一株高产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株高产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用，属于微生物发酵工业技术 领域。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，简称G0D)能够与过氧化氢酶（HPD)组成氧化还 原酶体系。葡萄糖氧化酶在分子氧存在的条件下能氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧 化氢。葡萄糖氧化酶广泛地分布于动物、植物和微生物体内，微生物具有生长繁殖速度快， 来源广泛等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源。另外，葡萄糖氧化酶作为国家允许使 用的饲料酶制剂之一，还是一种新型的酶制剂。葡萄糖氧化酶在氧分子存在下能氧化葡萄 糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。因此，葡萄糖氧化酶通过在肠道中的产酸和耗氧可能起到酸 化剂和益生菌的作用。
[0003] 葡萄糖氧化酶在食品工业、医药、畜禽养殖业及生物领域存在着巨大的应用潜力， 但一直以来我国纯化生产的酶制剂纯度较低，活力较差，葡萄糖氧化酶几乎全部依赖于进 口，生产成本也随之提高。因此，筛选产葡萄糖氧化酶酶活较高的菌株，具有重大的实际应 用价值。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株高产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应 用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0006] -株高产葡萄糖氧化酶的黑曲霉菌株，其为黑曲霉（Aspergillus niger) BLCC6-0009,已于2015年12月04日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中 心（CCTCC)，其保藏编号为 CCTCC Ν0:Μ 2015722。
[0007] 该菌株的形态学特征为：菌丝为白色，产孢后表面黑色，粉末状。分生孢子头的顶 囊呈黑色，球形或近球形，小梗双层，第一层粗大，第二层短小，呈放射状排列，布满整个顶 囊。
[0008] 上述黑曲霉（Aspergillus niger)BLCC6-0009在产葡萄糖氧化酶发酵生产中的应 用也是本发明保护的范围。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种菌剂，其活性成分为上述黑曲霉（Aspergillus niger)BLCC6-0009或其发酵产物。
[0010] 上述黑曲霉（Aspergillus niger)BLCC6-0009和/或菌剂在制备饲料酶制剂中的 应用也是本发明的保护范围。
[0011] 本发明还提供一种葡萄糖氧化酶的生产方法，在发酵培养基中发酵上述黑曲霉 (Aspergillus niger)BLCC6-0009,即得到葡萄糖氧化酶发酵液。
[0012] 所述发酵培养基的组成为：葡萄糖10%、蛋白胨0. 1 %、磷酸二氢钾0. 4%、硝酸钠 0. 4 %、硫酸镁0. 07 %、氯化钾0. 05 %、碳酸钙0. 07 %，均为质量百分比，pH自然。
[0013] 上述方法中，发酵的温度为25-35°C (优选为30°C )，发酵的时间为96-120h。上 述方法中，黑曲霉（Aspergillus niger)BLCC6-0009的接种量为3-5%，优选为4% (体积 分数）。
[0014] 上述方法中，在所述发酵前，还包括如下步骤：
[0015] 将黑曲霉（Aspergillus niger)BLCC6-0009的斜面种子接种在灭菌后的种子培养 基中，在25-35°C (优选为30°C )、180r/min培养2d，得到液体种子液。
[0016] 所述种子培养基的组成为：
[0017] 蔗糖3 %、硝酸钠0. 2 %、磷酸氢二钾0. 1 %、氯化钾0. 05 %、硫酸镁0. 05 %、硫酸亚 铁0.001%，均为质量百分比，pH自然。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] (1)本发明从果园土壤中筛选产葡萄糖氧化酶的菌株，结合物理和化学诱变，获得 产葡萄糖氧化酶性能较高的菌株，该菌株的遗传稳定性较好，通过培养基和发酵条件的优 化进一步提尚菌株酶活。
[0020] (2)本发明的黑曲霉菌株具有葡萄糖氧化酶产量高的优点，发酵液中葡萄糖氧化 酶的产量可达lOU/mL以上；制备的冻干粉中葡萄糖氧化酶的酶活可达150U/g以上。远高 于现有技术中从自然界中筛选得到的黑曲霉菌株的产酶性能（4. 6U/mL)。
【附图说明】
[0021] 图1 :产葡萄糖氧化酶菌株的平板筛选结果；
[0022] 图2a-图2c :菌株BLCC6-0009的培养性状及镜检状态；图2a为菌落图片，图2b 为分生孢子图片，图2c为分生孢子头图片；
[0023] 图3 :菌株BLCC6-0009扩增产物琼脂凝胶电泳图；
[0024] 图4 :系统发育树。
【具体实施方式】
[0025] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0026] 实施例1 :菌株的分离筛选
[0027] 1试验材料
[0028] I. 1培养基
[0029] 平板分离培养基：葡萄糖8%、蛋白胨0.3%、硫酸铵0.04%、磷酸二氢钾0.019%、 硫酸镁0. 016 %、碳酸钙0. 35 %、可溶性淀粉1 %、碘化钾0. 17 %、脱氧胆酸钠0. 02 %、琼脂 粉 1. 5%、醋酸缓冲液 60mmol/L，pH5. 6。
[0030] 斜面培养基：蔗糖3%、硝酸钠0. 2%、磷酸氢二钾0.1 %、氯化钾0. 05%、硫酸镁 0.05%、硫酸亚铁0.001%、琼脂粉1.5%，pH自然。
[0031] 发酵培养基：葡萄糖8%、蛋白胨0.3%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.07%、氯化钾 0· 05 %、硝酸钠0· 4%、碳酸钙0· 35 %，pH自然。
[0032] 上述均为质量百分比。
[0033] I. 2 土样
[0034] 泰安周边及临沂桃园及樱桃树下采用多点混合采集土样。
[0035] 2试验方法
[0036] 2.1样品的采集
[0037] 采用多点混合土样方法从泰安周边、临沂桃园及樱桃树下采取深度为0~IOcm的 土样。
[0038] 2. 2菌株的初筛
[0039] 称取IOg采集来的土样置于已灭菌的装有IOOmL生理盐水且含有玻璃珠的250mL 三角瓶中，振荡处理30min。将土壤上清液混匀后分别取ImL用灭菌生理盐水稀释至10 4、 10 5两个稀释度，分别用灭菌的移液管吸取〇. ImL涂布于预先配制并且灭菌的平板分离培 养基上，在28°C下培养3d后至出现蓝色颜色圈。选取颜色圈中的菌株接种到斜面培养基上 培养。
[0040] 2. 3菌株的复筛
[0041 ]采用 Underbofler 滴定法。
[0042] (1)粗酶液制备：将上述筛选出来的菌株接种于发酵培养基，于30°C恒温摇床培 养5d，摇床转速180r/min。发酵完毕后5000r/min离心10min得粗酶液。
[0043] (2)酶活测定：取250mL三角瓶，加入2%葡萄糖醋酸缓冲溶液25mL及ImL粗酶液， 立即置于30°C水浴振荡1小时，然后加入0· lmol/L NaOH溶液20mL以终止反应，用0· Imol/ L HCl滴定剩余的NaOH，记录所消耗的HCl体积A，空白组在加酶液前加入20mL NaOH溶液 不必振荡，其他操作相同，记录所消耗的HCl体积B。
[0044] 酶活计算式：GOD 酶活=(B-A) XFXNX 1000/60
[0045] F :酶液稀释倍数
[0046] N :盐酸浓度
[0047] 酶活单位表示方法：在上述实验条件下每分钟催化氧化1 μmol/L的葡萄糖的酶 量定义为一个酶活单位，以I ymol/min表示，即lU/mL。
[0048] 2. 4菌株的诱变
[0049] 2. 4. 1孢子悬液的制备
[0050] 将斜面培养基中的孢子用适量的无菌生理盐水洗脱，置于预先灭菌带玻璃珠的三 角瓶中，于摇床上震荡20min后，用灭菌的脱脂棉过滤去菌丝至分散的单孢子悬液，用血球 计数板进行计数，稀释成10 scfu/mL的孢子悬液。
[0051] 2. 4. 2紫外线诱变
[0052] 将孢子悬液均勾地铺于一个已灭菌7cm表面皿中，制Imm左右的薄层。于超净 工作台的紫外灯下，放置在中央位置，用磁力搅拌器搅拌，分别照射不同时间，稀释梯度为 10 1~106。分别取104~10 63个稀释度的孢子悬液0.21^，涂布于平板培养基上，30°(：避 光培养2~3d。挑取平板上的单菌落接种到斜面培养基，培养至孢子产生，再通过液体培养 基测定每个斜面的菌株的葡萄糖氧化酶的酶