专利名称：酶法检测脂肪酶试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物试剂，具体涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种酶法检测脂肪酶试剂盒及其制备方法。
背景技术：
脂肪酶(Lipase EC3.1.1.3.，LPS，甘油酯水解酶)是一类水解油酯的酶类。月旨肪酶的水解底物一般是天然油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键。它不同于其它水解酶，脂肪酶催化作用系统是一种非均相体系，水溶性的酶催化作用发生在水不溶性底物和水的界面上，这种界面上的催化作用机制不甚清楚，不能简单用MichaelidMenten学说解释酶与底物间的反应机制。有人提出了脂肪酶在油-水界面上定位的假设，提出了“超底物”的模型，该模型能解释脂肪酶的一些行为，但还需要进一步的实验证明和修正。此外，脂肪酶兼具有逆向催化甘油和游离脂肪酸合成甘油脂活性。脂肪酶在临床的意义:正常人血液LPS含量极少，但在急性胰腺炎时，2 12h血液LPS显著升高，24h至峰值，可达正常值上限的10倍，甚至50倍，至48 72h可能恢复正常，但随后又可持续升高8 15天。由于血液LPS在急性胰腺炎时活性升高的时间早，上升的幅度的大，持续的时间长，故其诊断价值优于淀粉酶。临床观察发现，凡血液AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者AMY不一定升高，约有2/3AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；非胰腺炎的急腹症有血液AMY升高而LPS不升高。酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝胆疾患等血液LPS可有不同程度的升高。迄今测定LPS的方法可分为3类:①测定产物(游离脂肪酸)的增加(如滴定法、比色法、分光光度法、荧光法和PH电极法等)；②测定底物的减少量(如比浊法、扩散法等)；③测定LPS的实际质量(双抗体夹心免疫分析法、乳胶凝集法)。目前在国内大多实验室主要以滴定法、比浊法和分光光度法为主。分光光度法目前有两类比较常用:①酶偶联显色比色法，多用1，2_甘油二酯为底物，在LPS和单酸甘油酯脂肪酶的催化下，水解生成甘油和脂肪酸，甘油通过甘油激酶作用生成3-磷酸甘油，再通过甘油磷酸氧化酶/过氧化物酶体系和4-AAP色素原体系产生紫红色。于550nm波长连续监测吸光度的变化即可计算LPS 活性。此类方法特异性高，通过双试剂也基本可解决内源性甘油的干扰问题。②l，2-o-二月桂-外消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基试卤灵)酯设计的连续监测法。该底物在碱性环境中，在LPS和辅脂肪酶作用下，水解生成1，2-0_ 二月桂基甘油和戊二酸-6’-甲基试卤灵。后者不稳定，可自发分解生成戊二酸和甲基试卤灵。甲基试卤灵在581nm波长处有吸收峰，连续监测其吸光度变化可定量测定LPS活性。此法具有简便、快速、灵敏、稳定和抗干扰能力强等特点。但是酶偶联显色法，工具酶的价格昂贵，而且酶来源少且不稳定，很少有厂家用这种方法。底物水解法，底物极不稳定，试剂的本底升高的极快，造成试剂要每天定标。浪费试剂也浪费校准品。而且会造成结果的不准确。因此亟待寻求更好的检测方法
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计稳定脂肪酶的人工合成底物，提高试剂稳定性，用于检测脂肪酶的试剂。本发明提供了一种酶法检测脂肪酶试剂盒，该试剂盒由下列试剂I和试剂2，按I份:I份的比例组成:试剂1: (2L)(试剂体积)
缓冲液10—20 O mmol /L
脱氧胆酸钠0.01-20 ml/L
辅脂肪酶0.l-2mg/L
氯化 |丐5-20mmol/L
叠氮钠0.5-2g/L
去离子水加至2L；试剂2: (IL)(试剂体积)
酒石酸10-200 mmol/L 牛黄脱氧胆酸钠 0.l-10mmol/L 甘露醇10-200 mmol/L proclin300 (生物防腐剂) 0.01-0.5ml/L
疏基乙酸10-200 mmol/L
6-甲基试卤灵0.1-0.5 mmol/L去离子水加至总体积为1L。所述试剂I缓冲液选自TRIS (三轻甲基氨基甲烧tris (hydroxymethyl)aminomethane)、MOPS (3- (N-吗啉)丙横酸 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid)、BICINE (N, N-双(2-羟乙基甘氨酸)或HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)。本发明检测脂肪酶试剂盒，在使用时，试剂I加检测样本后再加入试剂2，即可进行检测。本发明的另一目的是提供了脂肪酶试剂盒的制备方法:该方法包括下列步骤:(一)制备试剂I: (2L)(试剂体积)(I)先向容器内加入为总量80%的去离子水；(2)依次加入缓冲液、脱氧胆酸钠、氯化钙、叠氮钠；(3)加入辅脂肪酶；(4)最后加入剩余量的去离子水至总体积为2L混合均匀，即得；( 二 )制备试剂2: (IL)(试剂体积)
向容器内依次加入牛黄脱氧胆酸钠、甘露醇、proclin300(生物防腐剂)、巯基乙酸、6-甲基试卤灵，去离子水加至总体积为IL混合均匀，即得。本发明人经过研究试验，在试剂盒中加入了底物保护剂甘露醇和巯基乙酸，其中巯基乙酸作为底物保护剂未见文献报道，虽然，甘露醇有去除自由基作用，但是必须与巯基乙酸一起应用才能达到保护剂作用；另一方面，如果甘露醇不加，巯基乙酸自身就很容易氧化和水解。本发明加入了底物保护剂甘露醇和巯基乙酸后，确保了试剂的稳定性。本发明的试剂盒检测效果好，对试剂中的人工合成的底物有很强的保护作用，随着时间的推移，对底物的保护作用会更明显，有较大的临床应用价值。
具体实施例方式以下实施例所用试剂原料均通过市售得到。
TRIS百灵威
脱氧胆酸钠百灵威 辅脂肪酶罗氏
氯化钙国药试剂集团
叠氮钠国药试剂集团
酒石酸国药试剂集团
牛黄脱氧胆酸钠百灵威
甘露醇国药试剂集团
proclin300 (生物防腐剂) 国药试剂集团疏基乙酸
6-甲基试齒灵 5g罗氏实施例1制备脂肪酶检测试剂盒组成:试剂1: (2L)(试剂体积)
TRIS缓冲液36.5g
脱氧胆酸钠1.66g
辅脂肪酶1.8mg
氯化钙2.66g
叠氮钠Ig去离子水加至总体积为2L；试剂2: (IL)(试剂体积)
酒石酸2.2g
牛黄脱氧胆酸钠5.2g
甘露醇18.2g
proclin300(生物防腐剂) 0.05ml
巯基乙酸0.92g
6-甲基试卤灵0.02g去离子水加至总体积为1L。制备:(一 )制备试剂 1: (2L)(I)先向容器内加入1.6L的去离子水；(2)依次加入TRIS缓冲液、脱氧胆酸钠、氯化钙、叠氮钠；
(3)加入酶:辅脂肪酶(4)最后加入去离子水至总体积为2L混合均匀，即得；( 二 )制备试剂 2: (IL)向容器内依次加入酒石酸、牛黄脱氧胆酸、甘露醇proclin300 (生物防腐剂)、巯基乙酸、6-甲基试卤灵、去离子水加至总体积为2L，混合均匀。实施例2试剂1: (2L)
mops缓冲液25.3g
脱氧胆酸钠1.82g
辅脂肪酶2.2mg
氯化钙1.44g
叠氮钠1.2g去离子水加至总体积为2L。试剂2: (IL)酒石酸1.8g
牛黄脱氧胆酸钠5.27g
甘露醇14.2g
proclin300 (生物防腐剂)0.03ml
巯基乙酸1.47g
6-甲基试卤灵0.022g去离子水加至总体积为1L。实施例3试剂1: (2L)
bicine缓冲液20.8g
脱氧胆酸钠1.58g
辅脂肪酶1.5mg
氯化钙2.8g
叠氮钠Ig去离子水加至总体积为2L。试剂2: (IL)
酒石酸1.95g
牛黄脱氧胆酸钠3.13g
甘露醇18.2g
proclin300 (生物防腐剂)0.05ml
巯基乙酸0.92g
6-甲基试卤灵0.02g去离子水加至总体积为1L。制备方法同实施例1实施例4本发明实施例1的试剂盒检测效果试验:测定方法:步骤一:输入参数于自动生化分析仪:温度37°C，主波长583nm，副波长800nm，Rl 300ul (实施例1试剂I).R2150ul (实施例1试剂2).
对照试剂:瑞士罗氏脂肪酶试剂盒(试剂1300ul ;试剂2150ul，其中未加入甘露醇、巯基乙酸)生产商(瑞士罗氏公司)；检测样本4ul (血清样本)
读数点:16-24步骤二:测定前将Rl与R2平衡至室温.，然后放入试剂仓内步骤三输入定标因子:2218在使用时，试剂I加检测样本后再加入试剂2，即可进行检测。(I)实施例1试剂加甘露醇、巯基乙酸作为保护剂与样本试剂对检测反应的影响
权利要求
1.一种酶法检测脂肪酶试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由下列试剂I和试剂2按I份:I份的比例组成: 试剂1:2L缓冲液10—20 O mmol /L脱氧胆酸钠0.01-20 ml/L辅脂肪酶0.l-2mg/L氯化齊5-20mmol/L 叠氮钠0.5-2g/L 去离子水加至总体积为2L试剂2:1L酒石酸10-200 mmol/L牛黄脱氧胆酸钠0.l-10mmol/L甘露醇10-200 mmol/L proclin300 (生物防腐剂)0.01-0.5ml/L疏基乙酸10-200 mmol/L 6-甲基试卤灵0.1-0.5 mmol/L 去离子水加至总体积为IL。
2.根据权利要求1所述酶法检测脂肪酶试剂盒，其特征在于，所述试剂I的缓冲液选自TRIS、MOPS 或 HEPES。
3.—种如权利要求1所述酶法检测脂肪酶试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒由下列试剂I和试剂2按I份:I份的比例组成: 试剂1:2L缓冲液10—20 O mmol/L脱氧胆酸钠0.01-20 ml/L辅脂肪酶0.l-2mg/L 氯化齊5-20mmol/L叠氮钠0.5-2g/L 去离子水加至总体积为2L 试剂2:1L酒石酸10-200 mmol/L 牛黄脱氧胆酸钠0.l-10mmol/L甘露醇10-200 mmol/L proclin3000.01-0.5ml/L 疏基乙酸10-200 mmol/L 6-甲基试卤灵0.1-0.5 mmol/L 去离子水加至总体积为IL 所述制备方法包括下列步骤: (一)制备试剂1:2L (1)先向容器内加入为总量80%的去离子水； (2)依次加入缓冲液、脱氧胆酸钠、氯化钙、叠氮钠； (3)加入辅脂肪酶； (4)最后加入去离子水至总体积为2L，混合均匀，即得； (二)制备试剂2:1L 向容器内依次加入牛黄脱氧胆酸钠、甘露醇、proclin300、巯基乙酸、6-甲基试卤灵,去离子水加至总体积为1L， 混合均匀，即得。
全文摘要
本发明公开了一种酶法检测脂肪酶试剂盒。本发明试剂盒由试剂1和试剂2组成。试剂12L缓冲液10-200mmol/L、脱氧胆酸钠0.01-20ml/L、辅脂肪酶0.1-2mg/L、氯化钙5-20mmol/L和叠氮钠0.5-2g/L，去离子水加至总体积为2L。试剂21L酒石酸10-200mmol/L、牛黄脱氧胆酸钠0.1-10mmol/L、甘露醇10-200mmol/L、proclin3000.01-0.5ml/L、巯基乙酸10-200mmol/L、6-甲基试卤灵0.1-0.5mmol/L，去离子水加至总体积为1L。本发明的试剂盒，对底物有很强的保护作用，提高了试剂的稳定性。本发明的试剂盒检测效果好，有较大的临床应用价值。
文档编号C12Q1/44GK103173518SQ20111043079
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者景晟, 孙卫兵 申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司, 上海复星长征医学科学有限公司