专利名称：一种针对人fascin-1基因的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种针对人fascin-Ι基因的siRNA及其应用。
背景技术：
喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，起源于喉黏膜上皮，病死率较高。据北美和欧洲流行病学研究显示，其发病率为7.0-13.2/10万人，近20年呈上升趋势。在肿瘤细胞的生物学特征中，以侵袭转移最为关键。据临床统计，有80%以上的肿瘤患者死于侵袭转移，而未有侵袭转移者，则预后较好。然而喉腔由于其解剖结构局限，并具有丰富淋巴组织等特点，使得喉鳞癌具有局部浸润及颈部淋巴结转移的恶性生物学行为，使得局部复发及转移成为患者5年内死亡的主要原因。fascin-1 (FSCN1)即聚束蛋白，是一种肌动蛋白结合蛋白，定位于染色体7p22,分子量为55kD，有两个与F-肌动蛋白结合位点，可通过增加细胞膜突起、改变细胞与细胞外基质的粘附以及通过细胞信号传导通路等途径促进肿瘤细胞侵袭转移。Exp Cell Res.2002，275(1):92-109.和 Gene Expr Patterns.2004，4(6):637-643 记载了现已知人类fascin有3种不同形式:fascin_l,主要表达于间叶组织和神经系统；fascin_2,特异表达于视网膜；fascin-3,在睾丸中特异表达。细胞骨架对上皮细胞迁移和黏附具有重要作用，在上皮源性肿瘤侵袭和转移过程中，细胞骨架不仅会重组变化，还可导致胞内信号传导异常，成为恶性增殖及侵袭转移的重要初始因素。fascin-Ι作为细胞骨架结构中的重要分子，不仅在肿瘤细胞多种恶性生物学行为中发挥重要作用，还与患者不良临床病理特征及预后相关。研究发现fascin-Ι在乳腺、卵巢、胰腺、胃、胆管、结肠等正常被覆单层柱状上皮中呈阴性表达，在食管复层鳞状上皮中，仅在基底层细胞中呈低表达，上层细胞中未见表达。fascin-Ι在交界性、原发性及转移性卵巢癌上皮病变中均出现表达，尤其是在转移性卵巢癌中表达更为弥漫；其在非小细胞肺癌中表达上调，并与肿瘤分化程度呈正相关，在大多血管癌栓中特有而普遍表达，尤其在发生对侧胸或远处转移的肺腺癌中与fascin-Ι弥漫表达明显相关；在结肠原位癌、浸润至肌层、全层癌组织，fascin-Ι表达逐渐增强，并且有区域淋巴结转移的结直肠癌中fascin-Ι表达阳性率明显高于无淋巴转移组，尤其是转移癌中fascin-Ι表达水平高于原位癌；在食管癌中fascin-Ι高表达与患者预后、肿瘤浸润深度及淋巴结转移相关。因此，fascin-Ι的确与上皮源性肿瘤的恶性程度及侵袭转移等恶性进展过程密切相关，fascin-Ι与喉鳞癌侵袭转移、复发及预后不良相关。RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA(double_stranded RNA, dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。其作用机制是=RNase III核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21-23nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),随后siRNA与RNA诱导沉默复 合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC)结合,解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学的研究中。然而目前还没有针对fascin-Ι基因设计的siRNA报道。申请人为了对肿瘤细胞fascin-Ι进行干扰,设计了针对fascin-Ι基因的siRNA,从而抑制肿瘤细胞恶性增殖、侵袭、转移的恶性生物学表型，可能成为肿瘤靶向治疗的有药物。
发明内容
本发明是为了解决肿瘤细胞fascin-Ι恶性增殖、侵袭、转移的问题，而提供了一种针对人fascin-Ι基因的siRNA及其应用，从而达到抑制其恶性增殖、侵袭、转移的恶性生物学表型，可能成为肿瘤靶向治疗的有药物的目的。本发明针对fascin-Ι基因设计siRNA,通过干扰技术,抑制fascin-Ι表达，通过突光实时定量PCR(qRT-PCR)，通过包含细胞活力、克隆形成、黏附能力、侵袭能力、迁移能力的细胞功能实验，评价本发明siRNA的沉默靶向基因fascin-Ι效果。本发明是通过以下技术方案实现的:
一种针对人fascin-Ι基因的siRNA，其序列为:
正义链:5' -CGACTATAACAAGGTGGCCATtt-3'
反义链:5' -ATGGCCACCTTGTTATAGTCGtt-3'。进一步地，所述的3'端悬挂由脱氧核苷组成的碱基TT，用于提高基因沉默效率以及siRNA的稳定性。本发明还进一步提供了将上述siRNA在制备治疗抗肿瘤的生物靶向制剂或者药物上的应用。fascin-Ι的RNA序列如序列I所示。与现有技术相比，本发明针对fascin-Ι基因表达的siRNA，可抑制肿瘤细胞恶性增殖、侵袭、转移的恶性生物学表型，可广泛用于抑制人肿瘤细胞系的恶性表型研究，用于制备治疗抗肿瘤的生物靶向制剂或者药物。
图1:原始状态下Hep-2及HOK细胞株中fascin-Ι相对表达量柱状 图2:N0.1-3 fascin-1 siRNA转染Hep-2后fascin-1相对表达量柱状 图 3:N0.1-3 fascin-1 siRNA 对 fascin-1 敲减率柱状 图4:Hep-2转染siRNA NC后粘附图 5:Hep-2 转染 N0.3 siRNA fascin-Ι 后粘附 图6:Hep-2转染siRNA NC后迁移能力 图7:Hep-2转染N0.3 siRNA fascin-Ι后迁移能力 图8:Hep-2转染siRNA NC后侵袭能力 图9:Hep-2转染N0.3 siRNA fascin-Ι后侵袭能力 图10:Hep-2转染N0.3 siRNA NC后平板克隆能力 图11:Hep-2转染N0.3 siRNA fascin-Ι后平板克隆能力 图12:!fep-2 分别转染siRNA NC及N0.3 siRNA fascin-Ι后细胞活力曲线图。
具体实施例方式本申请所涉及的全部实验经过山西医科大学科学研究伦理委员会批准。实施例1 fascin-Ι蛋白在喉鳞癌组织及对应正常癌旁黏膜组织中的表达 石蜡包埋组织行4 ym连续切片，脱蜡后水化；置柠檬酸盐缓冲液高压修复，3%过氧化
氢甲醇溶液封闭10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次；加封闭液10 min，一抗4°C孵育过夜；PBS Tween 20液洗3次，二抗孵育15 20 min，PBS洗3次，二氨基联苯胺(DAB)显色；苏木素复染并脱水封片；PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性标本肺鳞癌作阳性对照，血管内皮细胞作内对照；鼠抗人单抗fascin-1 (MS-1112)购自美国赛默飞世公司；MaxVision羊抗鼠二抗为福州迈新产品，封闭血清及DAB为武汉博士德产品。免疫组化评价标准:fascin_l:阳性细胞< 10%，I分；11% 50%，2分；51% 80%，3分；> 81%，4分。浅着色I分；中等着色2分；强着色3分。两者分数相加(2 7分)，共分为3组:阴性表达(不着色或< 10%细胞阳性着色，不考虑着色强度)，低表达(3分),高表达(4 7 分)(参见:Eur J Cancer Prev, 2010, 19:11-17.)。结论为fascin-1高表达不仅与喉鳞癌的恶性进展正相关，还预示着复发风险及预后不良(参见:中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2012，47 (10):841-847.)。实施例2喉鳞癌细胞株ifep-2及正常人口咽黏膜角化细胞株HOK中fascin-lmRNA及蛋白表达
一、细胞培养
将水浴 锅预热至37°C ;用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面；在超净工作台中按次序摆放无菌离心管、吸管、培养瓶等；取出冻存管；迅速解冻，迅速将冻存管投入到已经37°C预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体在2分钟内迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候，取出；用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内；制备细胞悬液，将细胞转移至一个15ml离心管内，逐渐加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管；加入培养基的量要达到IOml以上；在低速离心机上离心，以800rpm离心5分钟；吸去上清，然后用Iml培养基重悬细胞；将细胞悬液分装入培养皿内，将培养皿放入37°C培养箱内培养，换液的时间由细胞贴壁情况而定。Hep-2用含1%青霉素链霉素双抗，10%FBS (胎牛血清)的MEM培养基进行培养。HOK细胞(正常人口咽黏膜角化细胞)用含1%青霉素链霉素双抗，10%FBS (胎牛血清)的OKM培养基进行培养；Hep-2细胞系购自，HOK细胞系购自美国ScienCell ResearchLaboratory 公司。二、细胞传代
紫外线提前20 - 30min打开；关紫外灯，开灯，通气，点燃酒精灯；检查细胞生长状况；显微镜下观察各浓度下细胞生长状况(数量、形态、透亮度、贴壁情况)；用酒精棉对培养瓶外部进行擦拭；将培养基倒掉，加PBS冲洗一下，如不需传代，加入5ml新鲜培养基即可；传代加1.0ml 0.25%胰酶冲洗一下(快速)；放入37°C培养箱2_3分钟，轻敲瓶壁使大部分细胞脱落，加入3η (η为传代瓶数)ml培养基(MEM);用吸管轻柔吹打，尽量让细胞均匀分散开来，补足培养基3n ml，各取出3ml至新瓶中；放入C02培养箱(培养条件5% CO2、饱和湿度37。。)。
三、总RNA抽提
收集目标细胞，用EDPC配置的PBS液冲洗2-3次，加入Iml Trizol (Invitrogen)溶液，吹打混匀，使组织充分裂解，静置5min ;加入200μ I氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置2min ;4°C下，14，OOOg离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase-free EP管；沉淀RNA:加入等体积的异丙醇,轻柔地充分混勻，室温静置IOmin ;4°C下，14，OOOg离心lOmin，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗涤两次，超净台风干；加入60 μ I DEPC水溶解沉淀。四、去基因组
使用RNase-free的DNase (Promega公司)，按表I体系配置反应液，37°C消化30min,65。。灭活 IOmin。
权利要求
1.一种针对人fascin-1基因的siRNA,其特征在于,包括以下序列: 正义链:5' -CGACTATAACAAGGTGGCCATtt-3' 反义链:5' -ATGGCCACCTTGTTATAGTCGtt-3'。
2.根据权利要求1所述的针对人fascin-Ι基因的siRNA，其特征在于，序列3'端悬挂由脱氧核苷组成的碱基TT，用于提高基因沉默效率以及siRNA的稳定性。
3.权利要求1或2所述的针对人fascin -Ι基因的siRNA在制备治疗抗肿瘤的生物靶向药物上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种针对人fascin-1基因的siRNA及其应用，属于生物工程技术领域，解决肿瘤细胞fascin-1恶性增殖、侵袭、转移的问题。一种针对人fascin-1基因的siRNA，包括以下序列正义链5′-CGACTATAACAAGGTGGCCATtt-3′；反义链5′-ATGGCCACCTTGTTATAGTCGtt-3′。本发明针对fascin-1基因表达的siRNA，可抑制肿瘤细胞恶性增殖、侵袭、转移的恶性生物学表型，可广泛用于抑制人肿瘤细胞系的恶性表型研究，用于制备治疗抗肿瘤的生物靶向制剂或者药物。
文档编号A61P35/00GK103215268SQ20131000433
公开日2013年7月24日 申请日期2013年1月7日 优先权日2013年1月7日
发明者王斌全, 高伟, 张春明, 温树信, 皇甫辉, 陈钢钢, 张海利 申请人:山西医科大学第一医院