专利名称：喉癌自发性颈部淋巴结转移动物模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症动物模型领域；具体地，本发明涉及喉癌自发性颈部淋巴结转移动物模型。
背景技术：
喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一，以鳞状细胞癌最常见，占95%以上，近年来发病率有上升趋势，喉癌容易发生局部侵袭和颈部淋巴结转移，同其他恶性肿瘤患者一样，喉癌患者多数死于肿瘤复发和转移，但喉癌侵袭、转移机制目前尚不清楚，本发明通过建立喉癌自发颈部淋巴结转移模型，筛选出高侵袭性喉癌细胞，为研究喉癌侵袭、转移机制奠定基础。
发明内容
本发明涉及一种喉癌自发性颈部淋巴结转移动物模型，该动物模型的建立方法以及获得高转移性喉癌细胞的方法。在一个实施方案中，本发明涉及一种喉癌细胞系在制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及一种喉癌细胞系在制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型中的用途，其中所述喉癌细胞系是喉鳞癌细胞系。在一个实施方案中，本发明涉及一种喉癌细胞系在制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型中的用途，其中所述喉癌细胞系是人喉鳞癌细胞系HEP-2。在一个实施方案中，本发明涉及一种喉癌细胞系在制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型中的用途，其中所述喉癌细胞系是人喉鳞癌细胞系HEP-2，其中所述非人动物是小鼠。在一个实施方案中，本发明涉及一种喉癌细胞系在制备产生高转移性喉癌细胞的试剂盒中的用途，其中所述高转移性喉癌细胞比所述喉癌细胞系具有更高的转移性，所述试剂盒中还包含培养基、麻醉剂等。在一个实施方案中，本发明涉及一种制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型的方法，其包括如下步骤:
(a)将喉癌细胞系接种于非人动物舌缘粘膜下；
(b)待非人动物非人动物舌部成瘤、消瘦漸临死亡时,处死非人动物,取非人动物颈部肿大淋巴结；
(C)应用病理学方法鉴定舌部肿物及颈部肿大淋巴结是否为肿瘤细胞浸润。在一个实施方案中，本发明涉及一种制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型的方法，其包括如下步骤:
(a)将喉癌细胞系接种于非人动物舌缘粘膜下；
(b)待非人动物非人动物 舌部成瘤、消瘦漸临死亡时,处死非人动物,取非人动物颈部肿大淋巴结；
(C)应用病理学方法鉴定舌部肿物及颈部肿大淋巴结是否为肿瘤细胞浸润；
其中所述喉癌细胞系是喉鳞癌细胞系。在一个实施方案中，本发明涉及一种制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型的方法，其包括如下步骤:
(a)将喉癌细胞系接种于非人动物舌缘粘膜下；
(b)待非人动物非人动物舌部成瘤、消瘦漸临死亡时,处死非人动物,取非人动物颈部肿大淋巴结；
(C)应用病理学方法鉴定舌部肿物及颈部肿大淋巴结是否为肿瘤细胞浸润；
其中所述喉鱗癌细胞系是是人喉鱗癌细胞系HEP-2。在一个实施方案中，本发明涉及一种制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型的方法，其包括如下步骤:
(a)将喉癌细胞系接种于裸小鼠舌缘粘膜下；
(b)待裸小鼠舌部成瘤、消瘦濒临死亡时，处死裸小鼠，取裸小鼠颈部肿大淋巴结；
(c)应用病理学方法鉴定舌部肿物及颈部肿大淋巴结是否为肿瘤细胞浸润。在一个实施方案中，本发明涉及一种制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型的方法，其包括如下步骤:
(a)将喉癌细胞系接种于裸小鼠舌缘粘膜下；
(b)待裸小鼠舌部成瘤、消瘦濒临死亡时，处死裸小鼠，取裸小鼠颈部肿大淋巴结；
(c)应用病理学方法鉴定舌部肿物及颈部肿大淋巴结是否为肿瘤细胞浸润；
其中所述喉癌细胞系是是人喉鱗癌细胞系HEP-2。在一个实施方案中，本发明涉及一种制备高转移性喉癌细胞的方法，其包括如下步骤:
(a)将喉癌细胞系接种于非人动物舌缘粘膜下；
(b)待非人动物舌部成瘤、消瘦濒临死亡时，处死非人动物，无菌取非人动物颈部肿大淋巴结，分离并培养转移到颈部淋巴结的喉癌细胞；
(C)将所述转移到颈部淋巴结的喉癌细胞重复接种到非人动物舌部，如步骤(b)中所述分离、培养转移到颈部淋巴结的喉癌细胞；
Cd)任选地重复(C)步骤一次或多次；
Ce)筛选出高转移性喉癌细胞，验证所获喉癌细胞源于亲本细胞系；
其中所述高转移性喉癌细胞比(a)中所述喉癌细胞系具有更高的转移性。在一个实施方案中，本发明涉及一种制备高转移性喉癌细胞的方法，其包括如下步骤:
(a)将喉癌细胞系接种于非人动物舌缘粘膜下；
(b)待非人动物舌部成瘤、消瘦濒临死亡时，处死非人动物，无菌取非人动物颈部肿大淋巴结，分离并培养转移到颈部淋巴结的喉癌细胞；
(C)将所述转移到颈部淋巴结的喉癌细胞重复接种到非人动物舌部，如步骤(b)中所述分离、培养转移到颈部淋巴结的喉癌细胞； Cd)任选地重复(C)步骤一次或多次；(e)筛选出高转移性喉癌细胞，用PCR检测来验证所获喉癌细胞源于亲本细胞系；
其中所述高转移性喉癌细胞比(a)中所述喉癌细胞系具有更高的转移性。在一个实施方案中，本发明涉及一种制备高转移性喉癌细胞的方法，其包括如下步骤:
(a)将喉癌细胞系接种于非人动物舌缘粘膜下；
(b)待非人动物舌部成瘤、消瘦濒临死亡时，处死非人动物，无菌取非人动物颈部肿大淋巴结，分离并培养转移到颈部淋巴结的喉癌细胞；
(C)将所述转移到颈部淋巴结的喉癌细胞重复接种到非人动物舌部，如步骤(b)中所述分离、培养转移到颈部淋巴结的喉癌细胞；
Cd)任选地重复(C)步骤一次或多次；
(e)筛选出高转移性喉癌细胞，通过PCT检测人特异性Alu序列来验证所获喉癌细胞源于亲本细胞系；
其中所述高转移性喉癌细胞比(a)中所述喉癌细胞系具有更高的转移性。在一个实施方案中，本发明涉及一种制备高转移性喉癌细胞的方法，其包括如下步骤:
(a)将喉癌细胞系接种于裸小鼠舌缘粘膜下；
(b)待裸小鼠舌部成瘤、消瘦濒临死亡时，处死裸小鼠，无菌取裸小鼠颈部肿大淋巴结，分离并培养转移到颈部淋巴结的喉癌细胞；
(c)将所述转移到颈部淋巴结的喉癌细胞重复接种到裸小鼠舌部，如步骤(b)中所述分离、培养转移到颈部淋巴结的喉癌细胞；
Cd)任选地重复(C)步骤一次或多次；
(e )筛选出高转移性喉癌细胞，通过PCT检测人特异性Alu序列来验证所获喉癌细胞源于亲本细胞系；
其中所述高转移性喉癌细胞比(a)中所述喉癌细胞系具有更高的转移性。除非本文另有定义，本发明相关使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学及免疫学相关使用的命名以及技术，是本领域众所周知且普遍使用的那些。除非另有说明，下面的术语应当理解为具有下述含义:
术语“非人动物”是指除智人iHomo sapiens)物种以外的其他任何模式动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、狗、大猩猩、黑猩猩等。术语“高转移性喉癌细胞”是指通过本发明获得的比接种于非人动物舌缘粘膜下所用的喉癌细胞系具有更高的转移性的喉癌细胞。
图1是裸小鼠舌部成瘤和颈部肿大淋巴结示意图。图2图示了裸 小鼠舌部和颈部淋巴结病理切片结果。图3图示了裸小鼠喉癌淋巴结转移模型获得的高转移性喉癌细胞。实施例在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例示出了实施本发明的简要方法，但不限定其所有可能变型。缩写含义如下:“min”表示分钟，“U”表示单位，Mg”表示微克，“g”表示克，“μ ”表示微升，“ml”表示毫升，“bp”表示碱基对。实施例1
喉鳞状细胞癌自发性颈部淋巴结转移动物模型的建立
本实施例所用实验动物如下:Bal/Bc裸小鼠，约4周龄，12-14g，雌雄不限(解放军军事医学科学院动物所提供)，其实验和饲养均在无特异性病原菌(specific pathogen free，SPF)、恒温(20-26°C )、恒湿(45%-50%)条件下的超净层流架中进行，灭菌水和灭菌饲料供动物自由摄入。本实施例所用喉鳞癌细胞如下:人喉鳞癌细胞HEP-2细胞系由北京协和医科大学基础医学细胞中心提供。HEP-2细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于370C，5%C02恒温培养箱中培养，稳定传代3-4代后，取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，无菌生理盐水调整细胞密度为1.5 XlOVml备用，台盼蓝染色确定活细胞数在95%以上。按35mg/kg体重腹腔注射1.25%戊巴比妥钠麻醉裸小鼠，成功麻醉后，应用50ul微量注射器，于每只裸小鼠舌缘粘膜下注射IOul细胞悬液，每次接种20只。随机选出两只裸小鼠不做任何处理作为对照。密切观察裸小鼠生长状态。待裸小鼠舌部成瘤，消瘦、濒临死亡时，处死裸小鼠，取舌部肿物及肿大的颈部淋巴结，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，常规HE染色，光镜下观察裸小鼠舌部成瘤和颈部淋巴结肿瘤转移情况。舌部成瘤和颈部肿大淋巴结的肉眼观察结果如下:裸小鼠舌缘粘膜下注射肿瘤细胞后约4周后，裸小鼠舌部明显成瘤，进食困难，身体消瘦、濒临死亡，处死裸小鼠，无菌条件下解剖颈部，可见一至数枚肿大淋巴结。舌部成瘤和颈部肿大淋巴结的病理结果如下:将实验组裸小鼠舌部肿物和肿大的淋巴结及对照组裸小鼠正常舌部和正常淋巴结全部收集，进行常规HE染色，普通光学显微镜下观察舌部成瘤和淋巴结肿瘤转移情况。结果显示，实验组裸小鼠舌缘粘膜下形成实体肿瘤，呈球形，喉癌细胞弥漫排列，体积较大，形态多样，核分裂异常。肿大淋巴结经染色后镜下观察，可见肿瘤细胞弥漫性浸润，正常淋巴结内部结构破坏(见图1 )。实施例2
转移到淋巴结的喉癌细胞的培养一高转移性喉鳞癌细胞的获得如实施例1中所述将人喉鳞癌细胞HEP-2细胞系注射于每只裸小鼠舌缘粘膜下，待裸小鼠消瘦濒临死亡时，处死裸小鼠，超净工作台内无菌取颈部淋巴结，150目筛网上剪碎淋巴结，PBS收集细胞，离心，含10%胎牛血清DMEM (青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml)培养液重悬细胞，常规培养于37°C、5% CO2培养箱内。将所得的转移到淋巴结的喉癌细胞培养物重复接种，同样方法获得易转移到淋巴结的喉癌细胞。两次接种成瘤情况及淋巴结转移比例见图2和表1。表权利要求
1.一种喉癌细胞系在制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述喉癌细胞系是喉鳞癌细胞系。
3.根据权利要求2的用途，其中所述喉鳞癌细胞系是人喉鳞癌细胞系HEP-2。
4.根据权利要求1的用途，其中所述非人动物是小鼠。
5.一种喉癌细胞系在制备产生高转移性喉癌细胞的试剂盒中的用途，其中所述高转移性喉癌细胞比所述喉癌细胞系具有更高的转移性。
6.一种制备喉癌自发性淋巴结转移非人动物模型的方法，其包括如下步骤: (a)将喉癌细胞系接种于非人动物舌缘粘膜下； (b)待非人动物舌部成瘤、消瘦濒临死亡时，处死非人动物，取非人动物颈部肿大淋巴结； (C)应用病理学方法鉴定舌部肿物及颈部肿大淋巴结是否为肿瘤细胞浸润。
7.一种制备高转移性喉癌细胞的方法，其包括如下步骤: Ca)将喉癌细胞系接种于非人动物舌缘粘膜下； (b)待非人动物舌部成瘤、消瘦濒临死亡时，处死非人动物，无菌取非人动物颈部肿大淋巴结，分离并培养转移到颈部淋巴结的喉癌细胞； (C)将所述转移到颈部淋巴结的喉癌细胞重复接种到非人动物舌部，如步骤(b)中所述，分离、培养转移 到颈部淋巴结的喉癌细胞； Cd)任选地重复(C)步骤一次或多次； Ce)筛选出高转移性喉癌细胞，验证所获喉癌细胞源于亲本细胞系； 其中所述高转移性喉癌细胞比(a)中所述喉癌细胞系具有更高的转移性。
8.根据权利要求7的方法，其中所述步骤(e)中验证所获喉癌细胞的方法是PCR检测。
9.根据权利要求8的方法，其中所述PCR检测是PCT检测人特异性Alu序列。
全文摘要
本发明涉及一种喉癌自发性颈部淋巴结转移动物模型，该动物模型的建立方法以及获得高转移性喉癌细胞的方法。
文档编号C12N5/09GK103215224SQ20121001706
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者刘明波, 陈立伟, 王嘉陵 申请人:中国人民解放军总医院