抑制流感病毒相关基因的siRNA及其应用的制作方法

专利名称：抑制流感病毒相关基因的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及抑制小窝蛋白2和表面活性蛋白D基因表达的siRNA、siRNA的核苷酸序列、可编码该siRNA的重组载体以及可编码转录因子A和对氧磷酸酶3的重组载体，以及它们各自的基因在制备和筛选抗流感药物方面的用途。
背景技术：
病毒入侵宿主过程伴随着宿主基因表达变化，最终决定感染细胞和病毒各自的命运。病毒感染宿主后需要利用宿主细胞的代谢过程完成病毒自身的复制，在这一过程病毒必然会调控宿主细胞内基因组的表达，抑制抗病毒基因表达，增强对病毒复制有益的基因表达。因此，病毒感染宿主细胞后，宿主细胞内表达变化的这些基因往往和病毒复制有密切的关系。通过生物学手段调控宿主细胞内这些基因中一个或同时调控多个基因表达可能具有抑制流感病毒复制的作用，具有潜在预防和治疗流感病毒感染的应用价值。流感病毒为正粘病毒科流感病毒属分节段单股负链RNA病毒。病毒粒子刚分尚时呈多晶形，在体内传代后变成球形，直径80-120nm(PaleSe，et al.，2007)。病毒粒子由0.8-1 %的RNA、70-75%的蛋白质、20%的脂类和5_8%的糖类组成，此处比例均为质量比。流感病毒分为A、B、C三型，其中A型(甲型)最为重要。甲型流感病毒能引起人类、猪、马和各种禽类的自然感染和发病。由于其表面抗原HA和NA容易变异，已知HA有16个亚型(H1-H16)，NA有9个亚型(N1-N9)，它们之间的不同组合，使甲型流感病毒有许多亚型(如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1等)，在猪体中主要流行HlNl和H3N2亚型。不同动物有不同的流感病毒，如猪流感、人流感、马流感，一般情况下这些流感只感染各自的本属动物。但是，流感病毒具有宿主种的适应性。在不同种动物的个体之间也容易发生传播，形成感染多种动物的新流感病毒。另一个特点是猪这种动物比较特殊，猪对其它动物的流感病毒也易感，这是其它动物不具有的特性。所以一旦猪同时感染了人流感、猪流感、禽流感等，这多种病毒会在猪体内发生重组，可能就会出来一种既能感染猪、人、禽的流感病毒。所以狭义的猪流感不是人兽共患病。流感在人与人之间传播范围很有限，跟流感的传播途径有关。比如2009年甲型流感，就是人流感、猪流感、禽流感共同感染猪后产生的新流感病毒，最开始感染的人基本都是接触过或跟猪关系密切的人，随后会有更多人感染流感病毒。人类发展史上流感病毒的大爆发都给社会经济发展、人的健康带来重大危害。为预防和治疗流感，各国都投入了大量人力物力，不断研究治疗方法和药物。近年来，从宿主细胞内寻找具有抗病毒功能的基因或蛋白是一个热门领域。人类发展史上流感病毒的大爆发都给社会经济发展、人的健康带来重大危害。为预防和治疗流感，各国都投入了大量人力物力，不断研究治疗方法和药物。近年来，针对宿主细胞内具有抗病毒功能的基因或蛋白作为靶点研发抗病毒药物是一个热门领域。以细胞内功能分子作为抗病毒治疗的靶点具有广谱抗病毒、不易产生耐药毒株的优势，逐渐成为研究开发抗病毒治疗药物的热点途径。近年来国际高水平论文多次报道在宿主细胞内信号通路中筛选具有潜在抗病毒功能的分子取得突破性成就。例如， 锌指抗病毒蛋白(Zinc-finger antiviral protein, ZAP)能通过降解特异病毒RNA进而抑制鼠白血病病毒等多种病毒的复制，被证明是一种重要的抗病毒因子(Chen et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A.105，4352-4357)。利用锌指蛋白为载体携带特异的酶阻断T细胞中的 CCR5 表达，可促进 T 细胞清除 HIV 病毒(Holt et al.(2010)Nat.Biotechnol.28，839-847) <^3泛素连接酶RNF5定位于线粒体，通过泛素化修饰MITA (也称为STING)并引起其降解而负调控病毒感染后I型干扰素表达(Zhong et al.(2009) Immunity.30,397-407)。Tetherin (宿主细胞蛋白)以二聚体锚定HIV在其复制的细胞膜上，阻断病毒从胞浆膜出芽释放(Perez-Caballero et al.(2009)Cell.139，499-511)。AP0BEC3G(ApolipoproteinBmRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G)可诱导HIV基因变异，使病毒不能复制(Shirakawa et al.(2008) Nat.Struct.Mol.Biol.15,1184-1191)。目前细胞周期素依赖激酶、前列腺素、热休克蛋白作为药靶分子广泛用于如，HCMV、HIV、HSV、腺病毒和乳头状瘤等病毒病治疗。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具。通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA，封闭内源性基因表达，从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。早期就有人应用此项技术分离了果蝇胰岛素信号转导途径通路中的各种成分。近来也有实验报道通过RNAi研究细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。在这之前，曾利用反义RNA与靶mRNA序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型，易造成对基因功能判断错误，目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物Vitravene。RNAi特异性更高，作用更迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统也没有影响。最近在人类体细胞里已经成功地对近20种基因功能进行了“敲除”，尤其是因此而了解了人类空泡蛋白TsglOl对HIV在人体内增殖的作用，进一步深化了对HIV的研究。Leonid等以脊髓灰质炎病毒为模型，利用RNAi来诱导细胞的胞内免疫，产生抗病毒效应，尤其是针对RNA病毒。对于易突变的病毒，可设计多种靶向病毒基因保守序列的dsRNA，减少它对dsRNA的抵抗。Maen等也应用RNAi技术成功地阻断了 MCF-7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因21的功能。RNAi技术的应用，不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学)的发展，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能，并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域，用RNAi技术来抑制基因的异常表达，为治疗各种疾病开辟了新的途径。由于近年来分子生物学技术和细胞生物学技术的快速发展，分子药理学研究也不断深入，新的药物作用靶点、功能蛋白质、基因表达的变化，生物活性成分等不断发现，为药物筛选提供了大量新的靶点，如新的受体、酶等。这些新的靶点为新药筛选提供了新的信息和机会。细胞分子水平药物筛选模型的应用为自动化操作奠定了基础，使药物筛选由传统的手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系，形成了高通量药物筛选。高通量药物筛选的优点:实现了药物筛选的规模化，较大限度地利用了药用物质资源，提高了药物发现的概率， 同时提高了发现新药的质量；筛选实验是在微量筛选系统中完成的，样品用量一般在微克级(μ g)，节省了样品资源，奠定了“一药多筛”的物质基础，同时节省了实验材料，降低了单药筛选成本；高通量药物筛选为高度自动化操作减少了操作误差的发生，降低了劳动强度，而且提高了药物筛选的效率和结果的准确性；具有多学科理论和技术结合的特点。药物筛选模型是发现新药的重要条件。新模型的建立将会带动新型药物的出现。分子生物学、细胞生物学、计算机科学的发展，特别是人类基因组计划的完成，为医药研究带来了良好的机遇，也为建立新的药物筛选模型，提供了理论、技术、材料等多方面的优势条件。因此，我们应充分利用各学科的发展技术建立更多新的筛选模型，促进新药的发现。DNA疫苗是上世纪九十年代发展起来的新技术，即将外源基因克隆到真核表达载体上构建DNA疫苗质粒，DNA疫苗经过各种途径注射到动物基体内后，可被宿主细胞吸收和摄取，进入宿主细胞的细胞核中转录成mRNA,再在胞楽;中翻译成蛋白质。其中一部分蛋白质在降解后与MHCI类分子结合，并被递呈到细胞表面被CD8T细胞的受体识别，而激活细胞毒性T细胞的活性；另一部分蛋白质也可以分泌出去，再像外源蛋白一样被抗原提呈细胞摄取，在吞噬溶酶体内降解成多肽，并进一步与MHCII类分子结合，有抗原提呈细胞提呈到细胞表面被Th2细胞的受体识别，然后由Th2细胞分泌的细胞因子作用于B细胞，而刺激以抗体产生为主的体液免疫。DNA疫苗不仅可诱导产生体液免疫，而且可诱导强烈而持久的细胞免疫，还可避免向外界排毒，而且DNA疫苗与减毒和弱毒疫苗不一样，其不存在毒力反强等问题。其安全性及高效性是传统疫苗所达不到的，所以，该技术在病毒、细胞内寄生所引起的传染病、寄生虫以及肿瘤防治中显示出巨大的潜力。Wolff对重组质粒可以在小鼠体内表达进行了报道，外源蛋白可以在小鼠体内表达长达60天，提示质粒DNA可以在体内相当一段时间内进行表达，可以用作治疗性作用，并引起了广泛的研究。基因治疗对于癌症、动脉粥样硬化、骨质疏松、关节炎、阿耳茨海默氏病因为特定基因活动异常而引起的疾病的预防和治疗很有前景。该疗法是一种将核酸引入人细胞以用来修改它们的遗传特性而达到治疗目的的治疗策略。通常，该核酸是能够编码起治疗作用，破坏作用或者标记作用的蛋白质的双链DNA分子(dsDNA)。该核酸也可能是与宿主细胞里的目标序列结合，通过阻止mRNAs或者启动子来抑制特定基因表达的反义RNA或者单链DNA(ssDNA)。至今，以质粒为基础的基因治疗、癌症疫苗等已经超过了 600例，质粒DNA的基因免疫模拟了病原体在细胞内的基因表达途径，已经成功地应用来治疗下肢的局部缺血，心血管再生，并极有希望通过核酸疫苗来预防现代医学的疑难杂症，包括疟疾、艾滋病、乙肝和结核病等。对于基因治疗，质粒不能整合入基因组DNA也许是个缺点，但是质粒可以附加体的形式存在于细胞核中，也可以持续表达相当长的一段时间。

发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是设计抑制宿主体内和流感病毒复制相关基因的siRNA序列，构建能够编码该siRNA的重组载体，以及含有该序列开放阅读框的重组载体在制备抗流感药物方面的应用。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是:一种针对小窝蛋白2基因的siRNA，其中本发明所述的siRNA对应的靶序列是小窝蛋白2基因的mRNA，本发明所述的siRNA的长度为16-30bp， 且可使经其转染后的哺乳动物细胞的mRNA或蛋白表达下降60%以上。其中所述的哺乳动物包括选自猪、犬、鼠、人等哺乳动物，本发明中较佳的是猪，本发明的siRNA在猪中具有较好的沉默基因的效果。本发明中所述的siRNA，长度为16_30bp，更佳地为18_25bp。较佳的，所述的siRNA含有选自SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或如序列表中SEQ ID NO ; I表示。更佳地，所述的siRNA的3’端含有2个T或含有2个U的延伸结构。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是:一种编码所述的抑制小窝蛋白2表达的siRNA的重组载体。根据本发明，所述的重组载体采用的载体可以是本领域常规的载体，包括腺病毒载体，如以5型(Ad5)、2型(Ad2)为基础的各种腺病毒载体，慢病毒载体，选自HIV-1型载体，HIV-2型载体，SIV型载体，FIV型载体等。将所述siRNA片段克隆到载体质粒中，即得本发明的重组载体。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是:一种组合物，其中含有0.001-99.99wt%本发明所述的针对小窝蛋白2的siRNA和可接受的载体、稀释剂或赋形齐U。其中，所述的载体、稀释剂或赋形剂，更佳地是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，包括水溶性、难溶性或肠溶性等载体材料，或粉、糊精、糖粉，硫酸钙二水化合物、磷酸氢钙、 氧化镁、碳酸镁、碳酸钙、 氢氧化铝凝胶粉和活性炭中的一种或多种。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是:所述的siRNA在制备或筛选抗流感药物中的用途。其中，所述的siRNA可以作为唯一的抗流感病毒活性成分，也可以和其他抗流感病毒药物联合使用。本发明所述的siRNA在制备抗流感药物的用途中，更佳地可采用如下技术方案:如通过吸入的方式给药，不仅使用方便，而且可以增加其在感染部位的药物浓度。并且，由于感染早期病毒数量小，充足的siRNA可以更有效地抑制病毒的复制，从而起预防和治疗的效果；流感中RNAi药物靶点选择较多，可以复方或多重用药，不易产生耐药毒株；最后RNAi与流感疫苗不同，不需要使用者具有健全的免疫系统。本发明还可以更佳地采取如下技术方案:如通过静脉注射或肌肉注射SiRNA序列或编码该siRNA重组载体等方式，使该siRNA在生物体内得以高效、持久表达从而达到RNA免疫或基因治疗流感病毒的目的。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之五是:所述的siRNA在抑制流感病毒复制中的用途。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之六是:一种筛选抗流感药物的方法，包括以下步骤:(I)使候选药物与感染流感病毒的细胞接触，所述的细胞是小窝蛋白2基因沉默的细胞；(2)测试流感病毒滴度；(3)选择使流感病毒滴度下降的候选药物。其中，更佳地步骤(I)中所述小窝蛋白2基因表达沉默细胞是通过使宿主细胞含有所述基因的小干扰RNA或者是含有编码有所述小干扰RNA的重组载体使该基因沉默。其中，所述细胞可以采用293T (人肾上皮细胞系)、BHK (仓鼠肾细胞)、VER0 (非洲绿猴肾细胞)、IBRS22(猪肾细胞)或MDCK(犬肾细胞)等细胞系，本发明优选MDCK细胞。其中，通过该细胞与流感病毒接触，经过一段时间后在显微镜下观察细胞受损害的程度，比较以抗流感药物处理和对照试验的细胞中的流感病毒的病毒滴度，便可知道该抗流感药是否能减少病毒对细胞的损害。本发明所述方法，更佳地可采用如下方案:药物的细胞毒性检测，MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的药液，继续培养3天，用MTT法检测药物对MDCK细胞的毒性。药物抗流感病毒作用检测，MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，用100TCID50的流感病毒感染细胞，再加入无毒浓度下的系列浓度的含药培养液，继续培养3天，经CPE法确定药物对流感病毒的抑制作用。本发明所述方法，较佳地还可以采用如下技术方案；流感病毒RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)主要参与病毒的基因组复制与转录。对于复制，RdRp以病毒基因组RNA(vRNA)为模板催化生成与其互补的RNA链(cRNA)，cRNA随后可以作为模板合成vRNA装配进入子代病毒。对于转录，RdRp在合成cRNA的基础上在其3’端加入多聚A尾，5’端加入帽子结构，形成成熟的mRNA进行蛋白质合成。本实验根据合成RNA链时消耗底物ATP、UTP、CTP和GTP使体系中ATP浓度逐渐降低，测定体系中剩余的ATP含量以反应出反应进行程度。通过检测该细胞株 中流感病毒RNA聚合酶变化水平，评估小窝蛋白2沉默细胞对抗流感药物的敏感程度。其中所述病毒滴度检测方法，MTT方法，CPE方法，细胞培养等方法，均为本领域常规实验方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之七是:一种针对表面活性蛋白D基因的siRNA，所述的siRNA对应的靶序列是表面活性蛋白D基因的mRNA，所述siRNA的长度为16-30bp，且可使经其转染后的哺乳动物细胞的mRNA或蛋白表达量下降60%以上。其中所述的哺乳动物包括选自猪、犬、鼠、人等哺乳动物，本发明中较佳的是猪，本发明的siRNA在猪中具有较好的沉默基因的效果。本发明中所述的siRNA长度为16_30bp，更佳地为18_25bp。较佳的，所述的siRNA含有选自SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或如序列表中SEQ ID NO:2表示。所述的siRNA，更佳地序列3’端含有2个T或含有2个U的延伸结构。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之八是:一种编码所述的抑制表面活性蛋白D表达的siRNA的重组载体。根据本发明，所述的重组载体采用的载体可以是本领域常规的载体，包括腺病毒载体，包括以5型(Ad5)、2型(Ad2)为基础的各种腺病毒载体，慢病毒载体包括HIV-1型载体，HIV-2型载体，SIV型载体，FIV型载体等。。将所述siRNA片段克隆到载体质粒中，即得本发明的重组载体。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之九是:一种组合物，其中含有0.001-99.99wt%本发明所述的针对表面活性蛋白D的siRNA序列和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。其中所述的载体、稀释剂和赋形剂，更佳地是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。例如为水溶性、难溶性或肠溶性等载体材料、粉、糊精、糖粉、硫酸钙二水化合物、磷酸氢钙、氧化镁、碳酸镁、碳酸钙、氢氧化铝凝胶粉和纳米材料中的一种或多种。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十是:所述的抑制表面活性蛋白D的siRNA在制备或筛选抗流感药物中的用途。其中，所述的siRNA可以作为唯一的抗流感病毒活性成分，也可以和其他抗流感病毒药物联合使用。其中，更佳地可采用如下技术方案:如通过吸入的方式给药，不仅使用方便，而且可以增加其在感染部位的药物浓度。并且，由于感染早期病毒数量小，充足的siRNA可以更有效地抑制病毒的复制，从而起预防和治疗的效果；流感中RNAi药物靶点选择较多，可以复方或多重用药，不易产生耐药毒株；最后RNAi与流感疫苗不同，不需要使用者具有健全的免疫系统。本发明还可以更佳地采取如下技术方案:如通过静脉注射或肌肉注射SiRNA序列或编码该siRNA重组载体等方式，使该siRNA在生物体内得以高效、持久表达从而达到RNA免疫或基因治疗流感病毒的目的。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之i^一是:一种筛选抗流感药物的方法，其特征在于，包括以下步骤:(I)使候选药物与感染流感病毒的细胞接触，所述的细胞是表面活性蛋白D基因沉默的细胞；(2)测试流感病毒滴度:(3)选择使流感病毒滴度下降的候选药物。本发明所述的方法，更佳地步骤(I)中所述表面活性蛋白D基因表达沉默细胞是通过使宿主细胞含有所述基因的小干扰RNA或者是含有编码有所述小干扰RNA的重组载体使该基因沉默。其中，所述细胞可以采用293T (人肾上皮细胞系)、BHK (仓鼠肾细胞)、VER0 (非洲绿猴肾细胞)、IBRS22(猪肾细胞)或MDCK (犬肾细胞)等细胞系，本发明优选MDCK。本发明所述方法，通过该细胞与流感病毒接触，经过一段时间后在显微镜下观察细胞受损害的程度，比较以抗流感药物处理和对照试验的细胞经流感病毒感染后的存活率或生长情况，便可知道该抗流感药是否能减少病毒对细胞的损害。其中，更佳地可采用如下方案:(I)药物的细胞毒性检测，MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的药液，继续培养3天，用MTT法检测药物对MDCK细胞的毒性。(2)药物抗流感病毒作用检测，MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，用100TCID50的流感病毒感染细胞，再加入无毒浓度下的系列浓度的含药培养液，继续培养3天，经CPE法确定药物对流感病毒的抑制作用。本发明所述方法，较佳地还可以采用如下技术方案:(I)流感病毒 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)主要参与病毒的基因组复制与转录。对于复制，RdRp以病毒基因组RNA(vRNA)为模板催化生成与其互补的RNA链(cRNA)，cRNA随后可以作为模板合成vRNA装配进入子代病毒。对于转录，RdRp在合成cRNA的基础上在其3’端加入多聚A尾，5’端加入帽子结构，形成成熟的mRNA进行蛋白质合成。本实验根据合成RNA链时消耗底物ATP、UTP、CTP和GTP使体系中ATP浓度逐渐降低， 测定体系中剩余的ATP含量以反应出反应进行程度。
(2)通过检测该细胞株中流感病毒RNA聚合酶变化水平，评估表面活性蛋白D基因沉默细胞对抗流感药物的敏感程度。其中所述病毒滴度检测方法，MTT方法，CPE方法，细胞培养等方法，均为本领域常规实验方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十二是:一种含有转录因子A的基因开放阅读框的重组载体。较佳的，所述载体通过以下制备方法获得:(I)把Genbank中登录号为NM 001130211.1的转录因子A基因序列输入到DNAStar软件(DNASTAR公司，美国)EditSeq中，选取序列中从起始密码子“ATG”到终止密码子“TGA”、“TAG”或“TAA”之间最长的序列741bp碱基；(2)分别在Y和3'端设计扩增全长PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位点，CGG作为保护性碱基，下游引物5'端添加EcoR V酶切位点；(3)上游引物 5' -CGGAAGCTTATGGCGCTTCTCCGGGGCGTGT-3'；(4)下游引物 5' -CGGGATATCTCAACACTCCTCAGTGTCTTTC-3/ ；(5)以猪肺泡巨噬细胞提取的总RNA的反转录产物为模板，用设计的上下游引物PCR扩增得到转录因子A序列，然后经过酶切后连接到真核表达载体相应酶切位点。其中，真核表达载体可以 采用pCMVp-NE0-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4 等常见真核表达载体，本发明中，更佳地采用P⑶NA 3.1 (+)载体。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十三是:一种所述的含有转录因子A开放阅读框的重组载体在制备或筛选抗流感药物中的用途。本发明更佳地，可以将该重组载体用于转染不同细胞系，转染的方法可以是，DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，阳离子聚合物法，病毒介导法，生物颗粒传法(基因枪粒子轰击法)，显微注射法，电穿孔法等，本技术方案优选脂质体转染法。转染的细胞可以是各种真核细胞，本技术方案优选MDCK (犬肾细胞)。本发明还可以将该重组载体用于基因治疗，如可以通过静脉注射或肌肉注射等方式，在生物体内得以进行高效、持久表达从而达到DNA免疫或基因治疗流感病毒的目的。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十四是:一种用于筛选药物的细胞模型，其含有所述的含有转录因子A开放阅读框的重组载体。其中，所述的细胞可以是各种真核细胞，包括293T(人肾上皮细胞系)、BHK(仓鼠肾细胞)、VERO (非洲绿猴肾细胞)、IBRS22(猪肾细胞)和MDCK (犬肾细胞)等细胞系等。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十五是:一种筛选抗流感药物的方法，本发明所述方法，包括以下步骤:(I)使候选药物与感染流感病毒的细胞接触，所述的细胞是过表达转录因子A基因的细胞；(2)测试流感病毒滴度；(3)选择使流感病毒滴度下降的候选药物。本发明所述方法，步骤(I)所述的过表达该基因的细胞，更佳地是通过增加细胞内该基因的拷贝数或者改良该基因的调控元件使该基因过表达。 本发明所述方法，所述细胞可以选自293T (人肾上皮细胞系)、BHK (仓鼠肾细胞)、VERO(非洲绿猴肾细胞)、IBRS22(猪肾细胞)和MDCK(犬肾细胞)等细胞系，本发明优选MDCKo本发明所述方法，通过该细胞与流感病毒接触，经过一段时间后在显微镜下观察细胞受损害的程度，比较以抗流感药物处理和对照试验的细胞中流感病毒的病毒滴度，便可知道该抗流感药是否能减少病毒对细胞的损害。本发明所述方法，更佳地可采用如下方案:(I)药物的细胞毒性检测，MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的药液，继续培养3天，用MTT法检测药物对MDCK细胞的毒性。(2)药物抗流感病毒作用检测，MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，用100TCID50的流感病毒感染细胞，再加入无毒浓度下的系列浓度的含药培养液，继续培养3天，经CPE法确定药物对流感病毒的抑制作用。本发明所述方法，较佳地还可以采用如下技术方案:(I)流感病毒 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)主要参与病毒的基因组复制与转录。对于复制，RdRp以病毒基因组RNA(vRNA)为模板催化生成与其互补的RNA链(cRNA)，cRNA随后可以作为模板合成vRNA装配进入子代病毒。对于转录，RdRp在合成cRNA的基础上在其3’端加入多聚A尾，5’端加入帽子结构，形成成熟的mRNA进行蛋白质合成。本实验根据合成RNA链时消耗底物ATP、UTP、CTP和GTP使体系中ATP浓度逐渐降低，测定体系中剩余的ATP含量以反应出反应进行程度。(2)通过检测该细胞株中流感病毒RNA聚合酶变化水平，评估转录因子A基因过表达细胞对抗流感药物的敏感程 度。其中所述病毒滴度检测方法，MTT方法，CPE方法，细胞培养等方法，均为本领域常规实验方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十六是:一种含有对氧磷酸酶3基因的开放阅读框的重组载体，。较佳的，所述载体通过以下制备方法获得:(I)从Genbank中登录号为匪001044604.1的对氧磷酸酶3中，选取从序列中从起始密码子“ATG”到终止密码子“TGA”、“TAG”或“TAA”之间最长的序列1065bp碱基；(2)分别在Y和3'端设计扩增全长PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位点，CGG作为保护性碱基，下游引物5'端添加EcoR I酶切位点；(3)上游引物 5' -CGGAAGCTTATGGGGAAGCTGGTGGCTCTGA-3'；(4)下游引物 5' -CGGGAATTCCTAGAGCACACAGTACAGAGCT-3'；(5)以猪肺泡巨噬细胞提取的总RNA的反转录产物为模板，用设计的上下游引物PCR扩增得到转录因子A序列，然后经过酶切后连接到真核表达载体相应酶切位点。其中，真核表达载体可以采用pCMVp-NE0-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4 等常见真核表达载体，本发明中，更佳地采用P⑶NA 3.1 (+)载体。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十七是:一种本发明所述的含有对氧磷酸酶3开放阅读框的重组载体在制备或筛选抗流感药物中的用途。本发明更佳地，可以将该重组载体用于转染不同细胞系，转染的方法可以是，DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，阳离子聚合物法，病毒介导法，生物颗粒传法(基因枪粒子轰击法)，显微注射法，电穿孔法等，本技术方案优选脂质体转染法。转染的细胞可以是各种真核细胞，本技术方案优选MDCK (犬肾细胞)。
本发明还可以将该重组载体用于基因治疗，如可以通过静脉注射或肌肉注射等方式，在生物体内得以进行高效、持久表达从而达到DNA免疫或基因治疗流感病毒的目的。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十八是:一种用于筛选药物的细胞模型，其含有所述的含有对氧磷酸酶3基因的开放阅读框的重组载体。其中，所述的细胞可以是各种真核细胞，选自293T (人肾上皮细胞系)、BHK (仓鼠肾细胞)、VER0 (非洲绿猴肾细胞)、IBRS22(猪肾细胞)和MDCK (犬肾细胞)细胞系等。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之十九是:一种筛选抗流感药物的方法，本发明所述方法，包括以下步骤:(I)使候选药物与感染流感病毒的细胞接触，所述的细胞是过表达对氧磷酸酶3基因的细胞；(2)测试流感病毒滴度；(3)选择使流感病毒滴度下降的候选药物。本发明所述方法，步骤(I)所述的过表达该基因的细胞，更佳地是通过增加细胞内该基因的拷贝数或者改良该基因的调控元件使该基因过表达。本发明所述方法，所述细胞可以采用293T (人肾上皮细胞系)、BHK (仓鼠肾细胞)、VERO(非洲绿猴肾细胞)、IBRS22(猪肾细胞)和MDCK(犬肾细胞)等细胞系，本发明优选MDCK。本发明所述方法，通过该细胞与流感病毒接触，经过一段时间后在显微镜下观察细胞受损害的程度，比较以抗流感药物处理和对照试验的细胞中流感病毒的病毒滴度，便可知道该抗流感药是否能减少病毒对细胞的损害。本发明所述方法，更佳地可采用如下方案:(I)药物的细胞毒性检测，MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的药液，继续培养3天，用MTT法检测药物对MDCK细胞的毒性。(2)药物抗流感病毒作用检测，MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，用100TCID50的流感病毒感染细胞，再加入无毒浓度下的系列浓度的含药培养液，继续培养3天，经CPE法确定药物对流感病毒的抑制作用。本发明所述方法，较佳地还可以采用如下技术方案:(I)流感病毒 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)主要参与病毒的基因组复制与转录。对于复制，RdRp以病毒基因组RNA(vRNA)为模板催化生成与其互补的RNA链(cRNA)，cRNA随后可以作为模板合成vRNA装配进入子代病毒。对于转录，RdRp在合成cRNA的基础上在其3’端加入多聚A尾，5’端加入帽子结构，形成成熟的mRNA进行蛋白质合成。本实验根据合成RNA链时消耗底物ATP、UTP、CTP和GTP使体系中ATP浓度逐渐降低，测定体系中剩余的ATP含量以反应出反应进行程度。(2)通过检测该细胞株中流感病毒RNA聚合酶变化水平，评估对氧磷酸酶3基因过表达细胞对抗流感药物的敏感程度。其中所述病毒滴度检测方法，MTT方法，CPE方法，细胞培养等方法，均为本领域常规实验方法。相比于现有技术，本发明的有益效果如下:本发明本发明以宿主细胞内具有抗病毒功能的基因或蛋白为靶点， 提供了抗流感病毒的药物以及抑制流感病毒复制的方法。本发明是通过调控细胞内所述基因的表达得以实现的。发明具有预防和治疗流感病毒感染的应用价值，对开发更好的抗流感药物，对控制流感病毒的大爆发，减少流感病毒的大爆发对社会经济发展、人的健康带来的重大危害，具有重要的意义。


以下结合

本发明的特征和有益效果。图1是Western-blot检测沉默犬肾细胞中小窝蛋白2表达的结果，其中1:siRNA-小窝蛋白2 ；2 =SiRNA-小窝蛋白2对照；3:未接毒对照；4:正常细胞。图2是Western-blot检测沉默犬肾细胞中表面活性蛋白D表达的结果，其中1:siRNA-表面活性蛋白D ；2 =SiRNA-表面活性蛋白D对照；3 ;未接毒对照；4:正常细胞。图3是沉默犬肾细胞中小窝蛋白2表达后流感病毒滴度图。图4是沉默犬肾细 胞中表面活性蛋白D表达后流感病毒滴度图。图5是构建的P⑶NA 3.1-转录因子A载体图谱。图6是构建的P⑶NA 3.1-对氧磷酸酶3载体图谱。图7是细胞中转录因子A和对氧磷酸酶3免疫印迹检测结果，其中1:pCDNA 3.1-转录因子A ；2:pCDNA 3.1空载体对照；3:正常细胞4:pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3 ；5:pCDNA 3.1空载体对照；6:正常细胞。图8是外源提高表达犬肾细胞中转录因子A后流感病毒滴度结果。图9是外源提高表达犬肾细胞中对氧磷酸酶3后流感病毒滴度结果。图10是小窝蛋白2沉默的犬肾细胞中加入金刚烷胺后流感病毒滴度图。图11是表面活性蛋白D沉默的犬肾细胞中加入金刚烷胺后流感病毒滴度图。图12是外源提高转录因子A表达的犬肾细胞中加入金刚烷胺后流感病毒滴度图。图13是外源提高对氧磷酸酶3表达的犬肾细胞中加入金刚烷胺后流感病毒滴度图。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施例中所用的试剂除特别说明之外，均市售可得。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。实施例中所用猪流感病毒H3N2Swine/Guangdong/l/2006(SwGDl/05)毒株，其生物学特性能代表我国的猪流感病毒特点，源自中国农科院上海兽医研究所猪传染病研究室。6孔细胞培养板，美国Coming产品。DMEM 培养基，美国 GIBCO 产品，REF:16000_044。青霉素，美国GIBCO公司产品，REF:15140_122。链霉素，美国GIBCO公司产品，REF: 15140-122。犬肾细胞(MDCK细胞)，购自中科院上海生命科学研究院细胞库。1.5ml离心管,美国Axygen公司产品。
丙酮，江苏强盛化工有限公司，许可证号:XK13-201-00227。PBS，购自美国 GIBCO 公司，REF:20012_027。PBST:配制方法参考《分子克隆实验指南》第三版。羊抗小鼠FITC标记的荧光抗体，美国Invitrogen公司产品，Code:CA11034s。100%甘油，国药集团化学试剂有限公司。实施例1调控宿主细胞内基因表达抑制流感病毒复制1.siRNA (小干扰RNA)沉默宿主细胞内基因表达抑制流感病毒复制(I) siRNA 分子设计本实施例选择小窝蛋白2基因，GeneID =100125375 ;表面活性蛋白D，GeneID:397198，使用Dharmacon在线设计软件设计siRNA分子，设计小窝蛋白2基因特异性的siRNA干扰序列；并以“siRNA-小窝蛋白”随意打乱序列作为对照。设计表面活性蛋白D基因特异性的siRNA干扰序列；并以“siRNA-表面活性蛋白D”随意打乱序列作为对照。设计的siRNA双链干扰分子主体序列为19个碱基，正义链3/端多加两个UU，反义链3/端多加两个TT。设计的序列如下:针对小窝蛋白2 靶序列 5’ -GCAAATACGTGATCTACAA-3’ ；siRNA-小窝蛋白 2 正义链序列 5’ -GCAAAUACGUGAUCUACAAUU-3’ ；siRNA-小窝蛋白 2 反义链序列 3’ -TTCGUUUAUGCACUAGAUGUU-5’ ；siRNA-小窝蛋白 2 对照正义链序列 5’ -CGAUAGAUGUACACAUACAUU-3’ ；siRNA-小窝蛋白 2 对照反义链序列 3’ -TTGCUAUCUACAUGUGUAUGU-5’ ；针对表面活性蛋白D靶序列5’ -GAGCAGAAATGAAGACCTA-3，；siRNA-表面活性蛋白 D 正义链序列 5’ -GAGCAGAAAUGAAGACCUAUU-3’ ；siRNA-表面活性蛋白 D 反义链序列 3’ -TTCUCGUCUUUACUUCUGGAU-5’ ； siRNA-表面活性蛋白 D 对照正义链 5’ -CAGAGUGACAGAAGACAUAUU-3’ ；siRNA-表面活性蛋白 D 对照反义链 3，-TTCUCUCACUGUCUUCUGUAU-5'。经NCBI blast分析干扰序列与“小窝蛋白或表面活性蛋白D”以外的基因同源性小于50%，对照序列与猪基因组所有序列同源性小于50%。根据该设计的siRNA序列，由Dharmacon公司体外人工合成双链siRNA。(2) siRNA分子转染细胞将胰酶消化的MDCK细胞用无血清的DMEM(美国GIBCO产品，REF =16000-044) (100个单位青霉素(美国GIBCO公司产品，REF =15140-122)和100个单位链霉素(美国GIBCO公司产品，REF:15140-122))传于6孔细胞培养板(美国Coming产品)中，细胞密度4X106细胞/孔，继续培养于37°C、5% CO2温箱中。待细胞生长满培养板底的80-90%，本发明所述双链siRNA分子用FuGENE HD试剂(Roche公司，美国，产品编号:04709705001)转染到MDCK细胞中，操作过程按说明书。同时设转染对照干扰序列样品siRNA-小窝蛋白2对照、未转染对照、正常细胞对照。(3) siRNA转染细胞接毒及样品收集MDCK细胞转染siRNA分子后24h接种流感病毒H3N2，接种剂量I X IO3EID50/孔(6孔板)。在接种病毒后第24h、48h、 72h收取样品。方法如下:将细胞培养板中细胞、连同细胞培养液冻融3次，5000g/min离心IOmin,保留上清,弃沉淀。测定上清中流感病毒滴度。病毒滴度测定方法参考《国家流感中心标准操作规程(修订版)，2007年》。实验结果(图1)表明，MDCK细胞中小窝蛋白2、表面活性蛋白D表达被siRNA分子沉默后接种流感病毒，在24h、48h、72h细胞中流感病毒滴度和对照组相比显著降低，并
且差异显著。细胞中小窝蛋白2被siRNA分子沉默后(如上接种病毒后第24h样品)，Western-blot检测结果见图1，结果表明沉默组中小窝蛋白2表达水平明显低于对照。细胞中表面活性蛋白D被siRNA分子沉默后(如上接种病毒后第24h样品)，Western-blot检测结果见图2，结果表明沉默组中表面活性蛋白D表达水平明显低于对照。siRNA-小窝蛋白2和siRNA-小窝蛋白2对照组相比p值分别Sp = 0.0004 (24h)、0.001 (48h)、0.015 (72h) ；siRNA-表面活性蛋白D和siRNA-表面活性蛋白D对照组相比p值分另Ij为 P = 0.004 (24h)、0.001 (48h) ,0.009 (72h)。上述实验结果证明通过调控小窝蛋白2和表面活性蛋白基因表达能够抑制宿主细胞内流感病毒的复制。2.外源性提高宿主细胞内基因表达抑制流感病毒复制

(I)外源表达第I组中基因表达载体的构建将转录因子A (TFAM) (GeneID:397279 ;基因数据库登录号:NM_001130211.1)连接到 pCDNA 3.1(+)载体(Invitrogen 公司，美国；货号:V790-20)HindIII 和 EcoR V 酶切位点间，具体构建方法包括以下步骤:(I)把Genbank中登录号为NM_001130211.1的转录因子A基因序列输入到DNAStar软件(DNASTAR公司，美国)EditSeq中，选取序列中从起始密码子“ATG”到终止密码子“TGA”、“TAG”或“TAA”之间最长的序列741bp碱基；(2)分别在Y和3'端设计扩增全长PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位点，CGG作为保护性碱基，下游引物5'端添加EcoR V酶切位点；(3)上游引物 5 ' -CGG AAGCTT ATGGCGCTTCTCCGGGGCGTGT-3 '(双划线为HindIII酶切位点)；(4)下游引物 5' -CGG GATATC TCAACACTCCTCAGTGTCTTTC-3 '(双划线为 EcoRV酶切位点);(5)以猪肺巨噬细胞提取总RNA反转录产物为模板，用设计的上下游引物PCR扩增得到转录因子A序列，然后经过酶切后连接到pCDNA 3.1 (+)载体相应酶切位点。构建成功的载体命名为P⑶NA 3.1-转录因子A，见图5。将对氧磷酸酶3 (P0N3) (GeneID:733674 ;基因数据库登录号:ΝΜ_001044604.1)基因开放阅读框连接到pCDNA 3.1 (+)载体(Invitrogen公司，美国；货号:V790-20)HindIII和EcoR I酶切位点间，具体构建方法包括以下步骤:(I)把Genbank中登录号为ΝΜ_001044604.I的对氧磷酸酶3基因序列输入到DNAStar软件(DNASTAR公司，美国)EditSeq中，选取从序列中从起始密码子“ATG”到终止密码子“TGA”、“TAG”或“TAA”之间最长的序列1065bp碱基；(2)分别在5’和3，端设计扩增全长PCR引物，上游引物5’端添加HindIII酶切位点，CGG作为保护性碱基，下游引物5’端添加EcoR I酶切位点；
(3)上游引物 5 ’ -CGG AAGCTT ATGGGGAAGCTGGTGGCTCTGA-3 ’ (双划线为 Hindi 11酶切位点)；(4)下游引物 5’-CGG^^XQCTAGAGCACACAGTACAGAGCT-3’(双划线为 EcoR I酶切位点)；(5)以猪肺巨噬细胞提取总RNA反转录产物为模板，用设计的上下游引物PCR扩增得到转录因子A序列，然后经过酶切后连接到pCDNA 3.1 (+)载体相应酶切位点。构建成功的载体命名为P⑶NA 3.1-对氧磷酸酶3，见图6。(2)重组载体转染细胞及表达宿主蛋白将胰酶消化的MDCK细胞用无血清的DMEM(美国GIBCO产品，REF =16000-044) 100个单位青霉素(美国GIBCO公司产品，REF =15140-122)和100个单位链霉素(美国GIBCO公司产品，REF:15140-122))传于6孔细胞培养板(美国Coming产品)中，细胞密度4X IO6细胞/孔，继续培养于37° C、5%C02温箱中。待细胞生长满培养板底的80-90%，用FuGENE HD试剂(Roche公司，美国，产品编号:04709705001)把pCDNA3.1-转录因子A、pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3载体分别转染到MDCK细胞中，操作过程按说明书。同时设转染P⑶NA 3.1 (+)空载体的细胞对照。细胞转染后24h，收集转染pCDNA 3.1-转录因子A、pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3、PCDNA3.1 (+)空载体和正常细胞样品。细胞总蛋白提取:用PBS漂洗6孔细胞板中细胞2次，然后加Iml PBS将细胞用细胞刮铲刮下，4°C，3000g离心5min沉淀细胞，弃上清。向细胞沉淀加入100 μ I的细胞裂 解液(碧云天公司，产品编号:Ρ0013)，重悬细胞，在冰上裂解5min，然后用超声波细胞破碎仪(Sonics公司，美国，型号VCX105PB)瞬时破碎(40HZ，1S)，沸水煮5min,4°C下13000g离心IOmin,弃去沉淀。取2μ I蛋白上清用BCA试剂盒(碧云天公司，产品编号:Ρ0012)测定蛋白浓度，按照说明书操作。余下蛋白上清加入5XSDS PAGEbuffer (配制方法见《分子克隆实验指南》第三版)，沸水煮5min,4°C下13000g离心5min,取上清进行蛋白质电泳。变性SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白转印(步骤参考《分子克隆实验指南》第三版):每个蛋白样品上样量为30 μ g，SDS-PAGE电泳仪(北京六一仪器厂)80V电压层积蛋白，120V电压分离蛋白，直至电泳结束。蛋白转印使用硝酸纤维素膜(Whatman公司，美国，产品型号:10401396)。伯乐电泳槽恒压65V，2h。转印结束后NC膜浸入5% (v/v)的TBST-脱脂乳中进行封闭。室温作用2h后，弃去封闭液，用含I % (v/v)吐温20的TBST (pH7.6)缓冲液漂洗3次，洗去残留脱脂乳，即可进行抗体孵育。抗体反应及显色:加入一抗，对氧磷酸酶3抗体(Abeam,美国，产品编号:ab40969),转录因子 A 抗体(antikoerper-online.de 公司，德国，产品编号:ABIN484435)。4°C下轻摇振荡过夜(12h-16h)，然后用100% TBST洗3次后，每次5min。之后加入HRP (辣根过氧化物酶)标记的二抗，室温作用2h，用TBST漂洗3次后，每次5min。ECL试剂盒(Pierce公司，美国，产品编号:32106)显色在暗室中操作。操作按照ECL试剂盒说明书。检测内参对照:将已显色的膜浸入抗体剥脱液(碧云天公司，产品编号:P0025)中，50°C孵育30min，每IOmin震荡一次，然后用TBST缓冲液(配制方法:参考《分子克隆实验指南》第三版)漂洗3次,加入封闭液再封闭15min,使用抗β-actin抗体(碧云天公司，产品编号:AA128)作为一抗检测样品中蛋白量。
检测结果见图5，表明MDCK细胞中转染pCDNA 3.1-转录因子A、pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3后，细胞中“转录因子A”和“对氧磷酸酶3”的表达量高于转染P⑶NA 3.1(+)空载体组和正常细胞组。(3)外源性提高MDCK细胞中“转录因子A”或“对氧磷酸酶3”具有抑制流感病毒作用细胞转染pCDNA 3.1-转录因子A、pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3或pCDNA 3.1 (+)空载体后24h，接种剂量I X IO3EID5c/孔出孔板)猪流感病毒。在接种病毒后第24h、48h、72h收取样品。方法如下:将细胞培养板中细胞、连同细胞培养液冻融3次，5000转/min离心lOmin，保留上清，弃沉淀。测定上清中流感病毒滴度。病毒滴度测定方法参考《国家流感中心标准操作规程(修订版)，2007年》。实验结果(图6、7)表明，MDCK细胞中转录因子A、对氧磷酸酶D被外源性提高表达，在24h、48h、72h细胞中流感病毒滴度和对照组相比显著降低，并且差异显著。转染pCDNA 3.1-转录因子A组与转染P⑶NA 3.1 (+)空载体组相比P值分别为P = 0.002 (24h)、0.014(48h),0.0005 (72h);转染pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3组和转染pCDNA3.1(+)空载体组相比 P 值分别为 P = 0.015(24h)、0.008(48h)、0.012(72h)。转染 pCDNA3.1(+)空载体组和正常细胞中病毒滴度差异不显著(P > 0.05)。上述实验结果表明调控转录因子A和对氧磷酸酶3基因表达能够抑制宿主细胞内流感病毒的复制。实施例2调控宿主细胞内基因表达显著提高流感病毒药物的抗病毒效果本实施例中通过调节犬肾细胞中蛋白表达后再感染H3N2猪流感病毒，利用向细胞培养液中加入金刚烷胺，研究调控细胞中蛋白对金刚烷胺抗流感病毒增强效果。金刚烷胺通过干扰流感病毒粒子M2蛋白离子通道，抑制病毒的复制的功能。I沉默犬肾细胞中小窝蛋白2显著提高金刚烷胺抑制流感病毒效果(I)沉默犬肾细胞中小窝蛋白2表达具体步骤同实施例1。(2)金刚烷胺准备盐酸金刚烷胺购自阿法埃莎(天津)化学有限公司，用生理盐水配制成20mg/ml，过滤除菌，4°C保存。(3) siRNA分子转染细胞具体步骤同实施例1。联合用药组在细胞培养液中加金刚烷胺，终浓度至0.4 μ g/ml，分组如下:siRNA-小窝蛋白+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)、siRNA-小窝蛋白2对照+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)、未转染对照+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)和正常细胞对照+金刚烷胺(0.4 μ g/ml) ο(4) siRNA转染细胞接毒及样品收集同实施例1。实验结果如图10所示，表明MDCK细胞中小窝蛋白2表达被siRNA分子沉默后能显著提高金刚烷胺抑制流感病毒的效果。24h、48h、72h细胞中流感病毒滴度siRNA-小窝蛋白+金刚烧胺(0.4 μ g/ml)组显著低于siRNA-小窝蛋白2对照+金刚烧胺(0.4 μ g/ml)组，P 值分别为 P = 0.016 (24h)、0.0Ol (48h)、0.0Ol (72h)。
上述实验结果证明调控细胞内小窝蛋白2基因表达能够提高金刚烷胺抑制流感病毒复制的效果。2沉默犬肾细胞中表面活性蛋白D显著提高金刚烷胺抑制流感病毒效果(I)沉默犬肾细胞中表面活性蛋白D表达具体步骤同实施例1。(2)金刚烷胺准备盐酸金刚烷胺购自阿法埃莎(天津)化学有限公司，用生理盐水配制成20mg/ml，过滤除菌，4°C保存。(3) siRNA分子转染细胞具体步骤同实施例2。联合用药组在细胞培养液中加金刚烷胺，终浓度至0.4 μ g/ml，分组如下:siRNA-表面活性蛋白D+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)、siRNA-表面活性蛋白D对照+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)、未转染对照+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)和正常细胞对照+金刚烷胺(0.4 μ g/ml) ο(4) siRNA转染细胞接毒及样品收集同实施例1。实验结果如图11所示，表明MDCK细胞中表面活性蛋白D表达被siRNA分子沉默后能显著提高金刚烷胺抑制流感病毒的效果。24h、48h、72h细胞中流感病毒滴度siRNA-表面活性蛋白D+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)组显著低于siRNA-表面活性蛋白D对照+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)组，P 值分别为 p = 0.020 (24h)、0.025 (48h)、0.130 (72h)。

上述实验结果证明调控细胞中表面活性蛋白D基因表达能够提高金刚烷胺抑制流感病毒复制的效果。3外源性提高宿主细胞内转录因子A表达显著提高金刚烷胺抑制流感病毒效果(I)外源表达第I组中基因表达载体的构建具体步骤同实施例1。(2)重组载体转染细胞及表达宿主蛋白具体步骤同实施例1。(3)外源性提高MDCK细胞中转录因子A后金刚烷胺抑制流感病毒复制的效果细胞转染pCDNA 3.1-转录因子A或pCDNA 3.1 (+)空载体后24h，接种剂量1X103EID50/孔，联合用药组在细胞培养液中加金刚烷胺，终浓度至0.4 μ g/ml，设置以下实验组:转染P⑶NA 3.1-转录因子A+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)、转染p⑶NA 3.1 (+)空载体+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)、未转染对照+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)和正常细胞对照+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)。在接种病毒后第24h、48h、72h收取样品。方法如下:将细胞培养板中细胞、连同细胞培养液冻融3次,5000转/min离心IOmin,保留上清,弃沉淀。测定上清中流感病毒滴度。病毒滴度测定方法参考《国家流感中心标准操作规程(修订版)，2007年》。实验结果表明，图12所示，MDCK细胞中转录因子A被外源性提高表达，在24h、48h、72h细胞中转染pCDNA 3.1-转录因子A+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)组和转染pCDNA3.1(+)空载体+金刚烷胺(0.4yg/ml)相比显著降低，并且差异显著，p值分别为p =0.310(24h),0.013(48h)、0.007 (72h)。上述实验结果表明调控第I组中基因表达能够显著增强金刚烷胺抑制流感病毒复制。
4外源性提高宿主细胞内对氧磷酸酶3表达显著提高金刚烷胺抑制流感病毒效果(I)外源表达第I组中基因表达载体的构建具体步骤同实施例2。(2)重组载体转染细胞及表达宿主蛋白具体步骤同实施例2(3)外源性提高MDCK细胞中对氧磷酸酶3后金刚烷胺抑制流感病毒复制的效果细胞转染pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3或pCDNA 3.1 (+)空载体后24h，接种剂量1X103EID50/孔，联合用药组在细胞培养液中加金刚烷胺，终浓度至0.4 μ g/ml，设置以下实验组:转染P⑶NA 3.1-对氧磷酸酶3+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)、转染p⑶NA 3.1 (+)空载体+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)、未转染对照+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)和正常细胞对照+金刚烷胺(0.4yg/ml)。在接种病毒后第24h、48h、72h收取样品。方法如下:将细胞培养板中细胞、连同细胞培养液冻融3次,5000转/min离心IOmin,保留上清,弃沉淀。测定上清中流感病毒滴度。病毒滴度测定方法参考《国家流感中心标准操作规程(修订版)，2007年》。实验结果13表明，MDCK细胞中对氧磷酸酶3被外源性提高表达，在24h、48h、72h细胞中转染P⑶NA 3.1-对氧磷酸酶3+金刚烷胺(0.4 μ g/ml)组和转染p⑶NA 3.1 (+)空载体+金刚烷胺(0.4 μ g/ml )相比显著降低，并且差异显著，p值分别为p = 0.042 (24h)、0.088(48h)、0.069 (72h)。上述实验结果表明调控细胞中对氧磷酸酶3基因表达能够显著增强金刚烷胺抑制流感病毒复制。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇被单独应用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种针对小窝蛋白2基因的siRNA，其特征在于，所述的SiRNA对应的靶序列是小窝蛋白2基因的mRNA，所述的siRNA的长度为16_30bp，且可使经其转染后的哺乳动物细胞的mRNA或蛋白表达下降60%以上。
2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA含有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA如序列表中SEQID ΝΟ:1表/Jn ο
4.一种针对表面活性蛋白D基因的siRNA，其特征在于，所述的siRNA对应的靶序列是表面活性蛋白D基因的mRNA，所述的siRNA的长度为16_30bp，且可使经其转染后的哺乳动物细胞的mRNA或蛋白表达量下降60%以上。
5.如权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA含有选自SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA序列如序列表中SEQIDNO:2表示。
7.如权利要求2或5所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA序列3’端还含有2个T或含有2个U的延伸结构。
8.如权利要求1-7任一项所述的siRNA在制备或筛选抗流感药物中的用途，或者在抑制流感病毒复制中的用途。
9.一种含有转录因子A的基因开放阅读框的重组载体，其特征在于，由包括以下步骤的方法制备， (1)在Genbank中登录号为ΝΜ_001130211.1的转录因子A基因序列中，选取序列中从起始密码子“ATG”到终止密码子“TGA”、“TAG”或“TAA”之间最长的序列741bp碱基； (2)分别在5'和3'端设计扩增全长PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位点，CGG作为保护性碱基，下游引物5'端添加EcoRV酶切位点: (3)上游引物5' -CGGAAGCTTATGGCGCTTCTCCGGGGCGTGT-3'；(4)下游引物5' -CGGGATATCTCAACACTCCTCAGTGTCTTTC-3/ ； (5)以猪肺泡巨噬细胞提取的总RNA的反转录产物为模板，用设计的上下游引物PCR扩增得到转录因子A，然后经过酶切后连接到真核表达载体相应酶切位点。
10.一种含有对氧磷酸酶3的基因放阅读框的重组载体，其特征在于，由包括以下步骤的方法制备， (1)从Genbank登录号为NM_001044604.1的对氧磷酸酶3基因序列中，选取从序列中从起始密码子“ATG”到终止密码子“TGA”、“TAG”或“TAA”之间最长的序列1065bp碱基； (2)分别在5'和3'端设计扩增全长PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位点，CGG作为保护性碱基，下游引物5'端添加EcoR I酶切位点； (3)上游引物5' -CGGAAGCTTATGGGGAAGCTGGTGGCTCTGA-3'； (4)下游引物5' -CGGGAATTCCTAGAGCACACAGTACAGAGCT-3'； (5)以猪肺泡巨噬细胞提取的总RNA的反转录产物为模板，用设计的上下游引物PCR扩增得到对氧磷酸酶3序列，然后经过酶切后连接到真核载体相应酶切位点。
11.如权利要求9或10所述的重组载体，其特征在于，所述步骤(5)中的真核表达载体是 pCDNA 3.1(+)载体。
12.如权利要求9-11任一项所述的重组载体在制备或筛选抗流感药物中的用途。
13.—种用于筛选药物的细胞模型,其特征在于,含有如权利要求9-11任一项所述的重组载体。
全文摘要
本发明公开了针对小窝蛋白2、表面活性蛋白D的siRNA及重组载体；含有转录因子A、对氧磷酸酶3转录盒重组载体的构建方法和相应的细胞模型和筛选药物的方法。本发明优点在于，所提供的siRNA使经其转染后的哺乳动物细胞的mRNA或蛋白表达下降60％以上；该siRNA和重组载体可用于基因治疗流感或针对流感病毒进行核酸免疫；本发明提供的细胞模型，可用于病毒研究，特别是猪流感病毒致病机理研究，也可用于建立筛选抗病毒药物模型，特别是抗流感药物细胞模型。
文档编号C12Q1/48GK103215267SQ20121001971
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者马志永, 史子学, 魏建超, 邵东华, 王少辉, 李蓓蓓, 晏文君, 朱紫祥 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所