一种使牛trim5α基因沉默的siRNA及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了使牛trim5α基因沉默的干扰方法，siRNA序列，siRNA人慢病毒表达载体，复制缺陷型人慢病毒，人慢病毒感染的MDBK细胞。本发明的RNAi和siRNA慢病毒表达载体有效的干扰牛trim5α基因的表达，显著提高人慢病毒载体在牛肾传代细胞MDBK中的基因表达。本发明为牛病毒病相关基因功能和转基因牛培育的研究提供新的技术支持。CCTCC No. C20141162014.07.08
【专利说明】-种使牛trims a基因沉默的si RNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学领域，具体地说，本发明涉及一种牛trims a下调表达的 SiRNA及其应用。
[0002] 发明背景
[0003] 在RNA干扰技术出现W前，基因敲除（gene knockout)是主要的反向遗传学 (reverse genetics)研究手段，但其技术难度高，操作复杂，周期长。由于RNA干扰可W利 用SiRNA或SiRNA表达载体快速、经济、简便的同时又具有高度的序列专一性，可W特异地 使特定基因沉默，获得功能丧失或减低突变序列特异方式剔除目的基因表达，现在已经成 为探索基因功能的重要研究手段。在功能基因组研究中，需要对特定基因功能丧失或减低 突变，W确定其功能，因此RNA干扰可W作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研 究。
[0004] 大量研究表明，针对同一祀基因的不同SiRNA序列具有不同的沉默效率，要从具 有不同沉默效率的SiRNA序列中筛选出高效的SiRNA序列，运用RNAi技术更有效地沉默 祀基因，SiRNA序列的设计是关键环节。SiRNA序列在祀基因中的位置一般从祀基因起 始密码子AUG下游50?100个核巧酸开始搜寻理想的SiRNA序列，越靠近祀基因的3 ' 端，其基因沉默效果可能越好（McManus MT等.RNA，2002,8 (6) :842-850)。W前的研究表 明；不要W 5'非翻译区巧'UTR)和3'非翻译区（3' UTR)及起始密码子附近序列作 为设计SiRNA的模板，该些区域含有调节蛋白结合位点（如翻译起始复合物），调节蛋白 可与RNA诱导的沉默复合物巧ISC)竞争结合SiRNA序列，降低RNAi效应脚bashir SM 等.2002,26(2) =199-213);也要避开外显子与外显子的交界区域和单核巧酸多态性（SNP) 区域。但也有研究发现，在5' UTR中引入一个抑巧顺译的茎-环结构，该样可W改变mRNA 半衰期（Anthonisen IL 等.RNA，2001，7(7):1024 - 1033)。当 5'UTR 的序列中存在着碱 基配对时，就可形成发卡式或茎环状二级结构。该类结构会阻止核糖体小亚基的迁移，对 翻译起始具有顺式阻抑作用。因此运用RNAi技术作用于5' UTR或3' UTR序列，同样 可引起碑!基因沉默值oench JG 等.Genes Dev, 2003,17 (4) :438-442 ;Eckmann CR 等.Dev Cell, 20023(5) :697-710)，该些发现使SiRNA序列的筛选范围涉及到了基因全序列的非编 码区和编码区。
[0005] 目前常用的H种RNAi的研究策略如下；第一种是直接合成针对祀基因的SiRNA, 通过转染的方法使之进入细胞内，参与到RNAi途径，发挥使祀基因沉默的效应。二是构建 ShRNA的质粒表达载体转染细胞，在细胞内转录生成shRNA，利用细胞内的Dicer酶生成相 应的SiRNA,发挥RNAi作用。H是构建ShRNA的病毒表达载体，常用的病毒载体有腺病毒载 体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，利用了病毒感染细胞效率比较 高的特点，解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。利用病毒载体把ShRNA导入细胞，载体中 的U6启动子确保ShRNA总是表达；该种装载了 ShRNA载体可被传递到子代细胞中去，从而 使基因的沉默可被遗传。
[0006] 对哺乳动物细胞进行基因转移是基因功能及基因治疗研究中的重要环节。病毒 载体W其高的转染率等优点已被广泛应用。重组慢病毒是近年逐步发展起来的新型基 因转移载体，相比其它常用的病毒载体如逆转录病毒、痘病毒等具有较独特的优点，例如 可有效感染非分裂期细胞、具稳定整合能力、细胞毒性低、免疫反应小等（Joseph A等.J Virol, 2008, 82化）：3078-3089)。慢病毒载体目前已发展至第H代，在系统稳定性和安全 性等方面获得了很大提高，显示出巨大的应用潜力（Niemann H，Kues WA. R巧rod Fertil Dev, 2007,19化）：762-770.)。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有 些类型细胞用脂质体转染效果差，转移到细胞内的SiRNA半衰期短，体外合成SiRNA对基因 表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够 表达SiRNA的载体，然后转移到细胞内转录SiRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种 类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成SiRNA,在长期稳定表达载体的细胞 中，甚至可W发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的SiRNA表达载体中，是由RNA聚合 酶III启动子来指导RNA合成的，该是因为RNA聚合酶III有明确的起始和终止序列，而且合成 的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶III遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停 止，在转录产物3'端形成1 - 4个U。U6和化RNA启动子是两种RNA聚合酶III依赖的启动 子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达21ntRNA和SOntRNA茎环结 构（stem loop)。在SiRNA表达载体中，构成SiRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别 转录，然后两条链互补结合形成SiRNA ;也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA，shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶III启动子和4 - 5个T转录终止位点之间的茎环结 构序列，转录后即可折叠成具有1 - 4个U的3'突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工 成siRNA。慢病毒载体能够产生表达ShRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、 干细胞、受精卵W及分化的后代细胞中表达ShRNA,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中 特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究 基因功能，W及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。
[0007] 牛肾传代细胞（MDBK)是一种研究病毒感染增殖的常用细胞。MDBK细胞对小鼠 N型逆转录病毒和人1型HIV(Human immunodeficiency virus type)病毒的感染率极低， 在感染指数MOI为1的情况下，感染百分率不到1 % (Si, Z.等.Proc.化tl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103 (19)，7454-7459)，质粒载体的直接脂质体转染效率也很低，造成了 MD服 细胞对携带外源基因的小鼠N型逆转录病毒和人1型HIV病毒重组载体的转染效率低，外 源基因表达水平低下，使外源基因高水平稳定表达的转基因MD服细胞有效筛选成为费时 费力的工作。
【发明内容】
[0008] TRIMCTripartite motif)家族蛋白具有3个保守的结构域。该H个结构域从N端 至Ij C端的顺序依次是RING结构域（RING domain)、1个或2个B-box结构域、一个卷曲螺旋 结构域（Coiled-coil domain)，此外该家族还具有一个可变的C-末端，因此TRIM家族也 称为RBCC家族。自从1991年TRIM(RBCC)蛋白家族第一个成员XNF7克隆鉴定后，目前人 类基因组已发现和鉴定近70个TRIM蛋白成员。研究人员在建立能够被HIV-I感染并产生 致病作用的动物模型时，2004年在非人灵长动物旧世纪猴中首次发现了 trims a (Stremlau M，等.化化re, 2004, 427:848-853.)，在多种灵长类品系中如人、类人猿和新世纪猴中也 发现了 TRIMS基因的存在。在其他哺乳动物品系中如牛和兔亦存在TRIMS基因。TRIMS 基因具有多种可变剪接形式（TRIM5 a，目，Y，5，e等），trims a是各种剪接体中最 长的一个，是其中唯一 C端具有B30. 2 (PRYSPRY)结构域的剪接体，牛trims a的基因位 于15号染色体上，全长2630bp。目前有关trimSa的主要研究有；trimSa基因序列 (Ylinen, L M.等.2006, J. Virol. 80 (15)，7332-7338)、分子进化（Si, Z.等.Proc.化tl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103 (19)，7454-7459)、抗病毒感染作用（Li X 等.Virology, 2007 ; 366(2) : 2:34-244 ;Brass A L 等.Science, 2008, 3,19 (5865) :234-244 ;Diaz-Griffero F 等.J Virol, 2009:83 (20): 10737-10751)。研究表明部分TRIM蛋白具有抗病毒功能，尤其 是对逆转录病毒具有限制作用，并且参与了与天然免疫相关一系列生物过程。
[0009] 申请人:发现通过RNA干扰牛trims a基因表达能够有效地提高人慢病毒载体在牛 肾传代细胞中的基因表达。获得了牛trims a下调表达的SiRNA序列，SiRNA人慢病毒表 达载体，SiRNA复制缺陷型人慢病毒，SiRNA复制缺陷型人慢病毒感染MDBK细胞。
[0010] 本发明提供一种使牛trims a基因沉默的RNA干扰方法，其干扰牛trims a基因， 下调牛的trims a表达从而提高外源基因在MDBK细胞中的表达水平。
[0011] 本发明的RNA干扰方法使用选自牛trims a基因的特异SiRNA序列 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5'-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'、5'-CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5，-AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，，如沈Q ID No. I-No. 4。其中，5，-CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3 ' 干扰trim5a基因的5'-UTR非编码区，5'-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'， 5'-押0：441'〔4161'口'6〔464-3'和5'-46441641'口'6610：4464-3'干扰付11115〇基因的编码 区。
[001引 优选地，本发明的RNA干扰方法使用5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'作为SiRNA序 列。
[0013] 本发明提供一种牛trims a下调表达的SiRNA序列，其能够下调牛的trims a表 达从而提高外源基因在MDBK细胞中的表达水平。
[0014] 本发明提供一种使牛trims a下调表达的siRNA，所述SiRNA优选选自 牛 trimSa 基因（L0C505265)的特异 SiRNA 序列 5，-CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，、 5> -CTGTCAAGCCTGTATCACT-3>、5> -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3> 或 5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，。所述 SiRNA 特别优选选自 5, -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，。
[0015] 本发明还提供所述SiRNA序列用于制备一种trims a基因沉默的哺乳动物细胞的 用途。所述哺乳动物细胞优选为牛细胞。更优选地，所述哺乳动物细胞为MDBK细胞。
[0016] 本发明还提供一种SiRNA病毒表达载体，能够下调牛的trims a表达从而提高外 源基因在MDBK细胞中的表达水平。
[0017] 所述SiRNA病毒表达载体包含牛trims a下调表达的SiRNA序列，能够下调牛的 trims a表达从而提高外源基因在MD服细胞中的表达水平。所述SiRNA优选选自牛trims a 基因的特异 SiRNA 序列 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5' -CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'、 5, -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，。特别优选选自 5> -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3>。
[0018] 进一步地，本发明上述SiRNA病毒表达载体为慢病毒表达载体pLV-shRNA-puro、 pLVX-shRNAl、pLVX-shRNA2。优选为 pLV-shRNA-puro。
[0019] 进一步地，本发明上述SiRNA病毒表达载体为pLV-shRNA-trim5 a -337、 pLV-shRNA-trim5 a -480、pLV-shRNA-trim5 a -808、pLV-shRNA-trim5 a -1037。优选地 pLV-shRNA-trim5a -337。
[0020] 本发明还提供一种构建上述SiRNA病毒表达载体的方法，包括W下步骤：
[0021] (1)根据牛trims a基因（L0C505265)mRNA全序列筛选RNA干扰祀点，设计SiRNA 序列和对照随机序列，
[0022] (2)酶切病毒载体，
[0023] (3)合成接头引物，退火后连接到病毒载体，
[0024] (4)连接产物转染大肠杆菌感受态地5 a，培养过夜，
[00巧](5)挑取克隆进行PCR鉴定，获得测序正确的克隆，大提质粒定量后备用。
[0026] 进一步地，上述方法中SiRNA序列优选选自牛trims a基因（L0C505265) 的特异 SiRNA 序列 5，-CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，、5，-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3，、 5, -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，。特别优选选自 5> -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3>。
[0027] 上述构建方法中，病毒表达载体为慢病毒表达载体，优选为人慢病毒表达载体。优 选为 pLV-shRNA-puro、pLVX-shRNAl、pLVX-shRNA2。特别优选为 pLV-shRNA-puroo
[0028] 本发明还提供上述病毒表达载体在制备trims a基因沉默的哺乳动物细胞中的 用途。所述哺乳动物细胞优选为牛细胞。更优选地，所述哺乳动物细胞为MDBK细胞。
[0029] 本发明还提供一种trims a基因沉默的哺乳动物细胞。
[0030] 优选地，所述trims a基因沉默的细胞是牛细胞，更优选地MD服。
[0031] 进一步地，本发明的trim5a基因沉默的细胞优选是Nl、N2、N3和N14。更优选 为N14,该细胞株命名为牛trimSa基因沉默细胞株BTL2013,已于2014年7月8日保藏 于中国典型培养物保藏中也，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072,保藏编号为CCTCC No. C2014116。
[003引更进一步地，本发明的trims a基因沉默的哺乳动物细胞是用 SiRNA干扰，SiRNA优选自牛trims a基因（L0C505265)的特异SiRNA序列 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5'-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'、5'-CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5' -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'，特别优选地 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'。
[0033] 本发明的trims a基因沉默的哺乳动物细胞是用本发明的SiRNA人慢 病毒载体制备的复制缺陷性慢病毒感染获得。所述SiRNA人慢病毒表达载体 为 pLV-shRNA-trim5 a-337、pLV-shRNA-trim5 a-480、pLV-shRNA-trim5 a-808、 pLV-shRNA trims a -1037。优选地，所述trims a基因沉默的哺乳动物细胞是用 pLV-shRNA-trim5 a -337制备的复制缺陷性人慢病毒感染获得。
[0034] 本发明还提供一种获得trims a基因沉默的哺乳动物细胞的方法，其包括用本发 明的载体转染哺乳动物细胞，优选是牛细胞，更优选是MDBK细胞。
[00巧]本发明获得trims a基因沉默的哺乳动物细胞的方法包括W下步骤：
[0036] (1)本发明的SiRNA人慢病毒表达载体、P化载体和抑2载体H质粒与化Iyfect-V 转染试剂（购买于北京英茂盛业生物科技有限公司）用脂质体转染法共转染人胚肾细胞 肥K293T，获得SiRNA复制缺陷型人慢病毒。
[0037] (2)MD服细胞接种到24孔板，用高糖DMEM和重量百分比10%胎牛血清（购买 于美国Hyclone公司）的培养液培养MD服至细胞汇合度60%。取SiRNA复制缺陷型人 慢病毒（浓度约为1?5Xl〇7 TU/ml)100y 1，在室温下融化，加入培养液400y 1，，加入 polybrene(聚凝胺，购买于美国Sigma公司）至终浓度6]i g/ml，混匀制成SiRNA人慢病毒 感染液，用感染液替换MDBK细胞培养液。24小时后弃感染液，换新的含有终浓度7. 5 y g/ ml嘿岭霉素的DMEM进行连续培养。
[003引 （3)维持所述嘿岭霉素浓度2周直至每孔出现1-2个细胞克隆。
[0039] (4)将嘿岭霉素浓度减到3. 75 y g/ml，继续培养2周后将细胞克隆挑选到24孔板 继续培养。
[0040] (5)待细胞扩增后冻存并检测trims a基因表达。
[0041] 本发明的目的在于提供一种提高外源基因在MD服细胞中的表达水平的方法，其 包括在MD服细胞中导入本发明的人慢病毒载体。
[0042] 本发明还提供trims a基因沉默的哺乳动物细胞作为外源基因表达宿主的用途， 所述MDBK细胞中导入本发明的人慢病毒病毒载体。所述哺乳动物细胞优选为牛细胞。更 优选地，所述哺乳动物细胞为MD服细胞。更优选地，所述哺乳动物细胞为MD服细胞Nl、N2、 N3 和 N14,特别优选为 N14(CCTCC No. C2014116)。
[0043] 本发明的优点在于通过SiRNA沉默牛trims a基因表达，有效地提高人病毒载体 在牛肾传代细胞MDBK中的基因表达。导入本发明SiRNA序列的细胞克隆中trims a基因抑 制效果明显，mRNA相对表达水平显著下降，N14细胞中trims a的mRNA表达被下调了 60%。 用本发明N14细胞感染GFP人慢病毒载体的感染效率提高了 4倍（P<0. 05)，表达效率提高 80倍（(P<0. 01)。本发明为牛病毒病相关基因功能和转基因牛培育的研究提供新的技术支 持。
[0044] 本发明涉及的牛trims a基因沉默细胞株BTL2013已于2014年7月8日保藏 于中国典型培养物保藏中也，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072,保藏编号为CCTCC No. C2014116。
【专利附图】
【附图说明】
[0045] 图1为本发明的trims a基因沉默表达慢病毒载体的示意图。SiRNA ds oligo 插入到载体中BamHl和EcoRl之间，由III类RNA聚合酶启动子U6启动子转录产生ShRNA, 经剪切后产生成熟SiRNA,产生干扰效果。嘿岭霉素（Puromycin)抗性基因可W用于筛选 trims a基因沉默稳定细胞株。
[0046] 图2实时定量PCR方法检测不同SiRNA序列的细胞克隆中trims a mRNA相对表达 水平。
[0047] 图3实时定量PCR方法检测第45代的N14细胞中trims a的表达水平。
[004引图4英光显微镜检测MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14细胞后GFP英光表 达水平。
[004引图5英光显微镜检测MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14细胞后GFP基因转 移效率。
[0050] 图6-1流式细胞仪检测MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14细胞后GFP表达 呈阳性的细胞百分比；
[0051] 图6-2流式细胞仪检测基因MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14细胞后的 GFP基因转移效率和表达强度。
【具体实施方式】
[0052] 实施例1.构建带有编码特异性沉默trims a基因的SiRNA的DNA的人慢病毒载 体
[0053] 1、筛选编码trims a基因的SiRNA的DNA序列
[0054] 利用生物信息学检索NCBI GeneBank得到牛trims a基因（L0C505265) mRNA 全序列作为siRNA设计的碑!序列。在相应的siRNA设计网站化ttp: //rnaidesigner. Iifetechnologies. com/rnaiexpress/)上进行初步设计与筛选，找出具有SiRNA功能的可 能祀序列与其对应编码SiRNA的DNA序列。然后将所选定的正义链序列和反义链序列与 GeneBank(ht1:p://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)中已知同物种的基因序列进行比较，优 选出具有SiRNA功能的可能祀序列，分别命名为SiRNA-I至SiRNA-4.包括：
[00巧] (1) trims a -siRNA-1 :
[0056] 5, -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，
[0057] 3' -TTGTCTTGACTTCTGCCAG-5'
[0058] 似；trims a-siRNA-2
[0059] 5, -CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'
[0060] 3' -AGTGATACAGGCTTGACAG-5'
[0061] 做 trims a -siRNA-3 :
[0062] 5, -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3'
[0063] 3' -TCTGCAGACATGATTGGAG-5'
[0064] (4) trims a -siRNA-4 :
[00巧]5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'
[0066] 3' -TCTTGGACCAGATCATTCT-5'
[0067] 根据祀序列设计编码SiRNA的DNA序列和随机对照序列，该些序列为
[0068] (1) trims a -337 ;(对应祀序列 SiRNA-I) 5, -3，
[0069] 沈Q ID NO. 5: S
[0070] gatcGCTGGCAGAAGTCAAGACAATTCAAGAGATTGTCTTGACTTCTGCCAGTTTTTTg
[0071] 沈 QIDN0.6:R
[0072] aattcAAAAAACTGGCAGAAGTCAAGACAATCTCTTGAATTGTCTTGACTTCTGCCAGC
[0073] (2) trim5 a -480 ;(对应祀序列 SiRNA-2) 5，-3，
[0074] 沈Q ID NO. 7: S
[00巧]gatcGCTGTCAAGCCTGTATCACTTTCAAGAGAAGTGATACAGGCTTGACAGTTTTTTg
[0076] 沈Q ID NO. 8: R
[0077] aattcAAAAAACTGTCAAGCCTGTATCACTTCTCTTGAAAGTGATACAGGCTTGACAGC
[0078] (3) trims a -808 ;(对应祀序列 siRNA-3) 5, -3，
[0079] SEQ ID NO. 9: S
[0080] gatcGCTCCAATCATGTCTGCAGATTCAAGAGATCTGCAGACATGATTGGAGTTTTTTg
[0081] 沈Q ID NO. 10: R
[0082] aattcAAAAAACTCCAATCATGTCTGCAGATCTCTTGAATCTGCAGACATGATTGGAGC
[0083] (4) trims a -1037 ;(对应祀序列 siRNA-4) 5, -3，
[0084] 沈Q ID NO. 11: S
[0085] gatccAGAATGATCTGGTCCAAGATTCAAGAGATCTTGGACCAGATCATTCTTTTTTTg
[0086] 沈Q ID NO. 12: R
[0087] aattcAAAAAAAGAATGATCTGGTCCAAGATCTCTTGAATCTTGGACCAGATCATTCTg
[0088] (5)随机对照序列 Control ;5, -3'
[0089] 沈Q ID NO. 13: S
[0090] gatccATCGACTAGCCACTTAGACTTCAAGAGAGTCTAAGTGGCTAGTCGATTTTTTTg
[0091] 沈Q ID NO. 14: R
[0092] aattcAAAAAAATCGACTAGCCACTTAGACTCTCTTGAAGTCTAAGTGGCTAGTCGATg
[0093] 2、将上述siRNA的DNA序列和随机对照序列送Invitrogen公司合成，并退火生成 双链寡核巧酸ds OligOo
[0094] 在0. 2ml的PCR扩增管中建立下列10 U 1反应体系：
[0095] 1 U g/ U 1 的正义链；0. 4 y 1
[0096] 1 U g/ U 1 的反义链；0. 4 y 1
[0097] 退火缓冲液；9. 2yl
[0098] 95°C赔育上述反应体系4min，然后放置室温下退火5-lOmin。短暂离也后，移出 Iyl反应液稀释至适当浓度备用。剩余的SOyM ds oligo储存于-20°C。
[0099] 3、EcoRl、BamHl双酶切线性化人慢病毒载体pLV-shRNA-puro (内切酶购买于肥B 公司，pLV-shRNA-puro载体购于北京英茂盛业生物科技有限公司）。将ds oligo片段与线 性化的pLV-shRNA-puro载体连接，构建重组pLV-shRNA-puro。在室温下，0. 2ml的PCR扩 增管中依次加入下列试剂建立10 U 1连接反应体系：
[0100] 上述2稀释好的ds oligo ;1 y 1
[0101] 经酶切纯化后的载体：1 U 1
[0102] IOX连接缓冲液：1 Ul
[0103] T4 DNA 连接酶（Promega) : 1 y 1
[0104] 双蒸水；6 Ul
[0105] 16 C过夜连接，反应终止后-2(TC保存。
[0106] 4、连接产物转染大肠杆菌感受态地5 a。37C培养过夜，挑取克隆用引物U6F、U6R 进行PCR鉴定。引物序列如下：
[0107] U6F ：GACTATCATATGCTTACCGTAACT
[0108] U6R ：GGTGGATGTGGAATGTGTG
[0109] 5、PCR鉴定正确的克隆用引物U6F测序（引物合成和测序由北京中美泰和 生物技术有限公司完成），将测序正确的质粒分别命名为pLV-shRNA-trim5 a -337、 pLV-shRNA-trim5 a-480、pLV-shRNA-trim5 a-808、pLV-shRNA trims a-1037 和 pLV-shRNA-control。pLV-shRNA-trim5a-337 测序结果见 SEQ ID No. 17。测序正确的克 隆用Qiagen Plasmid Plus Maxi Kit质粒提取试剂盒提取质粒，定量后保存备用。
[0110] 实施例2. MD服细胞trims a基因沉默稳定细胞株筛选
[0111] 1、MD服细胞嘿岭霉素使用浓度测试
[011引 （I)MD服细胞W 5X IO^孔接种到24孔板。24小时后加入嘿岭霉素（购买于美 国sigma公司）至下列浓度：
[0113] (2)0. 1 U g/ml ；2. 5 u g/ml ；5 u g/ml ；7. 5 u g/ml ；10 u g/ml〇
[0114] (3)每2天换液一次，并重新添加嘿岭霉素。
[0115] (4)选择3-4天全部细胞死亡的浓度为筛选用药浓度。
[0116] 2、复制缺陷型人慢病毒的获得
[0117] 取实施例1中制备的5个重组人慢病毒载体中任一个、P化载体和P肥载体H质粒 与化Iyfect-V转染试剂（购买于北京英茂盛业生物科技有限公司）用脂质体转染法共转 染人胚肾细胞肥K293T(购买于北京英茂盛业生物科技有限公司），4她收获无复制能力的 人慢病毒上清液。4C条件下500g离也5min W去除细胞碎片，收集含慢病毒的上清-7(TC 保存备用。PEG6000沉淀法纯化病毒。采用嘿岭霉素最小致死量筛选病毒感染细胞的方法， 进行慢病毒滴度测定。按上述方法制备4个含SiRNA序列和1个随机对照序列的复制缺陷 型人慢病毒。
[0118] 3、复制缺陷型人慢病毒转染MD服细胞及嘿岭霉素筛选
[0119] (I)MD服细胞接种到24孔板，用高糖DMEM和重量百分比10%胎牛血清（购买于 美国Hyclone公司）的培养液按500 y 1/孔培养MD服至细胞汇合度60%。任取1个上述 制备的复制缺陷型人慢病毒（浓度约为1?5 X l〇7TU/ml) 100 y 1，在室温下融化，加入培养 液400]i 1，加入polybrene(聚凝胺，购买于美国Sigma公司）至终浓度6]i g/ml,混匀制成 SiRNA人慢病毒感染液500 。4个含SiRNA序列和1个随机对照序列的复制缺陷型人慢 病毒的感染液均按此种方法配制。将每种感染液替换MDBK细胞培养液进行感染。24小时 后弃感染液，换新的含有终浓度7. 5 y g/ml嘿岭霉素DMEM进行连续培养。每种感染液做2 个24孔板。
[0120] (2)维持所述嘿岭霉素浓度2周直至每孔出现细胞克隆。
[0121] (3)将嘿岭霉素浓度减到3. 75 y g/ml，继续培养2周后将细胞克隆挑选到24孔板 继续培养。
[0122] (4)待细胞扩增后冻存并检测trims a基因表达，将获得的MD服trims a基因沉 默细胞克隆分别命名为 N14 (对应 trims a -337)、N1 (对应 trims a -480)、N2 (trims a -808) 和N3 (trims a -1037)。随机对照序列的细胞克隆命名为NC。细胞克隆N14命名为牛trims a 基因沉默细胞株BTL2013,已于2014年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中也，保藏号为 CCTCC No. C2014116。
[0123] 4、不同SiRNA序列的细胞克隆检测
[0124] 用实时定量PCR检测不同SiRNA序列的细胞克隆中trims a mRNA相对表达水平。
[0125] 4.1、提取细胞总RNA
[0126] (1)将上述不同细胞克隆接入6孔板中，待细胞生长至90%密度，去除培养基，力口 入Iml Trizol/孔。反复吹吸使细胞脱落。将细胞裂解物转移至1. 5ml离也管中。
[0127] (2)室温赔育5分钟，加入0. 2ml氯仿，震荡混匀，室温赔育3分钟。
[012引（3)41：，12000巧111 离也 15 分钟。
[0129] (4)将上层无色水相转移到新的离也管，加入0. 5ml异丙醇。充分混匀。室温赔育 10分钟。
[0130] 巧）4°C 12000巧m 离也 10 分钟。
[0131] (6)去除上清。
[0132] (7)加入Iml 75%己醇，漂洗RNA沉淀，4°C 7000巧m离也5分钟。
[0133] (8)去除上清，室温挥发干净残余液体，加入20 y 1无RNA酶的水溶解RNA沉淀。 用紫外分光光度计定量后备用。
[0134] 4. 2反转录
[0135] (1)在冰上配制如下反应物：
[013引 总 RNA Iug
[0137] oligodT primer Iul
[013引加水补足 12 Ul
[013引 似将配好的反应物混匀，短暂离也，65C赔育5分钟，立刻冰浴。
[0140] 0)加入如下试剂：
[0141]
【权利要求】
1. 一种使牛trim5a基因沉默的RNA干扰方法，其特征在于通过干扰牛trim5a基因， 下调牛trim5 a表达从而提高外源基因在MDBK细胞中的表达水平。
2. 根据权利要求1的的方法，其特征在于通过siRNA序列实现干扰，所述 siRNA 序列选自 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5' -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5' -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'。
3. -种使牛trim5 a基因沉默的siRNA，其特征在于所述siRNA干扰牛trim5 a基因， 下调牛的trim5 a表达从而提高外源基因在MDBK细胞中的表达水平。
4. 根据权利要求3所述的siRNA，其特征在于所述siRNA选 白 5> -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3>、5> -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3> 或 5' -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'。
5. -种包含权利要求3或4所述的siRNA的病毒表达载体，所述病毒表达载体为 pLV-shRNA-trim5 a -337> pLV-shRNA-trim5 a -808> pLV-shRNA-trim5 a -1037〇
6. 构建权利要求5所述的siRNA病毒表达载体的方法，包括以下步骤： (1) 根据牛trim5 a基因 mRNA全序列筛选RNA干扰靶点，设计siRNA序列和对照随机 序列， (2) 酶切病毒载体， (3) 合成接头引物，退火后连接到病毒载体， (4) 连接产物转染大肠杆菌感受态dH5 a，培养过夜， (5) 挑取克隆进行PCR鉴定，获得测序正确的克隆，提质粒定量后备用。
7. -种trim5 a基因沉默的哺乳动物细胞，其特征在于所述哺乳动物细胞导入根据权 利要求5所述的siRNA病毒表达载体。
8. 根据权利要求7所述的细胞，其特征在于所述细胞是牛肾细胞MDBK，所述细胞是 N14,命名为牛trim5a基因沉默细胞株BTL2013,已于2014年7月8日保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. C2014116。
9. 一种提高外源基因在MDBK细胞中的表达水平的方法，其特征在于所述方法包括在 MDBK细胞中导入根据权利要求5所述的siRNA病毒表达载体。
10. 权利要求3或4所述的siRNA或权利要求5所述的siRNA病毒表达载体在制备 trim5 a基因沉默的哺乳动物细胞的用途。
【文档编号】C12N15/86GK104357444SQ201410539364
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月13日 优先权日:2014年10月13日
【发明者】刘艳红, 尚佑军, 孙德惠, 刘湘涛, 殷宏, 龚真莉, 祁淑芸, 李勇 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所