抑制效果。
[0034] 图5.梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3在桃果实上对桃褐腐病斑的抑 制效果。
[0035] 图6.所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3代谢物对桃果实上桃褐腐 病斑的抑制效果。
【具体实施方式】
[0036] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 下述实施例中所用到的病原菌，公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获 得，以重复本申请实验：
[0039] 桃褐腐病菌--链核盘菌（Monilinia fructicola(wint. )Rehm)(王菲等.桃褐 腐病的发生与防治.果树花卉.2012年第5期p58)。
[0040] 实施例1、梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3的分离与菌株鉴定
[0041] 1、样品米集
[0042] 从中国青海省，采集野果。
[0043] 2、菌株的分离筛选及拮抗筛选
[0044] 从有机水果上分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离，用PDA (含硫酸链霉素）和 Yro琼脂（含硫酸链霉素）2种培养基分别在25°C条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可 纯培养的菌株，在Yro琼脂培养基上纯化保存，并以桃褐腐病菌为靶标病原菌进行拮抗菌 的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的类酵母菌菌株，命名其为QHL-12-3。
[0045] 3、菌株的鉴定
[0046] 对菌株QHL-12-3进行形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析。参考 ((The Yeasts, a Taxonomic Study)) (Kurtzman, C. P. (1998a). ffilliopsis Zender. In The Yeasts, a Tax