一种重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域中一种重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C. 1. 1. 3. 4)是一种同型二聚体糖蛋白，由两 个相同的多肽链通过二硫键共价结合组成，同时含有两个非共价结合的黄素腺嘌呤二核苷 酸（FAD)辅因子，该酶以分子氧作为电子受体，可以氧化0-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧 化氢。
[0003] 葡萄糖氧化酶由于底物专一性强、催化效率高、无毒副作用，在医疗诊断、食品加 工、饲料及纺织工业中均有广泛的应用价值。葡萄糖氧化酶能够特异性识别葡萄糖，因此被 广泛应用于临床中葡萄糖含量的检测，如尿糖的检测、血糖的测定，可以有效监测糖尿病人 的尿糖、血糖含量。同时，葡萄糖氧化酶作为一种天然的食品添加剂，可以去除葡萄糖、脱除 氧气，而且催化反应生成的葡萄糖酸对人体无害，生成的过氧化氢能够起到有效的杀菌抑 菌作用，防止变质，延长食品保质期。
[0004] 葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物及微生物体内，但是动植物体内的葡萄糖氧化酶 含量低而且提取纯化工艺复杂；目前葡萄糖氧化酶主要来源于微生物体内，如黑曲霉及青 霉，但是仍然存在产量低和提取纯化难度大的问题。葡萄糖氧化酶在其它微生物表达宿主 中的表达水平也普遍不高（表1)，虽然在巴斯德毕赤酵母及酿酒酵母中的表达量较高，但 是发酵过程中均需要转接而且需要用大量的甲醇进行诱导，程序繁琐，成本高，更为重要的 是巴斯德毕赤酵母不是美国食品药品监督管理局（FDA)认证的安全的微生物（GRAS微生 物），生物安全性存在隐患，不适合应用于食品和医疗领域中。因此，开发产量高、安全性高、 发酵提纯工艺简单、成本低的新的表达系统是十分必要的。
[0005] 表1、产葡萄糖氧化酶的菌株及其表达量
【主权项】
1. 核酸分子，是Agod基因或RNA分子， 所述Agod基因为如下a) -f)中任一所述的DNA分子或cDNA分子： a) 其编码序列是SEQIDNo. 1的第4682-6520位的DNA分子或cDNA分子； b) 其编码序列是SEQIDNo. 1的第4733-6520位的DNA分子或cDNA分子； c) 其编码序列是SEQIDNo. 2的DNA分子或cDNA分子； d) 其编码序列是SEQIDNo. 2的第52-1821位的DNA分子或cDNA分子； e) 与a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且与a)或 b)或c)或d)限定的核苷酸序列具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子； f) 在严格条件下与a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列杂交，且与a)或b)或c)或 d)具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子； 所述RNA分子为如下g)-j)中任一所述的RNA分子： g) 其编码序列是将SEQIDNo. 1的第4682-6520位中的T均替换为U，其它核苷酸不 变得到的RNA分子； h) 其编码序列是将SEQIDNo. 1的第4733-6520位中的T均替换为U，其它核苷酸不 变得到的RNA分子； i) 其编码序列是将SEQIDNo. 2中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子； j) 其编码序列是将SEQIDNo. 2的第52-1821位中的T均替换为U，其它核苷酸不变 得到的RNA分子。
2. 与权利要求1所述核酸分子相关的遗传材料，为下述B1)至B5)中至少一种： B1)含有权利要求1所述核酸分子的表达盒； B2)含有权利要求1所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体； B3)含有权利要求1所述核酸分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生 物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物； B4)含有权利要求1所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基 因植物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系； B5)含有权利要求1所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基 因动物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因动物细胞系。
3. 重组细胞的构建方法，包括对受体细胞中导入权利要求1所述Agod基因，得到产葡 萄糖氧化酶的重组细胞。
4. 根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述受体细胞为微生物细胞、非人动 物细胞或植物细胞。
5. 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述微生物为真菌、细菌、酵母或藻。
6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述真菌为木霉属真菌。
7. 根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述木霉属真菌为里氏木霉。
8. 按照权利要求3-7中任一所述方法构建的重组细胞。
9. 制备葡萄糖氧化酶的方法，包括培养权利要求3-8中任一所述重组细胞，得到葡萄 糖氧化酶。
10. 下述1)或2)或3)所述的应用： 1)权利要求1所述核酸分子在制备葡萄糖氧化酶中的应用； 2) 权利要求2所述遗传材料在制备葡萄糖氧化酶中的应用； 3) 权利要求8所述重组细胞在制备葡萄糖氧化酶中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的制备方法及其应用。将本发明的Agod基因导入里氏木霉Tu6△tku70中构建的重组里氏木霉Tu6△tku70::Agod能够成功地表达重组黑曲霉葡萄糖氧化酶，而且表达量较高，发酵液中的酶活力可达到137U/mL，是目前产葡萄糖氧化酶菌株中摇瓶发酵酶活力的最高水平。将发酵液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶通过镍柱纯化后测定的酶活力可达到342U/mL，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的比活力为155U/mg蛋白。采用本发明的方法制备的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶具有很好的热稳定性和较好的酸碱耐受性，发酵工艺简单，不需转接，原料廉价易得，成本大大降低，可广泛应用于食品医疗领域中。
【IPC分类】C12N15-80, C12N1-15, C12N9-04, C12R1-885, C12N15-53
【公开号】CN104711273
【申请号】CN201510115372
【发明人】董志扬, 马枝枝, 陈秀珍, 林洁, 黄振邦, 秦丽娜
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月17日