专利名称：功能性微生物多样性分析用引物和使用该引物的多重扩增的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及功能性微生物多样性分析用引物和使用该引物的多重扩增，具体地说，涉及功能性微生物多样性分析用针对β-葡萄糖苷水解酶基因的引物和使用所述引物的多重扩增。
背景技术：
β_葡萄糖苷水解酶是微生物降解纤维素反应中的限速酶，他作用于由葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶分解纤维素产生的纤维二糖分子和一些更小的寡聚糖分子，将其水解生成葡萄糖分子供微生物利用，因此β-葡萄糖苷水解酶在自然界碳循环中发挥着重要的作用。自然界中能产生葡萄糖苷水解酶的微生物种类繁多，不同微生物的葡萄糖苷水解酶按其分子结构特征分属为配糖水解酶家族I (GHl)和配糖水解酶家族3 (GH3)两类，同一家族中的葡聚糖苷酶基因同源性较高，这使葡萄糖苷水解酶基因具备了作为分子标记基因应用于复杂微生态环境中功能性微生物群落多样性的研究。本研究通过数据库获得不同微生物β-葡萄糖苷水解酶基因序列，经DNAMAN6. O软件进行序列同源性比对后分别设计β_葡萄糖苷水解酶GHl家族的通用简并引物，和β -葡萄糖苷水解酶GH3家族细菌、放线菌的通用简并引物，以及β -葡萄糖苷水解酶GH3家族真菌的通用简并引物。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种功能性微生物多样性分析用引物和使用该引物的多重扩增，所述引物能良好的反应实验对象中参与降解纤维素的功能性微生物的多样性，可以适用于来源于土壤，沉积物，人畜胃肠道等环境样品的分析。其技术方案为一种功能性微生物多样性分析用引物，选择通用简并引物3对GH1F和GHlR-GC ；GH3BR 和 GH3BF-GC ；GH3ER 和 GH3EF-GC。进一步优选，所述通用简并引物为GHlF和GH1R-GC。进一步优选，所述通用简并引物为GH3BR和GH3BF-GC。进一步优选，所述通用简并引物为GH3ER和GH3EF-GC。一种多重扩增检测方法所述方法用于来源土壤，沉积物，人畜胃肠道的环境样品的分析，该方法包括本发明所述的引物进行扩增。具体方法如下β -葡萄糖苷水解酶GHl家族基因的PCR扩增(I)弓丨物选择通用简并引物GHlF和GHlR-GC(2)反应体系及反应参数模板为纯化后的DNA
IOxPCRbufFer5μ
dNTP4μ
模板Ιμ
Taq 酶0.5pL
GHlF0.5μ
GHlR-GC0.5μ 加灭菌的去离子水补充反应体系，总体积为50 μ L(3)反 应条件
94°C预变性3min
94°C 变性Imin
47.3°C 退火Imin
72°C 延伸45 S
72°C终延伸IOmin35个循环后1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。β -葡萄糖苷水解酶GH3家族(细菌来源)基因的PCR扩增(I)引物选择通用简并引物GH3BR和GH3BF-GC(2)反应体系及反应参数模板为纯化后的DNA
IOxPCR buffer5μ
dNTP4μ
模板I μι
Taq 酶0.5pL
GH3BR0.5μ
GH3BF-GC0.5μ 加灭菌的去离子水补充反应体系，总体积为50 μ L(3)反应条件
94°C预变性3min
94°C 变性Imin
52°C 退火Imin
72 延伸45S
72°C终延伸IOmin35个循环后1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。β -葡萄糖苷水解酶GH3家族(真菌来源)基因的PCR扩增(I)引物选择通用简并引物GH3ER和GH3EF-GC(2)反应体系及反应参数模板为纯化后的DNAIOxPCRbuffer5μ
dNTP4μ
模板Ιμ
Taq 酶0.5μι
GH3ER0.5 μι
GH3EF-GC0.5μ
加灭菌的去离子水补充反应体系，总体积为50 μ L(3)反应条件
94°C预变性3min
94°C 变性Imin
57.2 °C 退火Imin
72°C 延伸45 S
72°C终延伸IOmin35个循环后1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。样品DNA的提取改进的细菌基因组DNA的提取方法DNA 提取液的配制100mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L EDTA，100mmol/L 磷酸钠，I. 5mol/LNaCl, 1% CTAB, pH8. 0(I)称取3g新鲜的堆肥样品，加入13. 5mLDNA提取液中；(2)加入50 μ L的蛋白酶K(20mg/mL)，于225r/min摇床上37°C摇动30min ;再加入I. 5mL的20% SDS，65°C水浴I. 5h，每隔10 20min颠倒混匀一次；(3)室温6，000r/min离心IOmin,收集上清转移到50mL离心管中，沉淀加入4. 5mL提取液和20%的SDS0. 5mL，涡旋震荡20s，65°C水浴IOmin ；(4)室温6，000r/min离心IOmin,收集上清合并于上次上清。重复上述操作，收集上清与前两次上清合并；(5)上清与等体积的氯仿异戍醇(24 I体积比)充分混合,6，000r/min离心IOmin,吸取上层水相转移至另一 50mL离心管中；(6)以0. 6倍体积的异丙醇室温沉淀Ih,室温16，000r/min离心15min,收集核酸
沉淀；(7)用预冷的70%乙醇洗涤沉淀，用200 μ L的TE溶解沉淀。真菌基因组DNA的提取(I)称取0. 5g玻璃珠放入I. 5mL的离心管中，加入0. 4g的样品，加入ImlBufferSLX/巯基乙醇。在漩涡震荡器上震荡5min ；(2)在70°C水浴中放置lOmin，每隔2 3min混匀一次。3000 5000r/min室温离心5min,转移800 μ L的上清液到一个新的2mL的离心管中,加入270 μ L的buffer SP2震荡30S混合均匀；(3)冰浴5min,在13000r/min4°C离心5min,转移上清到一个新的2mL的离心管中，加0. 7体积的异丙醇，充分混匀(来回颠倒离心管20次)，4°C 13000r/min离心IOmin用来沉淀DNA ；(4)小心弃掉上清，确定没有将DNA沉淀吸出，用滤纸将液体吸干，加200 μ LElutionBuffer至离心管中，震荡IOS后加入50 μ L的HTR Reagent (使用前要摇勻)，震荡混匀IOS ；
(5)室温放置2min, 13000r/min离心2min ;转移上清至一新的I. 5mL的离心管中，加入等体积的XP2 Buffer，震荡混匀IOS ；(6)将上述离心管中液体的700 μ L放置到提供的HiBind DNA column中，室温10000r/min离心lmin，弃掉上清液，将柱子重新放回收集管中，重复一次后加300 μ L ΧΡ2Buffer,室温 10000r/min 离心 Imin ；(7)倒掉上清液，再将柱子放回新的收集管中，再用700 μ L用无水乙醇稀释过的SPffffash Buffer, 10000r/min 离心 lmin,倒掉上清液，重复再加 700 μ L 的 SPW Wash Buffer后离心；(8)弃掉液体将柱子放入一个空的收集管中13000r/min室温离心2min,这一步骤很重要，处理不当会影响下游操作；(9)将柱子放置到新的I. 5mL的离心管中，加入30 μ L的去离子，13000r/min离心Imin洗脱DNA，重复一次。变性梯度凝胶电泳采用8%的聚丙烯酰胺凝胶，其中尿素浓度40% 70%。电泳采用D_code DGGE系统(Bio-Rad)，电泳缓冲液为1XTAE，在130V固定电压下电泳17h，进行硝酸银染色。条带的克隆序列分析从DGGE胶中选择特异条带切下，用去离水冲洗净后放入灭菌离心管中，加30 μ L的去离子水，放于4°C冰箱12-14h ；用测序引物(不带GC夹子)再次扩增，扩增产物与PMD18-T载体连接后转化感受态细胞，提取质粒DNA后进行双酶切鉴定，将阳性克隆菌液送测序公司测序。与现有技术相比，本发明的有益效果为本发明提供的引物具有很好的通用性和实用性，能良好的反应实验对象中参与降解纤维素的功能性微生物的多样性，可以适用于来源于土壤，沉积物，人畜胃肠道等环境样品的分析。
图I是堆肥样品总DNA中β -glucosidase基因GHl家族的PCR扩增结果图；图2是自然堆肥β -葡萄糖苷水解酶GHl家族DGGE图谱；图3是堆肥样品总DNA中β -glucosidase基因GH3家族(细菌)的PCR扩增结果;图4是自然堆肥β -葡萄糖苷水解酶GH3家族(细菌)DGGE图谱；图5堆肥样品总DNA中β -glucosidase基因GH3家族(真菌)的PCR扩增结果；图6自然堆肥β -葡萄糖苷水解酶GH31家族(真菌)DGGE图谱。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细地说明。本发明通过数据库获得不同微生物β -葡萄糖苷水解酶基因序列，经DNAMAN6. O软件进行序列同源性比对后分别设计β_葡萄糖苷水解酶GHl家族的通用简并引物(GH1F，GH1R，GH1R-GC)，和β -葡萄糖苷水解酶GH3家族细菌、放线菌的通用简并引物(GH3BF，GH3BR, GH3BF-GC)以及β -葡萄糖苷水解酶GH3家族真菌的通用简并引物(GH3EF，GH3ER，GH3EF-GC)。β -葡萄糖苷水解酶GHl家族基因阳性微生物群落的组成简并引物扩增β -葡萄糖苷水解酶基因(GH-1家族)得到约400bp的目的片段，反应特异性好。结果显示堆肥样品DNA中目的条带扩增效果见图I。从图2中可以观察到堆肥第3-12天(即高温期的前期)条带与堆肥其他时期明显不同。堆肥第14-26天(即高温期的后期及降温期)条带图谱变化不大，同高温期的前期条带图谱差别明显。在高温堆肥处理农业固体废弃物过程中，高温期前期多糖和淀粉类等易分解物质降解迅速，而这一时期纤维素分解缓慢，随着堆肥进程的发展易分解的有机质分解殆尽后纤维素类物质开始大量为微生物所分解利用。这解释了本研究中堆肥高温期β -葡萄糖苷水解酶GHl家族条带的变化趋势，即高温期后期及降温期条带的指示菌与纤维素类物质分解有关联。堆肥第31天堆体进入腐熟期，之前出现的条带消失且没有新条带出现，指示尽管该时期仍为纤维素类物质快速分解期，但没有或很少有葡萄糖苷水解酶GHl家族条带指示菌参与，这在PCR结果中已有体现。β -葡萄糖苷水解酶GH3家族基因阳性微生物群落的组成简并引物扩增β_葡萄糖苷水解酶基因(GH-3家族原核微生物来源)得到约370bp的目的片段，反应特异性好。结果显示堆肥第20，22，26，31天样品DNA中目的条带扩增效果不明显见图3。从图4中可以观察到堆肥的不同时期即高温期前期和高温期后期及降温腐熟期图谱条带区别明显，结合PCR结果可知在纤维素物质快速降解的时期(即高温期中后期和降温腐熟期)，具有β -葡萄糖苷水解酶基因GH-3家族的原核微生物没有或有很少种类和数量的细菌参与纤维素物质的分解。简并引物扩增葡萄糖苷水解酶基因(GH-3家族真核微生物来源)得到约500bp的目的片段，反应特异性好。结果显示堆肥第20，22，26，31天样品DNA中目的条带扩增特异性好见图5。从图6中可以观察到堆肥的高温期末期和降温腐熟期条带变化不大，降温腐熟期条带多样性略有增加，这与一般好氧堆肥进程中真菌菌群的动态变化是一致的，即高温期数量降低，降温腐熟期数量及种类增加。表明具有β_葡萄糖苷水解酶基因GH-3家族的真菌在堆肥的高温期后期和降温期参与纤维素的分解，并取代细菌在堆肥的低温阶段即第二中温期发挥重要的功能。附本发明所涉及的引物序列GH_3_E 家族上游引物GH3EF(750bp)5 — 3 :ggtggtcgcRRYtggga5 — 3 ggtggtcgc (ag) (ag) (ct)tgggaCN 102618632 A i^sdt6/6 矧
〔0083〕 T"絲 2t/s3ER(1210bp)
I--I0084I——I5 — 3 :ccaggcatcggWcatRtc〔0085U 5 丨 3 :ccaggcatcgg (ta) cat (ag) tc〔0§6U ^:ga(tc)atg(at)ccgatgcctgg〔0087U S-3-B 00〔0088〕 ±絲cml 蓉 S3BFI--I0089I——I5 — 3 :ttcggcgaaga (tc) cc〔0090U 5 — 3 :ttcggcgaagaYcc〔0091〕 ± 絲cml 蓉 S3BFGC
I--I0092I——I"CGcccGccGcGcGcGGcGGGcGGGGcGGGGGCACGGGttCggCgaagaYCC T* 絲cml 蓉§BR
〔0093U 5 丨 3 :acgcctt(ct) (ga) (at)a(agoc〔0094U 5 13 :acgccttYRWaRcc〔olu S-I 00〔0096Uhr^slF
I--I0097I——I5 — 3 :cctaccagat (tc) ga (ag) gg 16bp SocI--I0098I——I5 — 3 :cctaccagatYgaRgg 16bp 6°°0c〔0099〕 T*絲 SIR
I--lolos5 丨 3 :gaggaag (ag) tccca (ag) tg 16bp 64DCI--I0101U gig :§RRaaRRtcccaRtR 16bp 640c
OO
权利要求
1.一种功能性微生物多样性分析用引物，其特征在于，选择通用简并引物3对GHlR-GC ；GH3BR 和 GH3BF-GC ；GH3ER 和 GH3EF-GC。
2.根据权利要求I所述的功能性微生物多样性分析用引物，其特征在于，所述通用简并引物为GHlF和GH1R-GC。
3.根据权利要求I所述的功能性微生物多样性分析用引物，其特征在于，所述通用简并引物为GH3BR和GH3BF-GC。
4.根据权利要求I所述的功能性微生物多样性分析用引物，其特征在于，所述通用简并引物为GH3ER和GH3EF-GC。
5.一种多重扩增检测方法，其特征在于，所述方法用于来源土壤，沉积物，人畜胃肠道的环境样品的分析，该方法包括利用权利要求1-4任一项所述的引物进行扩增。
全文摘要
本发明公开了一种功能性微生物多样性分析用引物和使用该引物的多重扩增，涉及3对用于功能性微生物多样性分析的针对β-葡萄糖苷水解酶基因的引物。经DNAMAN6.0软件进行序列同源性比对后分别设计β-葡萄糖苷水解酶GH1家族的通用简并引物GH1F，GH1R，GH1R-GC，和β-葡萄糖苷水解酶GH3家族细菌、放线菌的通用简并引物GH3BF，GH3BR，GH3BF-GC，以及β-葡萄糖苷水解酶GH3家族真菌的通用简并引物GH3EF，GH3ER，GH3EF-GC，本发明提供的引物具有很好的通用性和实用性，能良好的反应实验对象中参与降解纤维素的功能性微生物的多样性，可以适用于来源于土壤，沉积物，人畜胃肠道等环境样品的分析。
文档编号C12N15/11GK102618632SQ20121001753
公开日2012年8月1日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者刘华晶, 徐杰, 李洪涛, 许修宏, 马波 申请人:东北农业大学