专利名称：一株酵母菌及其在脱色中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株酵母菌及其在脱色中的应用，特别是涉及一株热带假丝酵母 (Candida tropicalis)及其在脱除生产、污水等体系中的偶氮染料中的应用。
背景技术：
随着染料合成、印染等工业废水的不断排放，进入环境的染料数量和种类不断增 加，造成的环境污染日益严重。其中，偶氮染料占世界每年染料总产量的70%左右，是工业 染料中用量最大的一类。染料废水具有色度大、有机物浓度高、组分复杂、难降解物质多以 及含有大量无机盐等特点，属于难处理的工业废水。我国作为一个纺织和印染大国，染料废 水的处理问题一直没有得到很好地解决。处理染料废水的常用的方法有物化法和生物法。由于化学法和物理法处理染料废 水的过程中存在着诸如二次污染、处理费用过高、技术要求高、操作不方便等缺点，近年来 发展起来的生化处理即采用微生物法降解染料分子和有机物受到广泛的关注。酵母菌既具有细菌单细胞、生长快、能形成很好的絮体、适应于各种不同的反应 器等特点，又具有真菌细胞大、代谢旺盛，能抵御不良环境等特性，因而可应用于多种难处 理有机废水，例如用于处理啤酒废水、味精废水、食品加工废水、含油废水等。近年来，酵母 菌在染料废水脱色方面的作用也开始得到人们的关注。例如D0nmez报道了一株热带假丝 酵母(Candida tropicalis)对3种活性染料(活性兰、活性黑和活性红)有一定的吸附 脱色作用，吸附容量达到 100mg/g(Enyme and MicrobialTechonolgy, 2002, 30 :363_366)， 中国发明专利ZL 02160202报道了一株产锰依赖过氧化酶的酵母菌Debaryomyces polymorphus，对活性黑5能有效脱色，脱色率达到99%，对其他多种染料也有70-80%的脱 色率。中国发明专利ZL 200510053675报道了一株酵母菌株Pseudozyma rugulosa Y-63 在好氧条件下能对染料有效脱色；而Arora却报道了一株在厌氧条件能对染料脱色的酵母 菌Candida tropicalis，在120内的脱色率为90-92%，该菌的耐受的染料浓度仅为50mg/ L(Colorat ion Technology，2005，121 :298_303)。尽管如此，酵母菌目前在偶氮染料废水处理方面的应用仍非常有限，原因是存在 以下几个主要的缺点1、脱色作用大都是通过菌体对染料的吸附作用实现的，不能将染料进一步降解和 彻底矿化。2、缺乏高效的的降解菌株。大多数单株菌落的广谱性较差，只能作用少数结构简 单的染料分子；并且脱色速率不能满足实际废水的处理要求。3、对环境的适应性不强。大多数菌株的耐盐性或耐碱性不强，在高盐浓度下菌体 的生长能力和脱色降解能力迅速降低。
发明内容
本发明的目的是提供一株能在高盐极端环境下吸附、降解偶氮染料的热带假丝酵母(Candida tropicalis)及其应用。该酵母菌除了对染料有吸附作用外，还可以还原偶氮 键，进一步将染料降解。本发明所提供的热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株，是热带假丝酵母 (Candida tropicalis) YL3-1，该菌株已于2009年11月09日保藏于中国普通微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3432。在固体培养基里，该菌菌落呈乳白色，表面皱褶、稍干燥，菌落大而厚，易挑起，呈 现典型的酵母菌菌落。该菌株的18s rDNA序列如序列表中序列1所示；其26s rDNA序列 如序列表中序列2所示。本发明所提供的应用是所述的脱色酵母菌在对含偶氮染料的体系进行脱色中的 应用；即在脱除生产、污水等体系偶氮染料中的应用，如纺织废水、印染废水及其与染料生 产和使用相关的工业废水的脱色。上述偶氮染料为酸性大红GR和/或酸性黑ATT和/或直接耐晒黑SA和/或直接 紫N和/或活性黑KN-B和/或碱性橙和/或碱性棕和/或直接大红C和/或直接橙S和 /或酸性橙74和/或活性蓝和/或UNISOL SCARLET 3GS (尤纳素猩红3GS)和/或UNISOL RED6GN (尤纳素红6GN)。上述含偶氮染料的体系所述偶氮染料浓度一般可为50-1000mg/L。上述应用中，所述脱色的方法是利用该菌株对染料进行同步培养脱色，即酵母菌 的好氧培养与其对染料的脱色同步进行，即将热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC No. 3432接种于含偶氮染料的体系中，在温度条件为25-40°C，好氧条件下进行培养。所述 温度条件优选为30°C。上述含偶氮染料的体系中还含有NaH2PO4 0. 5_1. 5g/L，K2HPO4 l_3g/L，(NH4)2SO4 0. 5-2g/L, MgSO4 ·7Η20 0. 05-0. 5g/L，葡萄糖 2_15g/L，NaCl l_30g/L ；优选含有 NaH2PO4 lg/ L，K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L。上述热带假丝酵母(Candidatropicalis)CGMCC No. 34322 的培养时间为 12_48h， 既可达到脱色的效果，也可以有一个较大脱色速率。本发明提供的热带假丝酵母菌株Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432用于 纺织废水、印染废水及其与染料生产和使用相关的工业废水的脱色，可利用该菌株对染料 进行同步培养脱色，即酵母菌的好氧培养与其对染料的脱色同步进行。本发明提供的热带假丝酵母菌株Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432，可 在酸性，碱性，高盐等极端的环境下生长并降解偶氮染料，可以在NaCl浓度为10-15% (质 量百分比)的高盐度染料废水中发挥有效的脱色作用，内发挥有效的脱色作用，对酸性，碱 性染料均可降解，在好氧条件下能对多种偶氮染料脱色，特别是对酸性偶氮染料大、直接偶 氮染料、活性偶氮染料的脱色尤其有效。实验证明在12h 内，Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432 对酸性偶氮染料 如酸性大红GR、酸性黑ATT的脱色率可以达到98% ；对直接偶氮染料如直接耐晒黑SA、直 接紫N的脱色率高于96 %，对于活性偶氮染料如活性黑KN-B的脱色率能达到97 %以上；在 24h内，Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432对碱性偶氮染料如碱性橙、碱性棕的脱 色率分别达到97 %和85 %，对于直接大红C和直接橙S的脱色率达到96 %，对酸性橙74和 活性蓝的脱色率分别达到87%和85%。对于结构未发表的进口偶氮染料UNISOL SCARLET
43GS, Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432 在 4h 内脱色率高达 97% 以上，6h 内完全 脱色。本发明的酵母菌株可以对含NaCl浓度为(质量百分比)的高 盐度染料废水发挥有效的脱色作用。实验证明12h，在10%的NaCl浓度下，Candida tropicalisYL3-lCGMCC No. 3432对酸性大红GR的脱色率达到93% ；在15%的NaCl浓度 下，Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432 对酸性大红 GR 的脱色率达到 86%。总之，本发明提供的Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432酵母菌株，具有广 谱的偶氮染料脱色降解能力，能够作用于多种不同结构的偶氮染料，脱色能力强。该菌株 培养方法简单，生长速度快，对环境的适应性强，可以对高盐度的偶氮染料废水进行有效脱 色。该菌株用于印染废水以及与染料使用相关的工业废水的脱色，可解决已有技术中存在 的问题，具有工业化应用前景。
图 1 为热带假丝酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 34322 的筛选过程图 2 为热带假丝酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 34322 在好氧条件下 对不同浓度的酸性大红GR的脱色图 3 为热带假丝酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 在好氧条件下 对不同染料的脱色图 4 为热带假丝酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 对酸性大红 GR 脱色后中间代谢物的GC/MS色谱分析
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1、热带假丝酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 34322 的分离、纯
化及鉴定。本发明提供的热带假丝酵母菌的筛选过程为从印染废水处理厂取得活性污泥样 品，按照图1所述的流程进行筛选，其具体筛选步骤如下从浙江某印染厂废水池中提取污泥，称量Ig用玻璃珠打散后以100ml无菌水搅 勻，取3-4ml的液体接入灭过菌的富集培养基中，30°C、170转培养12h，将富集样品制成 IO-1UO-2UO-^ 10_4、10_5、10_6、ΙΟ"7共7稀释度，每个稀释度吸取0. 2ml涂布于染料培养基平 板上在30°C静置培养24h，挑取有脱色圈的菌落并在染料培养基平板上纯化三次，纯化后 获得单菌株。将挑取的脱色菌株接种于含50mg/L酸性大红GR的液体培养基中在30°C，170 转培养，每隔2h取样测定脱色率，挑取在液体培养基中能完全脱色并且菌体不吸附染料的 菌株并对其进行鉴定。上述的富集培养基成分为酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH6. 0-7. 0。上述染料培养基成分为=NaH2PO4lg/L，K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L， MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L，pH6. 0-7. 0，酸性大红 GR 50mg/L。所述染料固体培养基为染料培养基的成分中加入琼脂。
结果获得一株菌株，将其命名为YL3-1，在固体培养基里，该菌菌落呈乳白色，表面 皱褶、稍干燥，菌落大而厚，易挑起，呈现典型的酵母菌菌落。通过扩增该菌的26srDNA和 18srDNA序列并且在Genbank数据库中比对，结果表明该菌的26srDNA和18srDNA序列与 热带假丝酵母菌的同源性为99%，因此可以认定为该菌为热带假丝酵母。热带假丝酵母 (Candida tropicalis) YL3-1的18s DNA如序列表中序列1所示，其26s DNA如序列表中序 列2所示。热带假丝酵母(Candida tropicalis)YL3-1已于2009年11月9日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中 国科学院微生物研究所)，保藏登记号为=CGMCC No. 3432。实施例2、热带假丝酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 对酸性大红 GR的脱色效果验证将热带假丝酵母(Candidatropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 接种至装有 YPD 培 养基的三角瓶中，在温度设置为30°C，转速为170rpm的摇床上培养12-16h，按5% (ν/ν)的 接种量分别转接到不同酸性大红浓度的GR染料培养基(具体浓度如图2所示)里，在温度 设置为30°C，转速为170rpm的摇床中以好氧方式(好氧方式是在摇瓶里震荡培养)培养 12h。培养结束后，取一定量的培养液加入离心管中，13000rpm离心lOmin，取上清液在 分光光度计上测定在染料最大吸收波长510nm处的OD值，并以不接酵母菌的染料培养基为 对照，计算脱色率。取少量的上清液用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，用旋转蒸发蒸干溶剂 后得到黄色晶体，用Iml甲醇溶解后用于色相色谱-质谱分析(GC/MS)。脱色率(%) = (A1-A2)/A1X100Al-脱色前染料培养基的OD值，A2-脱色后染料培养基的OD值上述YPD培养基组成为酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然。上述酸性大红染料培养基组成为NaH2PO4lg/L, K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L, MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L，酸性大红 GR 50_500mg/L (50mg/L、100mg/L、 150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L、400mg/L、450mg/L 或 500mg/L)。溶剂为水。 未对培养基进行PH值调节。上述培养基均在121°C、0. IMpa下灭菌20min。酸性大红GR的结构式如(式I)所示。
HO 结果如图2所示，实验结果表明，对于酸性大红浓度低于300mg/L的培养液，24h的 脱色率均达到96%以上。GC/MS分析表明结果如图2所示。
实施例3、热带假丝酵母(Candidatropicalis) YL3-1 CGMCC No. 3432对直接耐晒 黑SA和碱性橙的脱色将热带假丝酵母(Candidatropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 接种至装有 YPD 培 养基的三角瓶中，在温度设置为30°C，转速为170rpm的摇床上培养12-16h，按5% (ν/ν)的 接种量分别接种至直接耐晒黑SA染料培养基和碱性橙染料培养基中，在30°C，170rpm条件 下好氧方式培养24h，培养液离心后按照实施例2所述的方法分别在染料的最大吸收波长 处测定OD值并计算相应的脱色率。实验结果表明，该菌株对50mg/L的直接耐晒黑SA的脱色率为97 %，对50mg/L的 碱性橙的脱色率为96%。直接耐晒黑SA 染料培养基组成NaH2PO4 lg/L，K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L, MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，直接耐晒黑SA 50mg/L。溶剂为水。培养基 最终PH值为6.8。碱性橙染料培养基组成=NaH2PO4lg/L, K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L， MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，碱性橙50mg/L。溶剂为水。培养基最终pH 值为7.0。直接耐晒黑SA的结构式如(式II)所示，碱性橙的结构式如(式III)所示。 实施例4、热带假丝酵母(Candida tropicalis) YL3-1CGMCC No. 3432 在高盐环境 下对染料的脱色按照实施例2的方法，将酵母菌株Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432至 装有YPD培养基的三角瓶中，在温度设置为30°C，转速为170rpm的摇床上培养12_16h，按 5% (ν/ν)的接种量分别接种至含NaCl浓度为5%，10%，15% (质量百分比)的高盐酸性 大红GR染料培养基中培养24h，培养液离心后分别测定510nm处的OD值，计算脱色率。高盐酸性大红染料培养基组成NaH2PO4lg/L, K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L, MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L，葡萄糖 10g/L，酸性大红 GR50mg/L，NaCl 浓度为 5%，10%或 15% (质 量百分比)。培养基最终PH值为6. 5。实验结果表明，在含5 %，10 %，15 %的染料培养基中，该菌对酸性大红GR的脱色 率分别达到93%，92%和86%。实施例5、热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC No. 3432对各种染料的脱色
将热带假丝酵母(Candida tropical is) YL3-1CGMCC No. 3432在包括以下成分的 培养基进行脱色NaH2PO4 lg/L，K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L，MgSO4. 7H200. 2g/L，葡萄糖 lOg/L, NaCl 5g/L，染料(染料如图3所示)浓度50mg/L, pH自然，溶剂为水。按照实施例2的方法，将热带假丝酵母(Candida tropicalis) YL3-ICGMCC No. 3432至装有YPD培养基的三角瓶中，在温度设置为30°C，转速为170rpm的摇床上培养 12-16h，按5% (ν/ν)的接种量接种于上述培养基中培养温度为30°C，培养时间为24h，培养 方式为好氧培养。培养液离心后按照实施例2所述的方法分别在染料的最大吸收波长处测 定OD值并计算相应的脱色率。结果如图3 所示，实验证明在 12h 内，Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432 对酸性偶氮染料如酸性大红GR、酸性黑ATT的脱色率可以达到98% ；对直接偶氮染料如直 接耐晒黑SA、直接紫N的脱色率高于96%，对于活性偶氮染料如活性黑KN-B的脱色率能 达到97%以上；在24h内，Candida tropicalis YL3-ICGMCC No. 3432对碱性偶氮染料如 碱性橙、碱性棕的脱色率分别达到97%和85%，对于直接大红C和直接橙S的脱色率达到 96%，对酸性橙74和活性蓝的脱色率分别达到87%和85%。对于结构未发表的进口偶氮 染料 UNISOL SCARLET 3GS, Candida tropicalisYL3-l CGMCC No. 3432 在 4h 内脱色率高达 97%以上，6h内完全脱色。实施例6、热带假丝酵母Candida tropicalis YL3-1对染料的脱色的确是通过生 物降解作用实现的验证试验按照实施例2的方法，取15ml酸性大红GR脱色24h后的上清液用3倍体积的乙酸 乙酯萃取3次，用旋转蒸发蒸干溶剂后得到黄色晶体，用Iml甲醇溶解后用于气相色谱-质 谱分析(GC/MS)，总离子流谱图与相关化合物的质谱图如图4所示。通过标准质谱图的对照发现，脱色后在4. 6min处出现了明显的化合物苯胺的离 子峰。对应染料结构图，苯胺为酸性大红偶氮键被还原的主要中间代谢物。GC/MS的结果表 明了，酸性大红GR确实被Candida tropicalis YL3-1所降解，并且证实了代谢产物之一苯 胺的存在。因此，本发明所述的热带假丝酵母Candida tropicaliSYL3-l对染料的脱色的 确是通过生物降解作用实现的。GC/MS分析条件色谱柱HP-5ms，30mX0. 25mmX0. Iym载气He，流速lml/min进样口温度300°C，离子源温度200°C，柱温60°C保持3min，5°C /min升温至 80°C，300C /min 升温至 300°C，保持 3min。进样量lyL，分流比1 10离子化方式EI(70eV)。序列表<160>2<210>1<211>389<212>DNA<213> 热带假丝酵母(Candida tropicalis)
<400>1
tactgatttgcttaattgcaccacatgtgttttttattgaacaaatttctttggtggcgg60
gagcaatcctaccgccagaggttataactaaaccaaactttttatttacagtcaaacttg120
atttatttacaatagtcaaaactttcaacaacggatctcttggttctcgcatcgatgaag180
aacgcagcgaaatgcgatacgtaatatgaattgcagatattcgtgaatcatcgaatcttt240
gaacgcacattgccctttggtattccaaagggcatgcctgtttgagcgtcatttctccct300
caaacccccgggtttggtgttgagcaatacgctaggtttgtttgaaagaatttaacgtgg360
aaacttattttaagcgactagtttatcca389
<210>2
<211>570
<212>DNA
<213> 热带假丝酵母(Candida tropicalis)
<400>2
tgccttgtgcggcgagtgagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggctctttcagagtc60
cgagttgtaatttgaagaaggtatctttgggtctggctcttgtctatgtttcttggaaca120
gaacgtcagagggtgagaatcccgtgcgatgagatgatccaggcctatgtaaagttcctt180
cgaagagtegagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagct240
aaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaacttt300
gaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagcttgagatcagacttggt360
attttgtatgttacttcttcgggggtggcctctacagtttatcgggccagcatcagtttg420
ggcggtaggagaattgcgttggaatgtggcacggcttcggttgtgtgtaagccttcgtcg480
atactgccagcctagactgaggactgcggtttatacctaggatgttggcataatgatctt540
aagtcgcccgtcttgaaccacggaacccaa570
9
权利要求
一株热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株，其在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.3432。
2.权利要求1所述的热带假丝酵母在对含偶氮染料的体系进行脱色中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述偶氮染料为酸性大红GR和/或酸性 黑ATT和/或直接耐晒黑SA和/或直接紫N和/或活性黑KN-B和/或碱性橙和/或碱性 棕和/或直接大红C和/或直接橙S和/或酸性橙74和/或活性蓝和/或UNISOLSCARLET 3GS 和 / 或 UNISOL RED 6GN。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述含偶氮染料的体系中所述偶 氮染料浓度为1000mg/L以下，优选为50-1000mg/L，最优选为50-500mg/L，特别优选为 50-300mg/Lo
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的应用，其特征在于所述脱色的方法是将权利 要求1所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis) CGMCC No. 3432接种于含偶氮染料的体 系中，在温度条件为25-40°C，好氧条件下进行培养。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述温度条件为30°C。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述含偶氮染料的体系中还含有 NaH2PO4 0. 5-1. 5g/L, K2HPO4 l_3g/L，(NH4)2SO4 0. 5_2g/L，MgSO4 · 7Η200· 05-0. 5g/L,葡萄糖 2-15g/L, NaCl l_30g/L。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述含偶氮染料的体系中优选含有 NaH2PO4 lg/L，K2HPO4 2g/L，(NH4)2SO4 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/ L0
9.根据权利要求5-8中任意一项所述的应用，其特征在于所述热带假丝酵母 (Candida tropicalis)CGMCC No. 3432 的培养时间为 12_48h。
全文摘要
本发明公开了一株酵母菌及其在脱色中的应用。该菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)YL3-1 CGMCC No.3432菌株具有广谱的偶氮染料脱色降解能力，能够作用于多种不同结构的偶氮染料，脱色能力强。该菌株培养方法简单，生长速度快，对环境的适应性强，可以对高盐度的偶氮染料废水进行有效脱色。该菌株用于印染废水以及与染料使用相关的工业废水的脱色，可解决已有技术中存在的问题，具有工业化应用前景。
文档编号C02F3/34GK101906388SQ20101010366
公开日2010年12月8日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者张胜琴, 曹竹安, 杨光, 柳皋隽, 陈必强 申请人:清华大学