专利名称：一种甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及疫苗技术领域，尤其是涉及一种甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
甲鱼，学名中华鳖，历来是药膳 及滋补佳品。20世纪80年代，温室养殖的兴起，使原本奉为稀珍的甲鱼的产量大幅提高，随之而起的是疾病的肆意流行。传统防治多使用抗生素和化学药品进行，对于病毒性疾病，非但没有起到治疗效果，反而对甲鱼造成毒害，污染环境，并导致药物残留，打击消费者的消费信心。2007年以来，在浙江地区，尤以杭州、宁波地区甲鱼生态养殖场暴发一种系统性败血症，主要症状为系统性出血性败血，研究人员经流行病学调查、组织切片与超薄切片观察和人工感染试验等研究，确定一种新型球状病毒是其原发性致病因子，该新型球状病毒为甲鱼系统性败血症球状病毒。甲鱼系统性败血症球状病毒式从发病甲鱼中分离的一种新型病毒。该病毒能导致甲鱼系统性出血、败血，来势猛，7-10天内累积死亡率可达90-100%。疫苗是指为了预防、控制传染病的发生、流行，用于人体预防接种的疫苗类预防性生物制品，其能有效控制疾病的发生，使用后没有污染，无任何残留，能有效地保护生态环境和食用产品的品质，并且长期使用也不会产生耐药性。疫苗主要包括灭活疫苗以及亚单位疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗，其中灭活疫苗指选用免疫原性好的细菌、病毒、立克次体、螺次体等，经人工培养，再用物理或化学方法将其杀灭制成。此种疫苗失去繁殖能力，但保留免疫原性。死疫苗进入人体后不能生长繁殖，对机体刺激时间短，要获得持久免疫力需多次重复接种。相对于亚单位疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗，灭活疫苗以其便于制作、简单易行等优点具有无可替代的优势。针对甲鱼系统性败血症疾病，目前国内外均无相关防治方法的研究，更没有关于甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗及其制备方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用本发明人从患系统性败血症的甲鱼体内分离得到的甲鱼系统性败血症球状病毒作为生产疫苗的病毒株，制备出安全、有效、免疫力强的甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗并提供其制备方法，该灭活疫苗的制备方法简单、易行。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为
I、病毒特性
甲鱼系统性败血症球状病毒(Soft-shelled turtle systemic septicemiasphericalvirus, STSSSV)，毒株为 pl015 株，保藏号为 CGMCC No. 5378，于 2011 年 10 月 21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该病毒无囊膜，直径23-40nm，细胞核内、外均可增殖。
2、一种甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗，本疫苗含有保藏号为CGMCCNo. 5378的经灭活的甲鱼系统性败血症球状病毒。3、一种甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗的制备方法，步骤如下
(1)病毒纯化
取患系统性败血症的甲鱼，将发病甲鱼内脏组织剪碎，按质量体积比Ig :10ml比例将甲鱼内脏加入到TNE缓冲液中 ，于4 °C下，8000r/min离心20min后，取上清液于4 °C下，35000g离心Ih ;然后取底部核心部位白色沉淀，重悬于5mlTNE缓冲液中，4°C冰箱冰浴过夜，将过夜的沉淀轻轻吹打均匀，于4°C下，8000r/min离心20min，取上清液于4°C下，35000g离心lh，得到的白色沉淀即为纯化病毒；
(2)抗原灭活
将步骤(I)得到的纯化病毒用0. 9%无菌生理盐水稀释到病毒蛋白终浓度0. 5-lmg/ml,然后加入终体积0. 5%的福尔马林于37°C恒温水浴锅灭活24h，每2-3h进行振荡混匀，得到无菌的灭活病毒；
(3)乳化
将步骤(2)得到的灭活病毒与弗式完全佐剂按体积比I :1混合后，于4°C间歇振荡乳化6-8h得到甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗。所述的TNE 缓冲液配制方法Tris 3. 0289g、NaCl 6. 00g、EDTA 0. 9306g 补足双蒸水至500ml，调整pH 7. 6，高压灭菌，4°C冷藏备用。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明一种甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗及其制备方法，具有如下优点
(I)本发明首次提出了甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗及其制备方法，本发明是唯一的、高效的生产工艺，本身具有领先性。(2)按本发明生产甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗对生产条件要求不高，便于操作和实施，制备过程简单、易实现。(3)自然条件下，病毒主要通过甲鱼吞食病鳖和带毒池水浸泡而传染，达不到本发明效力检验中注射的病毒剂量(注射剂量按体重< 100g，注射0. Iml ；100g <体重< 200g，注射0. 2ml ;200g<体重< 300g，注射0. 3ml ;体重> 300g，注射0. 4ml)，故自然环境中的保护率可能更高。综上所述，本发明一种甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗具有安全、有效、免疫力强，该灭活疫苗的制备方法简单、易行。甲鱼系统性败血症球状病毒(Soft-shelledturtle systemic septicemiasphericalvirus, STSSSV)，毒株为 P1015 株，保藏号为 CGMCC No. 5378，于 2011 年 10 月 21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
图I为纯化的甲鱼系统性败血症球状病毒粒子的电镜观察结果。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
本发明一种甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗，本疫苗含有保藏号为CGMCCNo. 5378的经灭活的甲鱼系统性败血症球状病毒。该甲鱼系统性败血症球状病毒(Soft-shelled turtle systemic septicemia spherical virus, STSSSV),毒株为 P1015株，保藏号为CGMCC No. 5378，于2011年10月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该病毒无囊膜，直径23-40nm，细胞核内、外均可增殖。具体制备方法如下
(1)病毒纯化
取患系统性败血症的甲鱼，将发病甲鱼内脏组织剪碎，按质量体积比Ig IOml比例将甲鱼内脏加入到TNE缓冲液中，于4°C下，8000r/min离心20min后，取上清液于4°C下，35000g离心Ih ;然后取底部核心部位白色沉淀，重悬于5mlTNE缓冲液中，4°C冰箱冰浴过夜，将过夜的沉淀轻轻吹打均匀，于4°C下，8000r/min离心20min，取上清液于4°C下，35000g离心lh，得到的白色沉淀即为纯化病毒；
(2)抗原灭活
将步骤(I)得到的纯化病毒用0. 9%无菌生理盐水稀释到病毒蛋白终浓度0. 5mg/ml,然后加入终体积0. 5%的福尔马林于37°C恒温水浴锅灭活24h，每2-3h进行振荡混匀得到无菌的灭活病毒；
(3)乳化
将灭活病毒与弗式完全佐剂按体积比I : I混合后，于4°C间歇振荡乳化6h得到甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗。TNE 缓冲液配制方法Tris 3. 0289g、NaCl 6. 00g、EDTA 0. 9306g 补足双蒸水至500ml，调整pH 7. 6，高压灭菌，4°C冷藏备用。除上述实施例外，病毒蛋白终浓度还可以为lmg/ml或0. 75mg/ml ;歇振荡乳化时间还可以为7h或者8h。二、检验方法
I、成品检验充分乳化的灭活疫苗为乳白色油乳剂，取一滴滴于水上5min不散开，4°C放置15日不分层。2、无菌检测取IOOul甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗，涂布牛肉琼脂平板，28°C倒置培养24-48h，观察有无细菌生长。无菌生长为合格。3、安全检测
a.取灭活疫苗接种鸡胚，每胚0.15ml，34°C培养10天，观察鸡胚死亡情况；
b.取灭活疫苗接种甲鱼,每只0.3ml，观察甲鱼10天内死亡情况；
鸡胚接种3-10d和甲鱼接种15d内无死亡为合格。4、效力检验
(I)免疫
不同规格甲鱼由后腿肌注疫苗，另设对照组按体重注射相应剂量生理盐水。充分乳化后对甲鱼进行免疫，注射剂量按体重〈100g，注射0. Iml ；100g〈体重〈200g，注射0. 2ml ；200g〈体重〈300g，注射0. 3ml ;体重〉300g，注射0. 4ml。另设对照组，按体重注射相应剂量生理盐水。
(2)由甲鱼发病组织 粗提高浓度病毒液作为攻毒液
a.取患系统性败血症典型发病症状的甲鱼解剖，取内脏放入埋在冰里的烧杯；
b.将内脏组织剪碎按m/v=lg10ml加入TM缓冲液匀浆，于4°C，6000g条件下，离心20min,取上清液；
c.将离心所得沉淀用少量TM缓冲液重悬，再次匀浆，于4°C，6000g离心20min，合并两次离心所得上清液；
d.将合并所得上清液经孔径0.45 y m的滤膜过滤除去破碎组织后，再将滤液经0. 22um针式滤头过滤除菌，按体积每毫升滤液加入1000IU青霉素和1000 u g链霉素；
e.放入4°C冰箱冰浴过夜即得攻毒液。(3)取已免疫15天的甲鱼进行攻毒实验，实验组注射经上述方法制备的攻毒液，剂量同免疫剂量，每组50只，观察第3-10日内死亡情况。结果注射生理盐水的对照组攻毒后死亡率均为100%;注射灭活疫苗组，用攻毒液注射攻毒后死亡率均低于50%，结果表明疫苗对甲鱼有明显保护效力。满足以上四种检验要求视为合格。
权利要求
1.一种甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗，其特征在于本疫苗含有保藏号为CGMCC No. 5378的经灭活的甲鱼系统性败血症球状病毒。
2.一种根据权利要求I所述的甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤如下 (1)病毒纯化 取患系统性败血症的甲鱼，将发病甲鱼内脏组织剪碎，按质量体积比Ig :10ml比例将甲鱼内脏加入到TNE缓冲液中，于4 °C下，8000r/min离心20min后，取上清液于4 °C下，35000g离心Ih ;然后取底部核心部位白色沉淀，重悬于5mlTNE缓冲液中，4°C冰箱冰浴过夜，将过夜的沉淀轻轻吹打均匀，于4°C下，8000r/min离心20min，取上清液于4°C下，35000g离心lh，得到的白色沉淀即为纯化病毒； (2)抗原灭活 将步骤(I)得到的纯化病毒用O. 9%无菌生理盐水稀释到病毒蛋白终浓度O. 5-lmg/ml,然后加入终体积O. 5%的福尔马林于37°C恒温水浴锅灭活24h，每2-3h进行振荡混匀，得到无菌的灭活病毒； (3)乳化 将步骤(2)得到的灭活病毒与弗式完全佐剂按体积比I :1混合后，于4°C间歇振荡乳化6-8h得到甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗。
3.根据权利要求2所述的一种甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的TNE缓冲液配制方法Tris 3. 0289g、NaCl 6. 00g、EDTA O. 9306g补足双蒸水至500ml，调整pH 7. 6，高压灭菌，4°C冷藏备用。
全文摘要
本发明公开了一种甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗及其制备方法，特点是该疫苗含有保藏号为CGMCCNo.5378的经灭活的甲鱼系统性败血症球状病毒，其制备方法包括将病甲鱼内脏剪碎加入TNE缓冲液中，离心取上清液，再离心取白色沉淀，重悬于TNE缓冲液中，将沉淀离心后，取上清液再离心得到白色沉淀即纯化病毒的步骤，将纯化病毒用无菌生理盐水稀释到病毒蛋白终浓度0.5-1mg/ml，然后加入终体积0.5%的福尔马林恒温水浴锅灭活的步骤；将灭活病毒与弗式完全佐剂按体积比11完全乳化得到灭活疫苗的步骤，优点是首次提出了甲鱼系统性败血症球状病毒灭活疫苗具有安全、有效、免疫力强，其制备方法简单、易行。
文档编号C12N7/06GK102626514SQ20121001872
公开日2012年8月8日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者刘联国, 周永强, 彭娇, 李登峰 申请人:宁波大学