甘蓝aha10基因家族及其应用的制作方法

专利名称：甘蓝aha10基因家族及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本 禾中 (Brassica rapa)禾口(Brassica oleracea) AHAlO (autoinhibitedH+-ATPase 10，自抑制H+-ATP酶10)基因家族及其应用。
背景技术：
十字花科(Brassicaceae)的芸薹属(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和观赏植物品种，为人类提供营养价值丰富的食用油、蔬菜和观赏植物，并为畜牧业提供饲料，具有重要的经济价值。在芸薹属物种中，异源四倍体物种甘蓝型油菜是由2个二倍体物种白菜和甘蓝通过种间杂交后再加倍而形成的。甘蓝型油菜是世界第二大油料作物，在全世界广泛种植，栽培面积和产量仅次于大豆。白菜和甘蓝也是重要的油料、蔬菜和观赏作物。对甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝功能基因的比较基因组学研究将为揭示它们之间的遗传进化关系提供理论基础，并为芸薹属作物的性状改良提供应用基础。籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、皮壳率低、粗纤维含量低、含油量高、饼粕蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼粕的经济价值和油的品质都有所提高。虽然白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但自然界中不存在天然的甘蓝型油菜黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等方式而创造，存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性状进行了广泛研究，但到目前为止对于黄籽性状形成的分子机理仍不清楚，更没有通过转基因分子育种创造黄籽性状的任何报道。芸薹属和拟南芥(Arabidopsi staliana)同属十字花科，具有较近的亲缘关系。原花青素(proanthocyanidin，PA)是形成甘蓝型油菜黑籽颜色的基础，在黄籽种皮中明显降低。拟南芥AHAlO (AtAHAlO)基因参与了种皮中原花青素的聚合，也影响着早期种皮细胞中液泡的发育。在拟南芥ahalO突变体中，虽然花青素(anthocyanidin)能在种皮中正常的积累，但原花青素的积累量只有非突变体的百分之一，这表明质膜H+-ATPase参与了原花青素在种皮细胞中的代谢，特别是在原花青素的聚合过程中起着重要的调控作用。AtAHAlO基因的突变同样使得突变体种子的种皮呈现出透明种皮的特性。在正常的拟南芥种子发育早期，种皮内层细胞中能观察到较大的液泡，而在拟南芥ahalO突变体中只能看到一些较小的液泡，但随着种皮的逐渐成熟，这些差别会随之消失，表明该基因的突变导致了液泡发育的延迟。因此，在芸薹属中对AHA10基因进行同源克隆和功能鉴定，将有助于揭示甘蓝型油菜种皮色素和早期种皮细胞中液泡发育的分子机理，是筛选甘蓝型油菜黄籽位点的重要途径。芸薹属和拟南芥起源于同一祖先，约在1700 1800万年前发生分离，芸薹族植物发生了基因组水平的三倍化，即芸薹属基本种白菜(AA组，5^Mbp)、甘蓝(CC组，696Mbp) 和黑芥(BB组，632Mbp)等的基因组约相当于拟南芥基因组(157Mbp)的3倍，而甘蓝型油菜(AACC组，1132Mbp)的基因组相当于甘蓝和白菜两个基因组之和，约相当于拟南芥基因组的6倍，也就是说，在拟南芥中为单拷贝的基因在甘蓝和白菜中可能分别有3个对应的拷贝，而在甘蓝型油菜中可能有6个拷贝。目前，除AtAHAlO基因外，尚无其它植物的AHAlO 基因被克隆，对AHAlO基因的研究报道较少，而AHAlO基因在甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种中的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性及与黄籽性状的关系、转基因分子育种等都未见报道。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝 AHAlO基因家族。为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，分别克隆了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHAlO基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并进行了系统分析。结果显示所述白菜AHAlO (BrAHAlO)基因家族包括以下2个成员BrAHA10_l基因禾口 BrAHA 10-2基因；所述BrAHAlO-I基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrAHAlO-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 4所示；所述甘蓝AHAlO (BoAHAIO)基因家族包括以下2个成员ΒοΑΗΑ10_1基因和 ΒοΑΗΑ10-2基因；所述BoAHAIO-I基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 6所示，ΒοΑΗΑΙΟ-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 8所示；所述甘蓝型油菜AHAlO (BnAHAlO)基因家族包括以下2个成员=BnAHAlO-I基因和 BnAHA 10-2 基因；所述 BnAHAlO-I 基因的全长 cDNA 序列如 SEQ ID No. 10 所示，ΒηΑΗΑΙΟ-2 基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 12所示。进一步，所述BrAHAlO-I基因的基因组序列如SEQ ID No. 1所示，BrAHAlO-2基因的基因组序列如SEQ ID No. 3所示；所述BoAHAIO-I基因的基因组序列如SEQ ID No. 5所示，BoAHA10-2基因的基因组序列如SEQ ID No. 7所示；所述BnAHAlO-I基因的基因组序列如SEQ ID No. 9所示，BnAHA 10-2基因的基因组序列如SEQ ID No. 11所示。上述3个物种的6条AHAlO基因与AtAHAlO基因具有较高的同源性，基因组序列一致性为72. 4 74. 1 %，编码区序列一致性为89. 6 90. 6% ;6条AHAlO基因之间也具有很高的同源性，基因组序列一致性为85. 0 99. 8 %，编码区序列一致性为95. 7 99. 9%。 核酸水平和氨基酸水平的序列比对、系统发生聚类等表明，6条AHAlO基因都是AtAHAlO 基因的垂直同源基因，具有相似的结构特征；其中BnAHAlO-I基因起源于BoAHAIO-I基因，BnAHA10-2基因起源于BrAHAlO-2基因。半定量RT-PCR检测表明，BnAHAlO, BrAHAlO, BoAHAIO基因家族具有类似AtAHAlO基因的转录特征，都是在早期发育中的种子中表达丰度最高；此外，AHAlO基因在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜黑籽与黄籽材料的生殖器官中的表达存在着较明显的差异，AHAlO基因表达显著下调是芸薹属黄籽性状的重要成因。
基于上述结果，利用本发明的BnAHAlO、BrAHA10、BOAHA10基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建AHAlO基因重组表达载体和转化体，用于AHAlO基因的正义表达、反义抑制、RNA干扰等。本发明的目的之二在于提供所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHAlO基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用。进一步，所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHAlO基因家族在甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用。为达到上述目的，本发明选取甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHAlO基因家族特异保守片段BAHA10I (核苷酸序列如SEQ ID No. 10中第2768 30 位碱基所示) 为RNA干扰片段，以基于PTOC5941改造的植物RNA干扰基础载体PTOC5941M为骨架，将 BAHA10I片段分别以反义和正义方式同时插入PTOC5941M的CaMV35S启动子和OCS终止子之间形成反向重复序列，构建了芸薹属AHAlO基因家族RNA干扰载体PreC5941M-BAHA10I， 并通过农杆菌介导的下胚轴侵染法转化了甘蓝型油菜典型黑籽品种中双10号，所得阳性转基因植株和种子的性状调查发现，通过RNA干扰沉默BnAHAlO基因家族后，转基因种子多数呈黄棕色和紫黄色，少数呈金黄色，与非转基因种子的典型黑籽形成鲜明对比。转基因后代植株的主体形态特征与非转基因的对照植株无明显差异，但是转基因种子普遍偏小，饱满度偏低。说明在甘蓝型油菜等植物中，AHAlO基因除了参与调控种皮色素合成以外，还参与调控了一些其它种子性状如种子大小，可以应用于芸薹属作物种子性状的分子育种，尤其是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种，利于创造出新型的甘蓝型油菜黄籽材料，也可以超量表达后用于增加种子的大小，提高种子千粒重。本发明的有益效果在于本发明提供了 AHAlO基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性等，并确认了 AHAlO基因表达显著下调是芸薹属黄籽性状的重要成因，由此本发明提供了 AHAlO基因在芸薹属作物种子性状改良特别是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用，应用前景好。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1为BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO基因家族5，cDNA末端扩增的琼脂糖凝胶电泳。图2为BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO基因家族3，cDNA末端扩增的琼脂糖凝胶电泳。图3为BrAHAlO基因家族全长cDNA和基因组DNA的扩增结果，其中A为 BrAHA10-ImRNA，B 为 BrAHAlO-I(1)和 BrAHA10-2(2)gDNA。图4为BoAHAIO基因家族全长cDNA和基因组DNA的扩增结果，其中A为 BoAHA 10-ImRNA，B 为 BoAHA 10-2 mRNA, C 为 BoAHA 10-1 (1)和 BoAHA 10-2 (2) gDNA。图5为BnAHAlO基因家族全长cDNA和基因组DNA的扩增结果，其中A为 BnAHA 10-ImRNA，B 为 BnAHA 10-2 mRNA, C 为 BnAHAlO-I (1)禾口 BnAHA 10-2 (2) gDNA。图6为BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族及AtAHAlO基因mRNA的序列比对。图7为BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族与拟南芥AHA基因家族mRNA的聚类分析。图8为BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO家族蛋白及AtAHAlO蛋白的氨基酸序列比对。图9为BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO家族蛋白与拟南芥AHA家族蛋白的聚类分析。图10为BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO家族蛋白的三级结构预测。图11为BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族成员的Southern杂交鉴定，其中M 为地高辛标记的分子量标准。图12为BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族总体和成员组织器官特异性表达检测。图13为白菜、甘蓝、甘蓝型油菜黑籽、黄籽材料主要生殖器官中AHA10基因家族总体和各成员的表达。图14为RNA干扰载体preC5941M_BAHA10I的元件图。图15为RNA干扰片段ΒΑΗΑ101的PCR扩增。图16为涉及反义片段插入的酶切和中间载体单克隆的PCR检测，其中，1为 PMD19-T-BAHA10I 的 NcoI+Aat11 双酶切；2 为 pFGC5941M 的 NcoI+Aat11 双酶切，3、4 为 PFGC5941M-BAHA10IA 单克隆用引物组合 F35S3N+FBnAHA10I, RBnAHAlOI+RBnPAP212 检测， M 为 Marker (1、3、4 为 DL2000 plus, 2 为 λ -HindIII 与 DL2000 plus 的混合物),CK 为未酶切的质粒。图17为涉及正义片段插入的酶切和RNA干扰载体单克隆的PCR检测，其中， 1 为 pMD19-T-BAHA10I 的 BamHI+Xbal 双酶切；2 为 pFGC5941M_BAHA10IA 的 BamHI+Xbal 双酶切，3、4、5、6 为 pFGC5941M-BAHA10IA 单克隆用引物组合 FBnPAP2I2+RBAHA10I、 R0CST5N+FBAHA10I、F35S3N+RBnPAP2I2, FBnPAP2I2+R0CST5N 检测，M 为 Marker，CK 为未酶切的质粒。图18为再生植株的Basta复检鉴定，其中A为阴性植株对照，B为阳性植株。图19为RNA干扰载体preC5941M_BAHA10I转基因油菜的PCR扩增结果，其中1为阳性菌液对照，2为阴性植株对照，3 10为转基因植株。图20为非转基因植株㈧和转基因植株⑶的种皮颜色比较。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。优选实施例采用的植物材料白菜材料均来自于白菜型油菜亚种(B.rapa ssp. oleifera)，包括黑籽系09L597和黄籽系09L600 ；甘蓝材料均来自于羽衣甘蓝变种 (B. oleracea var. acephala)，包括黑籽系09L598和黄籽系09L599 ；甘蓝型油菜材料包括黑籽系5B和籽色近等基因系(黑籽系09L588、黄籽系09L587)，均由重庆市油菜工程技术研究中心选育，大田常规种植，并经过了 10代以上的单花序套袋自交；甘蓝型油菜黑籽品种中双10号由中国农业科学院油料作物研究所选育，种子由重庆市油菜工程技术研究中心提供。优选实施例采用的主要试剂及试剂盒=Easy-Taq DNA聚合酶(5U/ μ 1)购自北京全式金生物技术有限公司，LA Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)、λ -HindIII DNA marker、RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3. 0 购自宝生物工程(大连)有限公司，DraI (40U/ul), EcoRI, EcoRV, HindIIiabaI (lOU/μ 1)、尼龙膜、地高辛标记的DNA marker、pMD19_T载体连接试剂盒、PCR DIG ProbeSynthesis Kit、DIG Easy Hyb>DIG Wash and Block Buffer Set、DIG Nucleic Acid Detection Kit _ 自RocheMS (Murashige and Skoog medium) ^1^ !
自荷兰Duchefa公司，结冷胶购自浙江中肯生物科技有限公司，小量植物组织RNA抽提试剂盒(W7021)购自上海华舜生物工程有限公司，小量胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自杭州博日生物工程有限公司，pGEM-T easy载体连接试剂盒购自美国!Iomega公司，GeneRacer Kit购自美国hvitrogen公司。改进型植物RNA干扰基础载体PreC5941M是在pTOC5941 的基础上改进而成，改进之处是采用来自甘蓝型油菜的&1PAP2基因第2内含子(BnPAP2I2) 替换了 PTOC5941上过长的WiChsA间隔区，并在间隔区与启动子间增加了一个AatII切点。一、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHAlO基因家族的克隆1、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝基因组总DNA的提取取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1. 0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的3个物种的基因组总DNA完整性好，平均分子量均大于λ-HindIII DNA Marker的231Λ条带，RNA消化彻底，纯度较高，可以用于PCR扩增和Southern杂交。2、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝各器官总RNA的提取取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的蕾(Bu)、 花(Fl)以及4个发育阶段的种子[甘蓝型油菜和甘蓝取开花后15天(15D)、30天(30D)、45 天(45D)和55天(55D)的种子；白菜取开花后10天(IOD)、25天(25D)、40天(40D)和45 天(45D)的种子]；以及大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜09L587和09L588、白菜09L597 和 09L600、甘蓝 09L598 和 09L599 的根(Ro)、下胚轴(Hy)、子叶(Co)、茎(St), Bf (Le)、蕾、 花、荚果皮(SP)以及4个发育阶段的种子(甘蓝型油菜和甘蓝取15D、30D、45D和55D的种子；白菜取10D、25D、40D和45D的种子)共12个器官；采用小量植物总RNA抽提试剂盒提取各器官总RNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1. 0%琼脂糖凝胶电泳显示，获得的总RNA特征条带清晰，且无明显RNA降解和DNA污染，经分光光度法检测纯度较高，能够满足RACE操作的基本要求。3、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝RACE第一链cDNA的获得分别取甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的蕾、花和4个发育阶段的种子的总RNA混合成总量为5ug的RNA样品，采用GeneRacer Kit按其说明书进行一系列的 RACE操作，最终反转录获得在3’端和5’端同时锚定有人工接头序列的第一链cDNA，PCR放大后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，反转录比较完全，三个物种均得到了较高质量的总cDNA，可用于克隆甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHAlO基因家族完整的cDNA末端。4、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHAlO基因家族5，cDNA末端的克隆根据AtAHAlO序列多重比对的结果，设计了对应于两个最保守点的反向引物RA HA105-1 -ccagttacatctgtactgtccac-3‘)和 ΚΑΗΑΙΟδ-ΖΝ -cccttcttcttggtcacaggta g-3’)。分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝第一链cDNA为模板，用GeneRacer Kit提供的引
7^ 5' P (5' -cgactggagcacgaggacac-tga-3‘)与 RAHA105-1 MM, S^T 5' cDNA μ W RACE 一扩。50 μ 1 标准 Taq PCR 扩增体系为10 X PCR Buffer 5. 0 μ 1，25mmol/L 的 MgCl2 3. 0μ l,10mmol/L 的 dNTPs 1. 0μ l,10ymol/L 的正向引物 1. 0 μ l,10ymol/L 的反向引物1. 0 μ 1，5U/ μ 1的Taq酶0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，加无菌水至总体积为50 μ 1。PCR扩增循环参数为94°C预变性2分钟；再94°C变性1分钟，52°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共 30个循环；最后72°C延伸10分钟。以一扩产物为模板，用 GeneRacer Kit 提供的引物 5’NP (5’-ggacactgacatggactg aagg-agta-3，)与RAHA105-2配对，进行5，cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系和扩增循环参数与一扩相同，但模板改为0. lul，退火温度改为56°C。PCR产物进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，采用小量胶回收试剂盒回收目标片段，与PGEM-T easy载体连接，再转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Amp)、IPTG和Χ-gal的LB平板培养至蓝白斑清晰，挑取白斑单菌落，用含有Amp的LB液体培养基增菌培养后，取菌液进行PCR鉴定，结果阳性克隆子表现出明显的长度多态性，各挑选10个具有代表性的阳性克隆子委托上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序。测序结果表明=BrAHAlO基因的5’cDNA末端介于691 906bp之间，BoAHAIO基因的5，cDNA末端介于723 856bp之间，BnAHAlO基因的5，cDNA末端介于730 800bp之间。NCBI BLASTn表明，这些5，cDNA末端与AtAHAlO 基因(匪101587.2)具有很高的一致性，表明它们的确为芸薹属AHAlO基因家族的5，cDNA 末端。5、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHAlO基因家族3，cDNA末端的克隆根据AtAHAlO序列多重比对的结果，设计了对应于两个最保守点的正向引物FA HA103-1 -gtaacacgtagtcgaagctggtc-3，)和 FAHA103_2(5，-aacgtcccgggactctcctga t_3’)。分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝第一链cDNA为模板，用GeneRacer Kit提供的引物 3，P (5，-gctgtcaacgatacgctacgt-aacg_3，)与 FAHA103-1 配对，进行 3，cDNA 末端的 RACE 一扩。PCR扩增体系和扩增循环参数与5’ cDNA末端的RACE—扩相同。以一扩产物为模板，用 GeneRacer Kit 提供的引物 3，NP (5，_cgctacgtaacggcatga cagtg-3，)与FAHA103-2配对，进行3，cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系和扩增循环参数与5’ cDNA末端的RACE巢扩相同。PCR产物如前法所述进行电泳检测(图2)、胶回收、 T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序。测序结果表明BrAHA10基因的3，cDNA末端介于661 697bp之间，BoAHA 10基因的3，cDNA末端介于625 686bp之间，BnAHAlO基因的3，cDNA末端介于650 704bp之间[均不包括 poly(A)]。NCBI BLASTS表明，这些3，cDNA末端与AtAHAlO基因具有很高的一致性，表明它们的确为芸薹属AHAlO基因家族的3’ cDNA末端。6、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHAlO基因家族成员全长cDNA及基因组DNA的克隆根据所获得的甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHAlO基因家族5，cDNA和3，cDNA末端序列，设计了 7条正向引物和6条反向引物(表1)，将其两两组合共得到42对引物组合；分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝第一链cDNA为模板，采用上述引物组合和50 μ 1标准Taq PCR 扩增体系，扩增甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHAlO基因家族各成员的全长cDNA，PCR扩增循环参数为94°C预变性2分钟，再94°C变性1分钟、60°C退火1分钟、72°C延伸4分钟，共35 个循环，最后72°C延伸10分钟；分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝基因组总DNA为模板，采用上述引物组合和50 μ 1标准Taq PCR扩增体系进行相同PCR，扩增甘蓝型油菜、白菜和甘蓝 AHAlO基因家族各成员的基因组DNA ；再如前法所述进行电泳检测、胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序。表1 BrAHA 10、BoAHA 10、BnAHA 10基因家族成员全长cDNA及基因组DNA的扩增引物
引物名称_引物序列(5’—3’)_碱基数(Ht)解链温度("C)
FBRA10-1atctc atcttcctctaactccatacc2663.02
FBRA10-9gtttcgcttatgttcctcaagtag2461.15
FBRA10-16gttaagtcctttgtttcattataattaactca3259.52
FBOAlO-Igttaagtcctttgtttcataataattaactcg3260.81
FBOAlO-8agtagcattctcgaagacaaag2258.95
FBOAlO-21actaaccttattaaaattttcctatttcgtc3159.35
FBNA10-6atcttcctcttactccataccaac2461.15
RBRA10-1 ccttgagaatcattagttgtgtgg 24 61.15 RB RA10-10 agcttctgaaacaagtaaccaaattg 26 59.86 RBOAlO-I gtttcatcggaactacttgatagc 24 61.15 RBOAlO-12 ggttgtgtgggaactacttgatagc 25 64.58 RBNA10-6 cttccttgacaatcatctgtttcatc 26 61.44 RBNA10-C02_agagtttcttccttgagaatcattgg_26_61.44_以白菜第一链cDNA为模板，引物组合为FBNA10-6+RBRA10-10，扩增得到1条长度为326仙？[不包括？017仏)]的全长cDNA，命名为BrAHAlO-I mRNA (图3A)。以白菜基因组总DNA为模板，引物组合分别为FBNA10-6+RBRA10-10和FBRA10-1+RBNA10-C02，扩增得到2 条长度分别为5323bp和5077bp的基因组DNA，分别命名为BrAHAlO-I gDNA和BrAHA10_2 gDNA (图 3B)。以甘蓝第一链cDNA为模板，引物组合分别为FBRA10-16+RB0A10-1和 FBNA10-6+RB0A10-12，扩增得到2条长度均为3322bp [不包括poly (A)]的全长cDNA，命名为BoAHAlO-1 mRNA和BoAHA10_2 mRNA (图4A、B)。以甘蓝基因组总DNA为模板，利用上述引物组合，扩增得到2条长度均为5143bp的基因组DNA，命名为BoAHAlO-1 gDNA和 BoAHA10-2 gDNA(图 4C)。以甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，引物组合分别为FBRA10-16+RB0A10-1和 FBNA10-6+RB0A10-12，扩增得到2条长度分别为3266bp和3215bp的全长cDNA，分别命名为 BnAHAlO-I mRNA和BnAHA10_2 mRNA (图5A、B)。以甘蓝型油菜5B基因组总DNA为模板， 利用上述引物组合，扩增得到2条长度分别为M13bp和5096bp的基因组DNA，分别命名为 BnAHAlO-I gDNA 和 BnAHAlO-2 gDNA(图 5C)。除了用上述引物组合扩增得到的全长cDNA和基因组DNA外，利用表1中的其它一些引物组合也扩增出了 DNA片段，但从序列上看，这些DNA片段均属于上述全长cDNA或基因组DNA的一部分，代表了一些可变性转录起始位点和可变性加尾位点。二、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝AHAlO基因家族的分析
在Vector NTI Advance 9. 0软件上进行序列比对、开放阅读框(ORF)查找与翻译，在http://www. ncbi. nlm. nih. gov网站上进行BLAST和蛋白序列的CDD搜索，在 http://bip. weizmann. ac. il/ 和 http://www. expasy. org 等网站提供链接的生物信息学在线分析软件上进行蛋白质结构分析，在http://prodes. toulouse. inra. fr/multalin/ multalin. html和http://www. ebi. ac. uk/clustalw/等网站上进行基因和蛋白质序列多重比对和聚类分析。1、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHA10基因家族的核酸序列分析BrAHAlO-I基因(SEQ ID No. 1)由20个内含子和21个外显子组成，20个内含子分别位于 427 496、617 719、818 890、 1031 1117、 1251 1316、 1503 1576、 1779 1868、1990 2057、2177 2266、2392 2467、2571 2677、2824 2914,3078 3 171,3413 3697、3729 3822、3906 3987、4148 4217、4393 4467、 4650 4745、4890 4998 bp 处；BrAHAlO-ImRNA (SEQ ID No. 2)在 201 30;35bp 处(对应于BrAHAlO-I基因的360 5094bp处)有一个^35bp的0RF，在ORF的上游和下游分别有200bp的5，非翻译区(UTR)和229bp的3，UTR, 5' UTR区中存在4处可变转录起始位点 (G1,A21,A82,A113)和三个小 ORF (42 62、82 105、95 130bp)，3，UTR 区中存在 5 处可变 Poly(A)加尾位点(T3202> C3211 > T3218、G3254、T3264)，最末 poly (A)加尾位点上游间隔 185bp 处的AAATAAA为典型poly (A)加尾信号。BrAHA 10-2基因(SEQ ID No. 3)由21个内含子和22个外显子组成，21个内含子分别位于 47 沘4、421 506、627 720、820 892、1031 1117、1253 1319、1500 1573,1781 1871、1992 2075、2196 2278、2402 2477、2583 2689、2835 2905、 3071 3 164,3404 3476、3510 3582、3665 3741、3903 3972、4147 4231、4415 4505,4649 4739bp 处；BrAHA10_2mRNA(SEQ ID No. 4)在 117 四5 Ibp 处(对应于 BrAHA 10-2基因的355 4836bp处)有一个^35bp的0RF，在ORF的上游和下游分别有 116bp的5，UTR和Mlbp的3，UTR, 5' UTR和3，UTR区中没有发现可变转录起始位点和可变poly㈧加尾位点，poly(A)加尾位点上游间隔197bp处的AAATAAA为典型poly㈧加尾信号。BrAHAlO-2基因第6内含子左边界由GT突变为GC，导致该内含子不能正确剪接，不能有效翻译形成功能蛋白，因此该基因的表达丰度极低，本实验没有扩增出其对应的cDNA。ΒοΑΗΑΙΟ-1基因(SEQ ID No. 5)由20个内含子和21个外显子组成，20个内含子分别位于 423 511、632 731、831 913、 1052 1137、 1273 1333、 1514 1593、1801 1890、2011 2130、2251 2330、2454 2531、2637 2738、2884 2954、 3120 3215、3455 3527、3561 3656、3739 3817、3979 4048、4223 4303、4487 4577,4721 4812 bp 处；BoAHA 10-ImRNA(SEQ ID No. 6)在 254 3088 bp 处(对应于 BoAHAIO-I基因的357 4909 bp处)有一个的0RF，在ORF的上游和下游分别有 253bp的5，UTR和234bp的3，UTR, 5' UTR区中存在7处可变转录起始位点(A1、G54、G57, A60、A76、A106、A129)禾口 4 个小 ORF (52 84、136 158、148 183、188 223bp)，3，UTR 区中存在4处可变poly (A)加尾位点(C3217、C3276、C33(14、Q322)，最末poly (A)加尾位点上游间隔190bp处的AAATAAA为典型poly (A)加尾信号。BoAHA10-2基因(SEQ ID No. 7)由20个内含子和21个外显子组成，20个内含子分别位于 423 511、632 731、831 913、 1052 1137、 1273 1333、 1514 1593、1801 1890、2011 2130、2251 2330、2454 2531、2637 2738、2884 2954、 3120 3215、3455 3527、3561 3654、3737 3815、3977 4046、4221 4301、4485 4575,4719 4812bp 处；BoAHA10_2mRNA(SEQ ID No. 8)在 254 3088 bp 处(对应于 BoAHA10-2基因的357 4909 bp处)有一个^35bp的0RF，在ORF的上游和下游分别有 253 bp的5，UTR和234 bp的3，UTR, 5' UTR区中存在2处可变转录起始位点(A1^57)和4 个小 ORF (52 84、134 158、148 183、188 223bp)，3，UTR 区中存在 6 处可变 poly (A) 加尾位点(T3242> T3267> T3283> C3301 > C3305> G33J，最末poly(A)加尾位点上游间隔190bp处的 AAATAAA为典型poly(A)加尾信号。BnAHAlO-I基因(SEQ ID No. 9)由20个内含子和21个外显子组成，20个内含子分别位于 423 511、632 731、831 913、 1052 1137、 1273 1333、 1514 1593、1801 1890、2011 2130、2251 2330、2454 2531、2637 2738、2884 2954、 3120 3215、3455 3527、3561 3656、3739 3817、3979 4048、4223 4303、4487 4577,4721 4812bp 处；BnAHA 10-ImRNA(SEQ ID No. 10)在 198 3032 bp 处(对应于 BnAHAlO-I基因的357 4909 bp处)有一个^35bp的0RF，在ORF的上游和下游分别有 197bp的5，UTR和234bp的3，UTR, 5' UTR区中存在7处可变转录起始位点(G1,A4,A18,A20, A23> A27, A71)和 3 个小 ORF(79 102,92 127,133 167bp)，3，UTR 区中存在 11 处可变 poly (A)力口尾似点(T3io5>C311 ！>C3161 >T3173>T3186>T32n>G32i6>C322o>G3244>G3263>G3266)，束末 poly (A) 加尾位点上游间隔190bp处的AAATAAA为典型poly (A)加尾信号。BnAHA10-2基因(SEQ ID No. 11)由21个内含子和22个外显子组成，21个内含子分别位于 47 284、421 506、627 7205、820 892、1031 1117、1253 1318、 1499 1579、1787 1877、1998 2065、2186 2268、2392 2469、2572 2674、 2820 2902、3068 3165、3405 3481、3515 3605、3688 3751、3913 3982、4157 4242,4426 4512、4656 4734 bp 处；BnAHAlO-2 mRNA(SEQ ID No. 12)在 116 2950bp 处(对应于BnAHA10-2基因的350 1991bp处)有一个2834bp的0RF，在ORF的上游和下游分别有116bp的5，UTR和^a3p的3，UTR, 5' UTR区中有两个可变转录起始位点⑷、 A6)和1个小ORF(34 54bp)，3，UTR区中没有发现可变poly (A)加尾位点，poly (A)加尾位点上游间隔209bp处的AATAAA为典型poly (A)加尾信号。与同源基因比较，ΒηΑΗΑΙΟ-2 基因在第2532bp (mRNA第1489bp)后缺失了一个碱基T，导致在ORF的中部发生移码突变， 理论上是一个假基因。BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族及AtAHAlO基因的核苷酸序列比对结果如图6所示，3个物种的6条AHA10基因之间具有较高的同源性，基因组序列的一致性为 85. 0 99. 8%，编码区序列的一致性为95. 7 99. 9% ；它们与AtAHAlO基因也具有很高的同源性，基因组序列的一致性为72. 4 74. 1%，编码区序列的一致性为89. 6 90. 2%; BnAHAlO-I与BoAHAIO-I基因组序列的一致性高达99. 8 %，编码区序列的一致性高达 99. 9%;BnAHA10-2与BrAHA10-2基因组序列的一致性高达92. 1 %，编码区序列的一致性高达 96. 9%oBrAHA10、BoAHA10、BnAHA10基因家族与拟南芥AHA基因家族mRNA的聚类分析如图 7所示，BnAHAlO-I mRNA先与BoAHA 10-1 mRNA聚在一起形成一个小类，再与ΒοΑΗΑΙΟ-2聚在一起形成一个大类；BnAHA10-2 mRNA先与BrAHA 10_2 mRNA聚在一起形成一个小组，再与AtAHAlO 聚在一起形成一个大类；BrAHAlO-I mRNA 单独成一类，但与 BnAHAlO-I、BoAHA10-l 和BoAHAlO-2 mRNA聚成的大类关系较近。聚类分析结果表明，BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO 基因家族6个基因成员均是拟南芥AtAHAlO基因的垂直同源基因；BnAHAlO-I基因起源于 BoAHAIO-I 基因，ΒηΑΗΑΙΟ-2 基因起源于 BrAHAlO-2 基因。2、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝AHAlO基因家族的编码蛋白序列分析BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族成员所编码蛋白的基本参数见表2。由于 ΒηΑΗΑΙΟ-2基因的编码区中间发生了移码突变，导致其编码蛋白C-端缺失，为了从蛋白水平研究各个基因间的系统进化关系，本实验将C-端缺失的氨基酸部分添加在ΒηΑΗΑΙΟ-2之后以表示ΒηΑΗΑΙΟ-2基因未移码突变前编码蛋白的状况，称为BnAHA10-2ori。表2 BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO家族蛋白的基本参数
权利要求
1.甘蓝AHAlO基因家族，其特征在于包括以下2个成员BoAHA10-l基因和BoAHA10-2 基因；所述BoAHAIO-I基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 6所示，BoAHA10-2基因的全长 cDNA序列如SEQ ID No. 8所示。
2.根据权利要求I所述的甘蓝AHAlO基因家族，其特征在于所述BoAHAIO-I基因的基因组序列如SEQ ID No. 5所示，BoAHA10-2基因的基因组序列如SEQ ID No. 7所示。
3.权利要求I或2所述甘蓝AHAlO基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用，所述种子性状为种皮成熟转色和种子大小。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述芸薹属作物种子性状的分子育种为甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种。
全文摘要
本发明公开了甘蓝AHA10基因家族及其应用，该基因家族包括二个成员BoAHA10-1基因(全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示)和BoAHA10-2基因(全长cDNA序列如SEQ IDNo.8所示)；该基因家族可应用于芸薹属作物种皮成熟转色和种子大小等种子性状的分子育种。
文档编号C12N15/29GK102533785SQ20121001852
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者冯瑜, 唐章林, 李加纳, 柴友荣, 殷家明, 王瑞, 谌利, 赵文军, 陈艳 申请人:西南大学