一种针对皮质醇的纳米抗体及其编码序列的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种特异性针对于小分子激素皮质醇的纳米抗体，公开了其VHH链的框架区FR和互补决定区CDR的氨基酸序列，同时还公布了编码该纳米抗体的基因序列以及能够表达该纳米抗体的宿主细胞。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于皮质醇检测试剂的研发。
【专利说明】一种针对皮质醇的纳米抗体及其编码序列
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学或生物制药【技术领域】，尤其涉及一种针对于皮质醇分子的纳 米抗体及其编码序列。
【背景技术】
[0002] 皮质醇（cortisol)，又称氢化可的松，是由肾上腺皮质束状带所分泌的一种类固 醇激素或糖皮质激素。皮质醇的主要功能作用是通过糖异生增加血糖，控制免疫系统以 及有助于机体对脂肪、蛋白质和碳水化合物的代谢。皮质醇的分泌主要受垂体分泌的促 肾上腺皮质激素的调节，在压力和低血糖的情况下被分泌，其分泌有明显的昼夜节律，上 午8时左右分泌达高峰，以后逐渐下降，午夜零点最低。血浆皮质醇正常值：上午8?9时 (442±276) nmol/L，下午3?4时（221±166) nmol/L。皮质醇在应付压力中扮演重要 角色，故又被称为"压力荷尔蒙"，皮质醇过高会导致库兴氏综合症，过低则会导致爱迪生氏 病。肾上腺皮质因增生、腺瘤、癌变等所致的皮质醇增多症患者，其血浆、24小时尿以及唾液 中皮质醇含量均明显增高，昼夜节律消失。垂体ACTH癌和异位ACTH综合征患者由于ACTH 分泌增多，可致血浆皮质醇相应升高。各种原因所致的高糖皮质类固醇激素结合蛋白（CBG) 血症血浆皮质醇水平明显增高。皮质醇在肥胖症以及心肌梗死、脑血管意外、休克等危重疾 病亦可升高。因此利用针对皮质醇的纳米抗体来研发快速检测试剂盒具有重要的意义。
[0003] 普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只 有两条重链，没有轻链，这些"重链抗体"能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，但不像 单链抗体那样相互黏连聚集成块。以该"重链抗体"为基础的纳米抗体不仅分子量只是普 通抗体的1/10,而且化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易且容易获得，并容 易偶联其他分子，单域抗体也称为纳米抗体。研发皮质醇纳米抗体可以快速有效的进行病 理检测。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题是： 提供一种针对皮质醇的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制 备检测的应用。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是： 提供一种皮质醇的纳米抗体，其VHH链包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区 FR包括FRl、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 1所示FRl，SEQ ID NO: 2所示FR2, SEQ ID NO: 3所示的FR3, SEQ ID NO: 4所示的FR4;所述互补决定区CDR 包括CDRl、CDR2、CDR3的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5所示的CDRl，SEQ ID N0:6 所示的 CDR2, SEQ ID NO :7 所示的 CDR3。
[0006] 此外，上述皮质醇纳米抗体的VHH链具有SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列。
[0007] 还提供一种DNA分子，它用以编码上述的皮质醇纳米抗体的VHH链，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO :9 所示。 除此之外,还提供一种表达载体,它包含上述DNA分子的核苷酸序列，还有一种宿主细 胞，它可以表达上述皮质醇的纳米抗体。
[0008] 最后本发明还提供了皮质醇纳米抗体用于检测皮质醇分子的用途。
[0009] 本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的优点如下： 本发明采用皮质醇免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对皮质 醇的纳米抗体基因库，将皮质醇偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛 选免疫性的纳米抗体基因库，从而获得了针对皮质醇特异性的纳米抗体基因，将此基因转 入大肠杆菌中，建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，根据序列比对软件分析各 个克隆株的基因序列，最终获得皮质醇纳米抗体VHH链的氨基酸序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1 一株皮质醇纳米抗体通过镍柱树脂亲和层析纯化后，经SDS-PAGE电泳图。
【具体实施方式】
[0011] 下面将结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。
[0012] 本发明首先采用皮质醇免疫一只新疆双峰驼，经过6次免疫之后提取该双峰驼外 周血淋巴细胞并构建了皮质醇特异的单域重链抗体文库。将皮质醇偶联在酶标板上，展示 蛋白质的正确空间结构，使得皮质醇的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌 体展示技术筛选皮质醇免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获 得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
[0013] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明： 实施例1 :针对于皮质醇的纳米抗体文库的构建： (1)将I mg皮质醇-BSA抗原(购自Fitzgerald)与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新 疆双峰驼，每周一次，共免疫6次，第一次用完全佐剂，后五次用不完全佐剂，刺激B细胞表 达抗原特异性的纳米抗体；（2) 6次免疫结束后，提取100 mL骆驼外周血淋巴细胞并提取 总RNA ; (3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH ; (4)利用限制性内切酶PstI及NotI酶切 20 ug pComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10 ug VHH并连接两个片段；（5)将连 接产物转化至电转感受态细胞TGl中，构建皮质醇纳米抗体文库并测定库容，库容大小为 2. OXlO90
[0014] 实施例2 :针对皮质醇的纳米抗体筛选过程： (1)取200 uL重组TGl细胞至2XTY培养基中培养，期间加入40 uL辅助噬菌体 VCSM13侵染TGl细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收 集扩增噬菌体；（2)将溶解在100 mM pH8. 2 NaHCO3中的10 ug皮质醇-BSA及BSA分别 偶联在NUNC酶标板孔内，4 °C放置过夜；（3)第二天加入100 uL 0. 1%酪蛋白，室温封闭2 h;(4)2 h后，加入100 uL扩增噬菌体（2X10ntfu免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)， 室温作用I h ; (5)用PBS+0. 05% Tween-20洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体；（6)用100 mM TEA (triethylamine)将与皮质醇特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大 肠杆菌TGl细胞，37 °C培养I h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复 3轮，逐步得到富集。
[0015] 实施例3 :用酶联免疫方法（ELISA)筛选特异性阳性克隆： (1)从上述3轮筛选后细胞培养板中，挑选95个单菌落分别并接种于含有100 ug/mL 氨苄青霉素的TB培养基（I L TB培养基中含有2.3 g磷酸二氢钾，12.52 g磷酸氢二钾，12 g蛋白胨，24 g酵母提取物，4 mL甘油）的96孔板中，并设置一个空白对照，37 °C培养至对 数期后，加终浓度为I mM的IPTG，28 °C培养过夜。（2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗 体转移至皮质醇-BSA抗原及BSA负对照过夜偶联的ELISA板中，室温下孵育I h。（3)用 PBST洗去未结合的抗体，加入100 uL经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody (抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置I h。（4)用PBST 洗去未结合的抗体，加入100 uL经1:2000稀释后的Anti-mouse alkaline phosphatase conjugate (山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置I h。（5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，反应5-10 min后于酶标仪上 405nm波长处，读取吸收值。（6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克 隆孔。（7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100 ug/mL氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质 粒并进行测序。 根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把⑶R1，⑶R2,⑶R3序 列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终获得1株皮质醇 特异性纳米抗体。其抗体的氨基酸序列为SEQ ID N0:8所示的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 区，构成整个 VHH。
[0016] 实施例4 :皮质醇纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达及纯化： (1)将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布 在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37 °C培养过夜；（2)挑选单 个菌落接种在5 mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37 °C摇床培养至00^^=0.64. 9; (3) 接种I mL的过夜菌种至330 mL TB培养液中，37 °C摇床培养，培养到OD值达到0. 6~0. 9 时，加入IM IPTG，28 °C摇床培养过夜；（4)离心，收菌；（5)利用渗透法，获得抗体粗提液； (6)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，其产量约12. 6 mg/L并且纯度达90%以上的皮质醇纳 米抗体，抗体大小为16. 6kD，等电点为6. 64。
[0017] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
【权利要求】
1. 一种皮质醇单域纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于， 所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO :1所示的FR1，SEQ ID NO :2所示 的FR2, SEQ ID NO :3所示的FR3, SEQ ID NO :4所示的FR4 ;所述互补决定区CDR选自下组 的 CDR 的氨基酸序列：SEQ ID NO :5 所示的 CDR1，SEQ ID NO :6 所示的 CDR2, SEQ ID NO :7 所示的CDR3。
2. 根据权利要求1所述的皮质醇纳米抗体的VHH链，其特征在于，它具有SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列。
3. -种皮质醇纳米抗体，其特征在于，它针对皮质醇表位的纳米抗体,包括一条具有 SEQ ID NO :9所示氨基酸序列的VHH链。
4. 一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的皮质 醇纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的皮质醇纳米抗体。
5. 根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自DNA序列如 SEQ ID NO :8 所示。
6. -种表达载体，其特征在于，它含SEQ ID NO :8所不的核苷酸序列。
7. -种宿主细胞，其特征在于，它可以表达皮质醇的纳米抗体。
8. 权利要求3所述的皮质醇纳米抗体用于检测皮质醇分子的用途。
【文档编号】C12N15/70GK104479021SQ201410539201
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年10月13日 优先权日:2014年10月13日
【发明者】万亚坤, 王平艳, 严俊荣 申请人:东南大学