基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 鲤春病毒血症（SVC)、病毒性出血性败血症（VHS)、传染性造血器官坏死病（IHN) 是同被列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》的二类传染病，SVC、 VHS和IHN分别是《中华人民共和国动物防疫法》规定的二类和三类疫病，这三种疫病都是 国际兽疫局0IE名录中的重要疫病。
[0003]VHS困扰欧洲虹鳟鱼达50多年，被认为是欧洲虹鳟鱼养殖业经济损失的头号杀 手，VHS逐渐在其他品种中也有报道。这3种疫病均是由RNA病毒引起的急性高度传染性疾 病，可侵害多种海水和淡水养殖鱼类，在欧、美、日、韩及部分亚洲国家流行，可通过鱼体及 所产卵、精液、尿、粪便以及污染的饲料、水等传播，对养殖场造成致命打击，危害非常严重。
[0004] 鲤春病毒血症病毒（SVCV)引起包括鲤鱼在内的很多水生动物的急性高度传染性 疾病；传染性造血器官坏死病毒（IHNV)引起鲑科多种鱼的致死性疾病，通过污染的水、饲 料和粪便等传播，幼鱼和鱼苗死亡率可达100%，成鱼感染可终身带毒并散毒；病毒性出血 性败血症病毒（VHSV)可引起各种年龄的鲑科多种鱼发病，死亡率达80-100%，特别是幼鱼 和鱼苗。
[0005] 目前传统的病毒分离及血清学诊断方法操作繁琐，无法实现对不同亚型病毒的同 步检测，RT-PCR方法也无法达到对病毒进行快速、准确、高通量检测分型的目的，因而目前 急需一种能够对SVCV、VHSV和IHNV进行高通量快速排查的集成化诊断技术。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何鉴定病毒性出血性败血症病毒。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列 的物质在制备基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
[0008] 本发明所提供的检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质在制备基于焦磷 酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试剂或试剂盒中的应用中，所述病毒性出血性败血 症病毒指纹序列为序列表中SEQIDNo. 5的第451-467位核苷酸。
[0009] 上述应用中，所述检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质可包括病毒性出 血性败血症病毒指纹序列的测序引物和/或扩增病毒性出血性败血症病毒指纹序列的引 物对。
[0010] 上述应用中，所述测序引物可为名称为VHSV-S的序列表中SEQIDNo. 8所示的单 链DNA;所述扩增病毒性出血性败血症病毒指纹序列的引物对可为名称为VHSV-P的由序列 表中SEQIDNo. 6所示的单链DNA和SEQIDNo. 7所示的单链DNA组成的引物对。
[0011] 上述应用中，所述SEQIDNo. 6所示的单链DNA和/或SEQIDNo. 7所示的单链 DNA可用生物素标记。
[0012] 在本发明的一个实施例中，SEQIDNo. 7所示的单链DNA的5'端有生物素标记。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明还提供了基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病 毒检测试剂或试剂盒。
[0014] 本发明所提供的基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试剂或试剂盒， 包括检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质；所述病毒性出血性败血症病毒指纹序 列为序列表中SEQIDNo. 5的第451-467位核苷酸。
[0015] 上述试剂或试剂盒中，所述检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质可包括 病毒性出血性败血症病毒指纹序列的测序引物和/或扩增病毒性出血性败血症病毒指纹 序列的引物对。
[0016] 上述试剂或试剂盒中，所述测序引物可为名称为VHSV-S的序列表中SEQIDNo. 8 所示的单链DNA;所述扩增病毒性出血性败血症病毒指纹序列的引物对可为名称为VHSV-P 的由序列表中SEQIDNo. 6所示的单链DNA和SEQIDNo. 7所示的单链DNA组成的引物对。
[0017] 上述试剂或试剂盒中，所述SEQIDNo. 6所示的单链DNA或SEQIDNo. 7所示的 单链DNA可用生物素标记。
[0018] 在本发明的一个实施例中，SEQIDNo. 7所示的单链DNA的5'端有生物素标记。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明还提供了基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病 毒检测试剂或试剂盒的制备方法。
[0020] 本发明所提供的基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试剂或试剂盒 的制备方法中，所述基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试剂或试剂盒为上文 所述基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试剂或试剂盒；所述基于焦磷酸测序 的病毒性出血性败血症病毒检测试剂或试剂盒的制备方法，包括将所述测序引物和/或所 述扩增病毒性出血性败血症病毒指纹序列的引物对的两条单链DNA独立包装的步骤。
[0021] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的 物质。
[0022] 本发明所提供的检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质，为上述应用中或 上述试剂或试剂盒中所述检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质。
[0023] 上述检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质，可包括下述P1和/或P2 :
[0024] P1、所述病毒性出血性败血症病毒指纹序列的测序引物；
[0025]P2、所述扩增病毒性出血性败血症病毒指纹序列的引物对。
[0026] 上述检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质中，所述测序引物可为名称为 VHSV-S的序列表中SEQIDNo. 8所示的单链DNA;所述扩增病毒性出血性败血症病毒指纹 序列的引物对可为名称为VHSV-P的由序列表中SEQIDNo. 6所示的单链DNA和SEQID No. 7所示的单链DNA组成的引物对。
[0027] 为解决上述技术问题，本发明还提供了病毒性出血性败血症病毒的检测方法1。
[0028] 本发明所提供的病毒性出血性败血症病毒的检测方法1，包括下述H1)和H2)的步 骤：
[0029] H1)以待测生物样品的核酸（RNA或DNA)为模板，选用58°C的退火温度，用所述 VHSV-P进行PCR扩增得到PCR产物；
[0030] H2)检测步骤HI)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有205bp的DNA 片段，所述待测样品含有病毒性出血性败血症病毒或候选含有病毒性出血性败血症病毒； 如果所述PCR产物中不含205bp的DNA片段，所述待测样品不含病毒性出血性败血症病毒 或候选不含病毒性出血性败血症病毒。
[0031] 为解决上述技术问题，本发明还提供了病毒性出血性败血症病毒的检测方法2。
[0032] 本发明所提供的病毒性出血性败血症病毒的检测方法2,包括下述H3)和H4)的步 骤：
[0033]H3)以待测生物样品的核酸（RNA或DNA)为模板，选用58°C的退火温度，用所述 VHSV-P进行PCR扩增得到PCR产物；
[0034]H4)检测步骤H3)得到的PCR产物，如果所述PCR产物中含有所述病毒性出血性败 血症病毒指纹序列，所述待测样品含有病毒性出血性败血症病毒或候选含有病毒性出血性 败血症病毒；如果所述PCR产物中不含所述病毒性出血性败血症病毒指纹序列，所述待测 样品不含病毒性出血性败血症病毒或候选不含病毒性出血性败血症病毒。
[0035] 上述病毒性出血性败血症病毒的检测方法2中，所述检测步骤H3)得到的PCR产 物为以所述VHSV-S为测序引物进行焦磷酸测序。
[0036] 上文中，所述检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质可只由所述VHSV-S 和所述VHSV-P组成，也可只由所述VHSV-P组成，也可只由所述VHSV-S组成。
[0037] 上文中，所述检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质，还可包括检测所述 病毒性出血性败血症病毒指纹序列所需要的其他试剂和/或仪器，如通过焦磷酸测序检测 所述病毒性出血性败血症病毒指纹序列所需的试剂和仪器。
[0038] 具体来说，进行焦磷酸测序所需要的其它试剂和仪器可为5XPCRbuffer和/或 Taq热启动酶和/或变性缓冲液（denatureationbuffer)和/或冲洗缓冲液（washing buffer)和/或链霉亲和素包被的磁珠和/或真空吸附栗（vacuumpreptool)和/或PCR 仪和/或PYROMARKID仪器。
[0039] 其中，所述5XPCR buffer和所述Taq热启动酶均可为宝生物工程（大连）有限 公司产品，货号为DRR019A);
[0040] 所述链霉亲和素包被的磁珠可为北京思尔成生物技术有限公司的货号为142-03 的Dynabeacfs?M_280Tosylactivated〇
[0041] 所述真空吸附栗（vacuumpreptool)可为德国QIAGEN产品。
[0042] 所述变性缓冲液（denatureationbuffer)可为为德国QIAGEN产品，货号为 19083。
[0043] 所述冲洗缓冲液（washingbuffer)可为德国QIAGEN产品，货号为19086。
[0044] 上述检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质均可独立包装。
[0045] 实验证明，基于本发明的病毒性出血性败血症病毒（VHSV)指纹序列，可利用本发 明的检测病毒性出血性败血症病毒（VHSV)指纹序列的物质通过焦磷酸测序法对病毒性出 血性败血症病毒进行鉴定，其中VHSV-P可扩增出含有VHSV指纹序列的DNA片段，VHSV-S可 通过焦磷酸测序法测定VHSV指纹序列的序列；本发明的VHSV-P和VHSV-S可特异识别病毒 性出血性败血症病毒的核酸序列；本发明的VHSV-P具有较高的灵敏度，可识别浓度为1拷 贝/yL的病毒性出血性败血症病毒。依赖于本发明的VHSV指纹序列及VHSV-P与VHSV-S 的鉴定VHSV的焦磷酸测序法与普通PCR鉴定VHSV的结果是一致的，并可避免普通PCR鉴定VHSV时的假阳性的问题；常规的DNA测序技术对大片段的DNA进行序列测定速度慢、消耗 大，更不易于进行大规模样本的检测，而依赖于本发明的VHSV-P与VHSV-S的鉴定VHSV的 焦磷酸测序法则可克服这一缺点，可快速检测大规模样本，在4小时内即可完成检测过程。 实验证明，与普通PCR鉴定VHSV相比，依赖于本发明的VHSV指纹序列及VHSV-P与VHSV-S 的鉴定VHSV的焦磷酸测序法具有自动化程度高、准确性高、灵敏度高、可靠性好、重复性 好、稳定性好、操作简便、耗时短、高通量、成本低的特点。
【附图说明】
[0046] 图1为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道M为DL2000Marker;泳道1为 用SVCV-P以SVCV的RNA为模板的PCR扩增产物的电泳图；泳道2为用VHSV-P以VH