专利名称：一株耐高渗酵母菌的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酵母菌领域，特别涉及耐高渗酿酒酵母菌株。
背景技术：
近年来，由于具有一些特殊的功能，极端微生物的研究越来越引起人们重视。其中，耐高渗酵母由于其在能源、食品和医药等多种工业的广泛应用而尤为突出。目前其主要应用包括如下几个方面(1)乙醇乙醇是一种重要的溶剂和燃料，利用高渗酵母可以提高发酵液中底物和产物的浓度，具有降低成本等多种优点；( 甘油当处于高渗环境中时， 大多数种类的酵母细胞在胞内积累甘油以利于调节渗透压的平衡；C3)赤藓糖醇赤藓糖醇是一种适度的甜味增量剂，甜度为蔗糖的60% 70%，具有防止龋齿、适宜糖尿病患者食用的优点。在高渗条件下，利于赤藓糖醇的积累。另外，高渗酵母在生产中可以适度避免污染杂菌，降低生产风险。对于微生物工业来言，如何获得一株优良的菌种非常关键，因此酿酒酵母的分离选育工作至关重要，但要取得优良的菌种却并非易事。尽管现在采用基因工程等技术手段可以添加一个或多个外源基因到细胞内，或者删除某个基因并非难事。但就目前看来，获得一个具有优秀性状的菌株仅靠以上的简单基因操作并不容易，并且删除某个基因或者导入外源基因可能会破坏酵母胞内的代谢平衡，进而影响细胞的正常代谢生长。另外，对于食品工业而言，基因工程菌的使用是可能具有高度安全隐患的，并且在很多地方是被禁止的。因此，传统的诱变育种仍是大多数工业微生物育种最重要、最有效的技术。目前用于微生物诱变育种的方法有物理和化学诱变，其中物理诱变包括紫外线、 激光、X射线、Y射线、快中子等物理方法，化学诱变主要包括各种烷化剂(硫酸二乙酯、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯等)。烷化剂又称烷基化剂，是能将小的烃基转移到其它分子上的高度活泼的一类化学物质。一般引入的烷基连接在氮、氧、碳等原子上。烷化剂常具突变源性，因为它能改变脱氧核糖核酸中的核苷酸。现已知道有几种不同的化学治疗药物属于烷化剂。它们具有一个或两个烷基，分别称单功能或双功能烷化剂，所含烷基能与细胞的DNA、RNA或蛋白质中亲核基团起烷化作用，常可形成交叉联结或引起脱嘌呤，使DNA链断裂，在下一次复制时，又可使碱基配对错码，造成DNA结构和功能的损害，严重时可致细胞死亡。属于细胞周期非特异性药物。常用的烷化剂有烯烃、卤烷、硫酸烷酯等。而这些烷化剂在传统的诱变操作中，由于其具有诱变育种效果好、操作条件简单的优点，被广泛使用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株新的耐高渗酿酒酵母菌株及其在乙醇发酵方面的应用。本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 44 ，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2010年12月 08日。该菌株特点如下在显微镜下观察，该菌株的细胞为卵形，一端芽殖，大小约为1 X 5 μ m ；在固体培养基上，该菌菌落为乳白色，表面光滑，湿润，粘稠，边缘较整齐且中等偏大。与原始菌相比， 该诱变菌株在形态上明显小于出发菌株。出发菌株酿酒酵母CICC31481购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。本发明酵母菌株采用下述流程进行选育原始出发菌种一试管活化一硫酸二乙酯(DEQ诱变一高渗平板筛选一亚硝基胍 (NTG)诱变筛选一高渗平板初筛一摇瓶复筛一传代稳定性试验一7L发酵罐试验本发明先采用DES对出发菌株进行诱变，诱变后通过麦芽汁高渗平板(150g/L KCl)培养基初筛，接着对选育出来的菌株继续进行NTG诱变，通过麦芽汁高渗平板QOOg/ LKC1)培养基初筛，然后采用250mL三角瓶复筛，选育优良的酵母菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性，并用液相色谱、气相色谱仪、气质联用测定发酵液中的代谢物含量，最后采用7L发酵罐进行实验效果的评价。菌株CGMCC No. 4429遗传稳定性结果表明经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把菌株CGMCC No. 4429作为选育得到的目的菌株。将目的菌株CGMCC No. 4429做7L发酵罐实验，结果表明与出发菌株相比， CGMCCNo. 4429初始葡萄糖耐受浓度可以达到300g/L，与原始菌相比提高了 50% ；发酵结束后，残糖为0. 5g/L、甘油含量为lg/L，与原始菌相比提高了 10% ；乙酸含量为0. 8g/L、乳酸含量为0. 4g/L，基本和原始菌相当；乙醇浓度为175g/L，与原始菌相比提高了 108%。有益效果1)本研究采用DES和NTG诱变联用技术选育酿酒酵母菌株，选育得到了优良菌株 CGMCC No. 4429。该突变菌株能够耐受200g/L KC1。葡萄糖耐受能力为300g/L，与原始菌相比提高了 50%。该菌株稳定遗传好，在连续十次传代过程中，性状没有回复，各项性能指标都正常。2)发酵罐实验跟踪的各项性能指标表明，该菌株代谢正常，产乙醇能力强，杂酸含量低，是一株优良的耐高渗酿酒酵母菌株。
具体实施例方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。举例1 具体过程如下1. DES诱变选育1)在超净台上取试管斜面上的酿酒酵母菌CICC31481 —环，接入装有50mL麦芽汁培养基的250mL三角瓶中，200rpm，30°C培养IOh左右，使菌体处于对数生长前期。2)取5mL菌液，5000rpm离心IOmin收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
3)用pH7. 0磷酸缓冲液稀释成IO7个/mL菌悬液。4)取32mL pH7. 0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0. 4mL DES在预先放入转子的 150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为(ν/ν) 05)在 30°C摇床中 150rpm 反应 30min,取 ImL 混合液，加入 0. 5mL 25% Na2S2O3 溶液中止反应。6)稀释涂布于含150g/L KCl的麦芽汁筛选培养基平皿中。在30°C培养2 3天后挑取菌落最大的菌株，标号为D菌。2.亚硝基胍诱变1)在超净台上取试管斜面上的酿酒酵母菌一环，接入装有50mL麦芽汁培养基的 250mL三角瓶中，200rpm，30°C培养IOh左右，使菌体处于对数生长前期。2)取5mL菌液5000rpm离心IOmin收集菌体，用生理盐水洗涤2次。3)用pH6. 0磷酸缓冲液稀释成IO7个/mL菌悬液。4)取IOmL菌悬液转移至IOOmL三角瓶中，加入IOmg的NTG，配制成终浓度为IOmg/ mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。5)在30°C下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心IOmin收集菌体，用无菌生理
盐水洗涤数次，中止反应。6)适当稀释涂，取最后稀释度的菌液0. 2mL，涂布于含200g/L KCl的麦芽汁筛选培养基平皿中。在30°C培养2 3天后挑取菌落60支。3.摇瓶复筛1)在超净台上分别取各试管斜面上的酿酒酵母菌一环，接入装有50mL麦芽汁培养基的250mL三角瓶中，200rpm，30°C培养1 左右，使菌体处于对数生长中期。2)取5mL菌液，接入装有50mL高渗麦芽汁培养基(葡萄糖浓度为300g/L)中的 250mL三角瓶中，200rpm，30°C培养3_4天，每天检测葡萄糖浓度和乙醇浓度变化。发酵结束后，比较60株菌种的葡萄糖和乙醇消耗速率、最终残糖浓度和乙醇浓度、葡萄糖对乙醇的转化率以及杂酸含量。3)选择葡萄糖和乙醇消耗速率快、最终残糖浓度低和乙醇浓度高、葡萄糖对乙醇的转化率高以及杂酸含量少的菌种为最终菌种，命名为DN菌。4.遗传稳定性试验将DN菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。5. 7L发酵罐试验1)取斜面上的酿酒酵母菌一环，接入装有50mL麦芽汁培养基的250mL三角瓶中， 200rpm，30°C培养1 左右，使菌体处于对数生长中期。2)将对数期的菌种接入装有4L发酵液的7L发酵罐中。接种量为10%，3(TC下 lOOrpm，对数前期溶氧控制10% (通气0. 5L/min)，后期厌氧培养3_4天。3)发酵结束后，残糖为0.5g/L、甘油含量为lg/L，与原始菌相比提高了 10%;乙酸含量为0. 8g/L、乳酸含量为0. 4g/L，基本和原始菌相当；乙醇浓度为175g/L，与原始菌相比提高了 108%。
权利要求
1. 一株耐高渗酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCC Νο·4^9在乙醇发酵方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一株耐高渗酵母菌，本发明属于酵母菌领域，特别涉及耐高渗酿酒酵母菌株。本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4429。发酵罐实验跟踪的各项性能指标表明，该菌株代谢正常，产乙醇能力强，杂酸含量低，是一株优良的耐高渗酿酒酵母菌株。
文档编号C12P7/06GK102181373SQ20111010596
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者张健飞, 李政, 王玉 申请人:天津工业大学