髓过氧化物酶测定试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种髓过氧化物酶测定试剂盒。
【背景技术】
[0002] 血清髓过氧化物酶（myeloperoxidase，ΜΡ0)是较具有代表性的血清炎症标记物。
[0003] 目前在临床上使用的MPO检测方法有：放射免疫法（IRA)，此法直接可以测血浆， 但该法有环境污染以及对操作者有一定有放射性辐射；化学发光法，该法较放射免疫法较 为敏感，准确，但成本相对昂贵，需要配套的仪器才可以使用；酶免疫法（ELISA)，存在操作 繁琐，标本需要预处理，检测时间长等缺点。而胶乳增强免疫比浊法具有操作简便，快速，检 测灵敏度高、特异、定量准确等优点，在临床应用能得到广泛认可。
[0004] 现有胶乳免疫比浊试剂，由于其检测原理是测定反应形成的免疫复合物的浊度， 因此极易受到乳糜干扰的影响。目前应对这个问题的方法，主要是使用专门的乳糜消除剂 对样本进行预处理。而在大规模的人群普查、健康体检筛查和临床病人检验时，经常会遇到 大量的乳糜、溶血等浑浊样本，此时通过购置样本处理剂，对这些样本进行单独处理，将会 极大地增加操作人员的工作量，提高运营成本，也为临床检验的组织安排带来难题。
[0005] 因此，研制一种能够消除乳糜干扰的胶乳免疫比浊法的髓过氧化物酶测定试剂盒 显得十分必要。
[0006] 中国专利文献CN102680676A公开了一种用比浊法测定的髓过氧化物酶测定试剂 盒，具有操作简便，快速，检测灵敏度高、特异、定量准确等优点，但是仍存在乳糜干扰的问 题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是建立一种检测方法，通过抗乳糜试剂R3的加入，使得乳糜干扰大 为降低。
[0008] 本发明的技术方案是： 髓过氧化物酶测定试剂盒，包含试剂Rl，R2以及校准液；所述试剂Rl为pH值7. 0-8. 0 的缓冲液，所述试剂R2为抗人MPO抗体胶乳试剂；所述校准液为含有定量的MPO的重组蛋 白或者是从人血清中提取出来的天然ΜΡ0,其特征在于，所述试剂盒还包括用于消除乳糜 的试剂R3,所述试剂R3包含辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二 醇-硫酸菊聚糖镁。
[0009] 优化地，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100-200。
[0010] 优化地，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100-200 乙酸丁酸纤维素20-80。
[0011] 优化地，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100-200 羟甲基纤维素钠20-100 乙酸丁酸纤维素20-80。
[0012] 发明人在研究中得出，在特定比例的辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙 二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁的混合分散系中，乳糜会发生沉降，同时不影响正常的 胶乳比浊法。
[0013] 实践中发现，添加适当比例的羟甲基纤维素钠或乙酸丁酸纤维素，会使沉淀后的 乳糜更为稳定。
【具体实施方式】
[0014] 下面以具体的实施例对本发明做进一步说明。
[0015] 实施例1 一种采用胶乳增强免疫比浊法检测MPO含量的试剂盒，包含试剂Rl，R2以及校准品； 所述试剂Rl : PH值为6. 5-8. 0的缓冲液，所述试剂R2为抗人MPO抗体胶乳试剂；所述标 准品为含有定量的MPO的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然ΜΡ0,所述的MPO检 测试剂盒中的Rl试剂主要包含缓冲液，无机盐，加速剂和防腐剂，所述的MPO检测试剂盒 中R2试剂主要包含稳定剂，抗人单（多）克隆抗体胶乳颗粒，缓冲液，稳定剂和防腐剂。其 中乳胶微球直径为60-150nm。试剂Rl所述的无机盐选自氯化钠，氯化镁，氯化钾一种或几 种。缓冲液为：磷酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。加速剂为聚乙二 醇4000,聚乙二醇6000,聚乙二醇8000。试剂R2所选用的抗体为鼠抗人MPO单克隆抗体， 羊抗人MPO单克隆抗体，兔抗人MPO单克隆抗体一种或者几种混合。也可以选鼠抗人MPO 多克隆抗体，羊抗人MPO多克隆抗体，兔抗人MPO多克隆抗体其中一种。试剂R2中的稳定 剂选自小牛白蛋白，甘氨酸，明胶，吐温20,曲拉通一种或者几种。试剂R2为抗人MPO抗体 胶乳试剂，采用的是抗人的MPO抗体与胶乳颗粒相偶联。经过离心（过滤）的方法去掉未 反应的偶联剂以及未反应的抗体，在含有稳定剂和防腐剂的缓冲液中分散而成。所述抗人 MPO抗体的胶乳试剂的制备包括以下步骤。
[0016] 步骤1 :将胶乳在PH6. 5的溶液中活化。
[0017] 步骤2 :洗涤去掉溶液中的碳化二亚胺，加 PH7. 5-9. 0的缓冲液，加入MPO抗体，在 37度反应4小时。
[0018] 步骤3 :将步骤2所得的液体用PH7. 5-9. 0的固定液固定6小时。
[0019] 步骤4 :将步骤3所得的液体用PH7. 5-9. 0的封闭液体封闭12小时。
[0020] 步骤5 :将步骤4所得的液体洗涤去掉未结合抗体，溶液用含有稳定剂和防腐剂的 缓冲液洗涤分散即得。
[0021 ] 步骤1中所用的缓冲液为PBS缓冲液，MES缓冲液，碳酸盐缓冲液中的任何一种缓 冲液，且浓度在20-100mmol/L，PH在5. 5-6. 5之间。
[0022] 步骤1中所用的胶乳可以是羧基化的聚苯乙烯胶乳或者是氨基化的聚苯乙烯胶 乳。其孔径在60nm-150nm均可。
[0023] 步骤1中含有1-(3-二甲基氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙 基）-3-乙基碳二亚胺盐或N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或者多种。
[0024] 在步骤2中，去掉溶液1中所含的未反应的物质，采用的是高速冷冻离心机或者超 微孔径的过滤膜进行过滤。
[0025] 在步骤5中，所用的稳定剂是小牛血清白蛋白，明胶，甘氨酸，脱脂奶粉一种或者 几种相混合。
[0026] 所述试剂盒还包括用于消除乳糜的试剂R3,所述试剂R3包含辛基甲氧基肉桂酸 酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁。
[0027] 优化地，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯20 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100。
[0028] 对添加了不同乳糜单位浓度的血清样本进行对照测定，重复3遍，计算均偏差。偏 差范围在±10%以内视为无干扰，偏差范围超过±10%视为干扰。
[0029] 表1未添加 R3试剂的的血清样本结果
表2添加 R3试剂的的血清样本结果
实施例2 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁200。
[0030] 实施例3 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯30 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚40 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁120。
[0031] 实施例4 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯40 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚90 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁。
[0032] 实施例5 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯20 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100 乙酸丁酸纤维素20。
[0033] 实施例6 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁200 乙酸丁酸纤维素80。
[0034] 实施例7 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯30 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚40 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁130 乙酸丁酸纤维素30。
[0035] 实施例8 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯40 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚80 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁170 乙酸丁酸纤维素70。
[0036] 实施例8 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯20 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100 羟甲基纤维素钠20 乙酸丁酸纤维素20。
[0037] 实施例9 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁200 羟甲基纤维素钠100 乙酸丁酸纤维素80。
[0038] 实施例10 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯25 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚35 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁110 羟甲基纤维素钠25 乙酸丁酸纤维素30。
[0039] 实施例11 与实施例1不同的是，所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯45 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚90 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁180 羟甲基纤维素钠80 乙酸丁酸纤维素60。
【主权项】
1. 髓过氧化物酶测定试剂盒，包含试剂Rl，R2以及校准液；所述试剂Rl为pH值 7. 0-8. O的缓冲液，所述试剂R2为抗人MPO抗体胶乳试剂；所述校准液为含有定量的MPO的 重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然MP0,其特征在于，所述试剂盒还包括用于消除 乳糜的试剂R3,所述试剂R3包含辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙 二醇-硫酸菊聚糖镁。2. 根据权利1要求所述的试剂盒，其特征在于所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100-200。3. 根据权利1要求所述的试剂盒，其特征在于所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100-200 乙酸丁酸纤维素20-80。4. 根据权利1要求所述的试剂盒，其特征在于所述试剂R3组分的重量份组成为： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁100-200 羟甲基纤维素钠20-100 乙酸丁酸纤维素20-80。
【专利摘要】髓过氧化物酶测定试剂盒，包含试剂R1，R2以及校准液；所述试剂R1为pH值7.0-8.0的缓冲液，所述试剂R2为抗人MPO抗体胶乳试剂；所述校准液为含有定量的MPO的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然MPO，其特征在于，所述试剂盒还包括用于消除乳糜的试剂R3，所述试剂R3包含辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖镁。本发明通过抗乳糜试剂R3的加入，使得乳糜干扰大为降低。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105158473
【申请号】CN201510588749
【发明人】梁朝阳
【申请人】浙江凯成生物科技有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月16日