专利名称：一种脂肪干细胞的获取方法
技术领域：
本发明涉及一种脂肪干细胞的获取方法。
背景技术：
脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现脂肪干细胞在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等，同时具有较低的免疫原性和免疫调节功能，移植同种异基因ADSCs将不会引起强烈的免疫反应和后期的排斥反应，为ADSCs的同源异体移植提供了有利条件。此外，ADSCs来源广泛，可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术从任何人体内获得，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。因此，ADSCs成为目前研究的新热点，不论在再生医学还是基因治疗方面都具有重大的应用潜力。为了便于人们有效储存和使用脂肪干细胞资源，目前我公司建立了脂肪干细胞库，并取得了 “人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法”的国家专利(专利号:ZL201010120944. 4)。目前脂肪干细胞基本的分离方法是将脂肪组织通过胶原酶I消化孵育lh，消化产物滤网过滤去除未消化组织块，离心后用DMEM完全培养液重悬细胞，最后接种到细胞培养瓶中培养，4-5天后换新鲜培养液，待细胞长满后消化传代。我们在细胞提取培养的过程中发现，传统的细胞分离方法存在一些问题，比如I 型胶原酶消化细胞不够彻底，会有很多未消化的组织块存在；将细胞接种至培养瓶中培养时，PO代和Pl代培养的细胞中也有较多的组织块和大量杂细胞，导致P2>3代冻存时细胞纯度不够。为克服上述技术的不足，我们在实际操作中改进和优化了脂肪干细胞的分离方法，使得组织消化的更彻底，培养过程中纯度更高，从而保证了更为优质的种子细胞来源。
发明内容
本发明的目的在于克服以上分离提取技术的不足，而提供的一种脂肪干细胞的获取方法，其具有成本低、应用前景广阔，可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。本发明提供了一种脂肪干细胞的获取方法，其采用混合胶原酶对脂肪组织进行消化，所述混合胶原酶由I型胶原酶、II型胶原酶和IV型胶原酶组成。本发明的混合胶原酶的l%(m/v)母液配制方法为100ml D-hank' s溶液中加入 0. 5g I型胶原酶、0.25g II型胶原酶、0.25g IV型胶原酶。使用混合胶原酶消化脂肪组织时的终浓度为0. 15^0. 2%(m/v)。消化得到的脂肪干细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中培养。脂肪干细胞接种于培养瓶中培养后将原有培养液轻轻吸弃，更换新鲜培养液，继续培养24h 后再次换新鲜培养液。 优选地，所述脂肪干细胞为人脂肪干细胞。
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在一个特别优选的实施方案中，本发明的脂肪干细胞获取方法包括下列步骤 (1)配制混合胶原酶对原有胶原酶进行优化，在采用I型胶原酶的基础上按比例加入
了 II型胶原酶和IV型胶原酶，使得组织消化更为彻底；
1%混合胶原酶配制方法100ml D-hank' s溶液中加入0. 5g I型胶原酶、0. 25g II型胶原酶、0.25g IV型胶原酶。(2)获取和分离人脂肪组织取人脂肪组织，用PH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液。(3)胶原酶消化加入与所取脂肪组织等体积的0. 3^0.4% (m/v)混合胶原酶 D-Hank' s缓冲液消化(混合胶原酶终浓度为0. 15^0. 2% (m/v))。(4)组织块过滤将底层细胞用pH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复吹打， 清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，离心弃去上清液，获得干细胞。(5)培养人脂肪干细胞将获得的干细胞接种于培养瓶，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM的培养液，置于37° C、CO2含量为5%的培养箱中培养。(6)换液培养24h_4 !后将原有培养液轻轻吸弃，更换新鲜高糖DMEM完全培养液，弃去非贴壁细胞，将培养瓶放入37° C孵箱中培养；
继续培养24h后再次换新鲜培养液，将培养瓶放入37° C孵箱中培养。(7)传代待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0. 25%(m/v)胰酶-EDTA进行消化传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞；待细胞传至P2代冻存。(8)检测细胞冻存过程中进行免疫表型检测、生物学效力检测、细胞分化能力检测等以确定其是否达到合格标准。
图Ia为本发明实施例-1的人脂肪干细胞Ρ(ΓΡ2代培养照片，终浓度为0. 2%(m/v)胶原酶I消化获取的脂肪干细胞Ρ(ΓΡ2代细胞培养情况，其中A为分离培养后48h，B为Pl代接种后24h，C为P2代接种后24h。图Ib为本发明实施例-2的人脂肪干细胞Ρ(ΓΡ2代培养照片，终浓度为0. 15%(m/ ν)混合胶原酶消化获取的脂肪干细胞Ρ(ΓΡ2代细胞培养情况，其中A为分离培养后48h，B 为Pl代接种后24h, C为P2代接种后24h。图Ic为本发明实施例-3的人脂肪干细胞Ρ(ΓΡ2代培养照片，终浓度为0. 2% (m/v) 混合胶原酶Ρ(ΓΡ2代细胞培养情况，其中A为分离培养后48h，B为Pl代接种后Mh，C为 P2代接种后Mh。图Id为本发明实施例-4的人脂肪干细胞Ρ(ΓΡ2代培养照片，终浓度为0. 2%混合胶原酶Ρ(ΓΡ2代细胞培养，24h,48h后换液。其中A为分离培养24h换液后细胞形态，B为分离培养4 换液后细胞形态，C为Pl代接种后24h形态，D为P2代接种后24h形态。图2为本发明实施例-5的人脂肪干细胞向成骨、成脂细胞诱导分化实验结果，脂肪干细胞向成脂、成骨分化；A是油红-0染成脂诱导后细胞脂滴，B是茜素红-S染成骨诱导细胞。图3为本发明实施例-5的人脂肪干细胞对淋巴细胞增殖抑制实验结果，不同浓度 ADSC与人外周血单核细胞(hPBMC)共培养(M5 M1表示ADSC PBMC=O. 01 广1 1)组与不含ADSC的hPBMC单独培养组(对照组)相比，上清中TNF-α (人肿瘤坏死因子)量显著低于后者(#:Ρ<0. 01)，说明不同浓度ADSC对激活的外周血淋巴细胞分泌TNF-α均有抑制作用， 且呈正相关。图4为本发明实施例-5的人脂肪干细胞表型检测结果，脂肪干细胞表达CD73、 CD105、CD90、CD49d 等，百分率 >95%，不表达 CD19、CD14、CD34、CDllb、CD45 , HLA-DR 等百分率<2%，符合要求，其中FITC是异硫氰酸荧光素，PE是藻红蛋白。
具体实施例方式为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下采用终浓度分别为0. 15%(m/v)、0. 2%(m/v)的混合胶原酶进行脂肪消化，同时用终浓度为0. 2%(m/v) 胶原酶I消化脂肪进行对比，消化后的细胞接种至细胞培养瓶中培养，培养过程中对细胞状态进行记录。结合附图中细胞状态确定胶原酶消化较佳实施例，同时进一步优化原代细胞第一次换液的时间。在此基础上对依据本发明提出的人脂肪干细胞的获取方法进行特征及其功效说明。实施例-1
(1)取50mL脂肪组织，用pH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；
加入与所取脂肪组织等体积的0. 4% (m/v)胶原酶I进行消化，在37° C温度条件下均勻震荡消化60分钟，再置于离心机中以2000转/分钟的转速离心5分钟，去除表层脂肪。 将底层细胞用PH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织；组织过滤时可见有较多成块未完全消化组织存在； 将滤液以1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，获得SVF细胞。(2)将获得的SVF细胞加入IOmL含10%胎牛血清的高糖DMEM的培养液，接种于 T-75培养瓶，置于37°C、5%0)2饱和湿度的培养箱中培养。(3)培养4 后将原有培养液轻轻吸弃，更换含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液， 弃去非贴壁细胞，将培养瓶放入37° C孵箱中培养；
待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0. 25% (m/v)胰酶-EDTA进行消化，并按 2 X IOVcm2接种至75cm2细胞培养瓶中，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞。(4)对Ρ(ΓΡ2代细胞进行连续观察，如图Ia所示，PO代细胞在4 后可见有细胞开始贴壁生长，但杂细胞非常多，通过换液、消化传代后，Pl代杂细胞有所减少，传代至P2 后杂细胞进一步减少，但仍可见少量杂细胞存在。实施例-2
(1)取50mL脂肪组织，用pH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；
加入与所取脂肪组织等体积的0.3% (m/v)混合胶原酶进行消化，在37°C温度条件下均勻震荡消化60分钟，再置于离心机中以2000转/分钟的转速离心5分钟，去除表层脂肪。 将底层细胞用PH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织；组织过滤时可见有较多成块未完全消化组织存在；将滤液以1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，获得SVF细胞。(2)将获得的SVF细胞加入IOmL含10%胎牛血清的高糖DMEM的培养液，接种于 T-75培养瓶，置于37°C、5%0)2饱和湿度的培养箱中培养。(3)培养4 后将原有培养液轻轻吸弃，更换含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液， 弃去非贴壁细胞，将培养瓶放入37° C孵箱中培养；
待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0. 25%(m/v)胰酶-EDTA进行消化，并按按 2 X IOVcm2接种至75cm2细胞培养瓶中，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞。(4)对Ρ(ΓΡ2代细胞进行连续观察，如图Ib所示，PO代细胞在接种时大量杂细胞存在，培养4 后可见有细胞开始贴壁生长，Pl代杂细胞减少，传代至P2后杂细胞进一步减少，但仍可见杂细胞存在。实施例-3
(1)取50mL脂肪组织，用pH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；
加入与所取脂肪组织等体积的0.4% (m/v)混合胶原酶进行消化，在37° C温度条件下均勻震荡消化60分钟，再置于离心机中以2000转/分钟的转速离心5分钟，去除表层脂肪。将底层细胞用PH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织；组织过滤时可见未完全消化组织块较实施例-1 和-2中明显减少；
将滤液以1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，获得SVF细胞。(2)将获得的SVF细胞加入IOmL含10%胎牛血清的高糖DMEM的培养液，接种于 T-75培养瓶，置于37°C、5%0)2饱和湿度的培养箱中培养。(3)培养4 后将原有培养液轻轻吸弃，更换含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液， 弃去非贴壁细胞，将培养瓶放入37° C孵箱中培养；
待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0. 25%(m/v)胰酶-EDTA进行消化，并按按 2 X IOVcm2接种至75cm2细胞培养瓶中，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞。(4)对Ρ(ΓΡ2代细胞进行连续观察，如图Ic所示，PO代细胞培养24h后即可见有细胞开始贴壁生长，在4 换液后观察细胞发现杂细胞明显少于实施例-1和_2，Pl代杂细胞进一步减少，传代至P2后细胞呈梭形，状态良好，生长较为一致，而杂细胞基本不存在。实施例-4
(1)取50mL脂肪组织，用pH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；
加入与所取脂肪组织等体积的0.4% (m/v)混合胶原酶进行消化，在37° C温度条件下均勻震荡消化60分钟，再置于离心机中以2000转/分钟的转速离心5分钟，去除表层脂肪。 将底层细胞用PH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液， 获得SVF细胞。(2)将获得的SVF细胞加入IOmL含10%胎牛血清的高糖DMEM的培养液，接种于 T-75培养瓶，置于37°C、5%0)2饱和湿度的培养箱中培养。(3)培养24h后观察细胞状态，可见有少量细胞贴壁，将原有培养液轻轻吸弃，更换含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，弃去非贴壁细胞，将培养瓶放入37° C孵箱中培养； 继续培养24h后，对培养的脂肪干细胞再次更换含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液， 弃去非贴壁细胞，将培养瓶放入37° C孵箱中培养；
待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0. 25%(m/v)胰酶-EDTA进行消化，并按按 2 X IOVcm2接种至75cm2细胞培养瓶中，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞。(4)对Ρ(ΓΡ2代细胞进行连续观察，如图Id所示，细胞原代培养24h后即有少量细胞贴壁，此时更换培养液，将未贴壁细胞去除，继续培养24h后再次更换新鲜培养液后，杂细胞进一步减少，细胞传代至Pl代后基本没有杂细胞存在，培养至P2代后细胞纯度进一步提尚。这种方法虽然会去除掉部分未贴壁的脂肪干细胞，但同时杂细胞和组织块很快的被洗掉，细胞在新鲜的环境中可以更快的自我更新，得到的细胞纯度更高。实施例-5
用终浓度为0. 2%(m/v)的混合胶原酶消化脂肪并分离获取脂肪干细胞后，进行免疫表型检测、生物学效力检测、细胞分化能力检测等以确定其是否达到合格标准。其中细胞分化能力检测是指在诱导培养条件下，脂肪干细胞向脂肪、成骨分化能力的检测，判定标准为向脂肪和成骨细胞分化成功的视为合格细胞。如图2所示，脂肪干细胞分别加入成脂、成骨诱导分化培养液诱导分化14天后，分别用油红-0染色、茜素红-S染色，染色结果表明，成脂诱导后的细胞产生了脂滴并且经油红-0染色后脂滴为红色，说明脂肪干细胞向成脂诱导成功；而成骨诱导后的细胞产生了大量钙盐并且可用茜素红-S染为红色，说明脂肪干细胞向成骨诱导成功。其中生物学效力检测是将脂肪干细胞与PBMC (外周血单个核细胞)共培养，加入 PHA (英文全称phytohaemagglutinin，中文全称植物血凝素)对PBMC进行刺激，在培养结束后对培养液上清中的TNF- α值进行ELISA定量检测，判定标准为人脂肪成体干细胞与 PBMC共培养后，能显著抑制后者增殖(Ρ<0. 05)。结果发现不同浓度ADSC与人外周血单核细胞(hPBMC)共培养(M5 Ml表示ADSC:PBMC=0. 01 Γ 1)组与不含ADSC的hPBMC单独培养组(对照组)相比，上清中TNF-α量显著低于后者(Ρ<0. 01)，说明不同浓度ADSC对激活的外周血淋巴细胞分泌TNF-α均有抑制作用，且与脂肪干细胞的浓度呈正相关，说明脂肪干细胞免疫调节作用符合标准，如图3所示。免疫表型检测是用直接免疫荧光法检测，所用抗体为小鼠抗人的单克隆抗体 CD29、CD44、CD73、CD90、CD14、CD31、CD45、CD49d、HLA-DR。细胞用 D-Hank，s 液洗后加入抗体，在4° C温度下孵育30分钟，再用D-Hank’ s洗细胞两次，用500 μ 1 D-Hank' s吹打、混勻细胞，之后用流式细胞仪检测。检测结果如图4所示，脂肪成体干细胞中的CD19、CD34、 CD14、CDllb, CD45 及 HLA-DR 呈阴性，小于 2% ； CD73、CD90、CD105 和 CD49d 呈阳性，大于 95%，该脂肪干细胞视为合格细胞。在说明书中，本发明已参照其特定的实施例做了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的。
权利要求
1.一种脂肪干细胞获取方法，其特征在于采用混合胶原酶对脂肪组织进行消化，所述混合胶原酶由I型胶原酶、II型胶原酶和IV型胶原酶组成。
2.根据权利要求1的脂肪干细胞获取方法，所述混合胶原酶的l%(m/v)母液配制方法为:100ml D-hank，s溶液中加入0. 5g I型胶原酶、0. 25g II型胶原酶、0. 25g IV型胶原酶。
3.根据权利要求1的脂肪干细胞获取方法，使用所述混合胶原酶消化脂肪组织时的终浓度为 0. 15^0. 2%(m/v)。
4.根据权利要求3的脂肪干细胞获取方法，使用所述混合胶原酶消化脂肪组织时的终浓度为 0. 2%(m/v)。
5.根据权利要求1的脂肪干细胞获取方法，在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中培养消化得到的脂肪干细胞。
6.根据权利要求5的脂肪干细胞获取方法，消化得到的脂肪干细胞接种于培养瓶中培养Μ-4 !后将原有培养液轻轻吸弃，更换新鲜培养液，继续培养24h后再次换新鲜培养液。
7.根据权利要求6的脂肪干细胞获取方法，消化得到的脂肪干细胞接种于培养瓶中培养24h后将原有培养液轻轻吸弃，更换新鲜培养液，继续培养24h后再次换新鲜培养液。
8.根据权利要求1-7中任一项的脂肪干细胞获取方法，所述脂肪干细胞为人脂肪干细胞。
9.根据权利要求8的脂肪干细胞获取方法，包括(1)配制l%(m/v)混合胶原酶母液100mlD-hank' s溶液中加入0. 5g I型胶原酶、 0. 25g II型胶原酶、0. 25g IV型胶原酶；(2)获取和分离人脂肪组织取人脂肪组织，用pH值为7.2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；(3)胶原酶消化加入与所取脂肪组织等体积的0.4%(m/v)混合胶原酶消化，再置于离心机中以2000转/分钟的转速离心5分钟，去除表层脂肪；(4)组织块过滤将底层细胞用pH值为7.2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以1000转/分钟离心 5分钟，弃去上清液，获得干细胞；(5)培养人脂肪干细胞将获得的干细胞按2XIOVcm2接种于培养瓶，加入IOmL含10% 胎牛血清的高糖DMEM培养液，置于37° C、CO2含量为5%的培养箱中培养；(6)换液培养24h后将原有培养液轻轻吸弃，更换新鲜的含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养液，弃去非贴壁细胞，将培养瓶放入37° C孵箱中培养；继续培养24h后再次换新鲜培养液，将培养瓶放入37° C孵箱中培养；(7)传代待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0.25%(m/v)胰酶-EDTA进行消化， 并按1 :3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；待细胞传至P2代冻存；(8)检测细胞冻存过程中进行免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、 细胞分化能力检测等以确定其是否达到合格标准。
全文摘要
本发明涉及一种脂肪干细胞的获取方法。具体的，本发明采用混合胶原酶对脂肪组织进行消化，在培养液中培养消化得到的脂肪干细胞，经过换液，传代，检测制得合格脂肪干细胞。本发明克服了传统的细胞分离方法中存在的胶原酶消化细胞不够彻底，细胞纯度不够的问题，改进和优化了脂肪干细胞的分离方法，使得组织消化的更彻底，培养过程中纯度更高，从而保证了更为优质的种子细胞来源。
文档编号C12N5/0775GK102443566SQ201210018269
公开日2012年5月9日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者刘广洋, 刘拥军, 朱德琳, 王斌, 聂艳波 申请人:天津和泽干细胞科技有限公司