专利名称:牛副流感病毒的合成基因的制作方法
本发明是有关生产抗牛Ⅲ类付流感病毒(PI-3)疫苗，这种病毒分类是付粘病毒，尤其是编码的PI-3蛋白的合成DNA基因可以以在此公开了的方法生产出来。这些基因可透过转录细胞来生产所选择的病毒蛋白，可应用于疫苗，诊断动物或其他的生物蛋白。合成基因本身将用作为一种诊断剂。
牛Ⅲ号付流感病毒也称之为PI-3或载热病毒，是在牛的急性呼吸道病症的综合症开始出现时的主要因素在病理上和经济上是有相当影响。载热综合病症在PI-3病毒染下开始出现，通常在家畜运输或牧菌所引起的感染。例如巴斯德氏multocida莫类或巴斯德氏溶血菌类结果是产生载热综合症。由于体重减轻、昂贵治疗和延迟了供应市场所带来的每年经济损失估计在七千五百万美元。一种类似的病
毒所感染给羊，出现一种类似于载热综合症呼吸系统疾病。
病毒疫苗包括活的减毒疫苗已成功使用了大约20年，例如由巴斯德氏multocida菌和巴德氏haemolytico菌中经化学变异菌种而获得的活的细菌疫苗已在美国4923545文件中(库塞拉)公开。
予防付流感病毒的疫苗研究已是受到现行疫苗有限效力所限制，部份是由于来自存在的抗体或其它病毒疫苗抑制的影响。另外，采用活的病毒疫苗于繁殖动物上可能会对胎儿有影响并常造成流产。
最近在配制一种信息RNA(m RNA)分的双链DNA双分子复本时已有可能生产一种合成基因。按这种方法生产的合成基因将编码成所选择的信息核糖核酸转录产物蛋白。这个基因工程工艺的一个实例已所选择的信息核糖核酸转录产物蛋白。这个基因工程工艺的一个实例已公开在美国专利4，357，421中，其中它被用来生产流感血细胞凝集素蛋白的合成基因。流感病毒不包括脱氧核糖核酸而含有一种分段逆枝的病毒的核糖核酸(VRNA)基因组，它们在感染时产生病毒信息核糖核酸m RNA和产生出另外病毒核糖核酸(v RNA)模板。流感病毒基因组具有可分的类别，也就是每个基因是以一种病毒核糖核酸后分离片卉形式出现，它们分别转录产生信息核糖核酸。这个工艺由Emtage及其它人公开，分离的病毒核糖核酸作为一种模板。应用在有意义的合成基因上。
现在有可能构成一种合成或脱氧核糖核酸的(DNA)碎片，它相应于一种病毒基因，这基因位于PI-3病毒不可分的反链(负链)病毒核糖核酸基因组上。得到了用病毒感染的细胞而信息核糖核酸-病毒和宿主RNA两者会被其它的细胞组分离。互补在原来的信息核糖核酸上的双链合成的脱氧核糖核酸分子由此形成。这种互补的脱氧核糖核酸(CDNA)群，无性繁殖成反向转录的脱氧核糖核酸基因库，由此基因库可以选择病毒的特殊基因。有意义的病毒基因例如在互逆杂交和杂化物选择转录作用条件，被确定并被分离出来。一旦有重大意义病毒基因被确定，它被嵌入在一个合适的载体，这个载体用来转录一合适表示基因的宿主，这种被表示蛋白可以作为配制疫苗，诊断剂和其它的亚单位。
该发明目的是提供一方法，由此可以构成一种与一般在牛付流感Ⅲ类病毒，一种付粘病毒，基因组上所发现的基因相应的合成基因。与此目的密切相关的是确定及分离这种合成基因，其编码为一特殊毒靶蛋白，例如一种象血细胞凝集毒抗原蛋白。
发明另一目的是为经济地生产用合成基因编码的病毒靶蛋白，以在转录宿主中表达所择的合成基因。
发明还有一目的是提供一种生产脱氧核糖核酸系列一种方法，从而可以确定蛋白氨基酸系列，以构成合成肽。
另外，打算使用该发明工艺生产有特征的脱氧核糖核酸探测物及肽特征剂。
下述缩略语在叙述个发明过程中会用到bp 碱基对BSA 牛类免疫血浆清蛋白CDNA 反向转录的脱氧核糖核酸ci 居里cm 厘米d ATP 脱氧腺苷三磷酸d CTP 脱氧胞苷三磷酸d GTP 脱氧鸟苷三磷酸d TTP 脱氧胸苷三磷酸DTT 二硫苏糖醇DNA 脱氧核糖核酸EDTA 乙二胺四乙酸GUSCN 硫代氰酸胍HA 血细胞凝集素HEPER N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸IU 国际单位M 克分子MDBK 马丁-达尔比牛肾细胞MET 蛋氨酸m M 毫克分子m RNA 信息核糖核酸
NC 壳包核酸蛋白oligo(d A) 由少量(通常2-20)脱氧腺苷分子组成聚合物oligo(DT) 由少量(通常2-20)脱氧胸苷分子组成的聚合物32P 放射磷质量数32% 百分比PI-3 牛Ⅲ类付流感病毒pipes 哌嗪乙烷硫酸poly-A 聚脱氧腺苷poly-c 聚脱氧脱苷poly-g 聚脱氧鸟苷RNA 核糖核酸r RNA 核蛋白核糖核酸SDS 十二烷基硫酸钠(去垢剂)SSC 0.15克分子氯化钠-0.015柠檬酸钠TNE 10毫克分子三盐酸(酸碱度8.0)100毫克分子氯化钠，1.毫克分子依地酸(酸碱度8.0)Tris-ECI 三盐酸t RNA 转移核糖核酸U 单位v/v 体积/体积VRNA 病毒核糖核匹2w/v 重量/体积x 氨基酸残留物附图简单说明图1四页篇幅说明用该发明方法无性繁殖的牛类付流感病毒血凝素CDNA的DNA系列，包括限制酶分裂图。
图2是把图1无性繁殖的CDNA限制醢列成表。
图3把1 HA CDNA基因的DNA系列转录成相应的氨基酸系列。
图4将图1的HA CDNA基因转录产物HA蛋白概推断氨基酸系列。
在叙述本发明时，涉及“m RNA”和“CDNA”，都意味着涉及整个的核糖核酸或脱氧核糖核酸分子或是分别涉及它们任何生物学意义部分，也就是说，意图是使这个发明方法即就一个完整的病毒的信息核糖核酸而言，又就这病毒的信息核糖酸分子分支部分而言付诸实施。例如，可要求编码实际的蛋白亚单位或其一部分或编码成实际上的抗原部位的病毒基因部份分离，编码及构成细胞。
PI-3病毒按组织学，血清学，生物化学性质分类是一种付粘病毒。付粘病毒是“核糖核酸病毒”并且不含有脱氧核糖核酸。它们的遗传学信息只仅仅包含在一单枝，连续(或未被分割的)一块核糖核酸内。基于核糖核酸基因组反向技，付粘病毒族成员表现出一种重现战略。付粘病毒核糖核酸重现必然伴有在与病毒同时出现的转录酶络合物上，由单一的触媒剂产生的反支模型的分支基因组的信息核糖核酸物质。在这些已研究过的系统中，每个信息核糖核酸都与多核糖核蛋白同时发生聚腺苷反应并通常编码成单一的病毒蛋白。
虽然几种病毒结构蛋白已经确定下来了，但已很少再去研究PI-3型再现了。例如，Shibuta和其它的人的“牛类付流感三型病毒的特征”“微生物免疫学”第23卷617-628页(1979)和Guskey等人的“人付流感Ⅲ型病毒高的增长率和提纯及病毒结构蛋白的初始分析”。J.Gen“病毒生物学”54卷115页-123页(1981)。现有技术还未揭示有关细胞内的蛋白或病毒信息核糖核酸物质的情况。另外，除了在此公开外转录和编码测定PI-3信息核糖核酸还没有开始。
在此所公开的发明，使人们能做成一种单个的合成基因或做成相应于处在未被分割的负枝的PI-3病毒的核糖核酸的一个基因上的脱氧核糖核酸片。合成基因或碎片编码为PI-3病毒蛋白或它们的一个部份并包括了一双链脱氧核糖核酸基因，其是编码在蛋白或它们的一个部份的复型。合成基因可以用来生产有意义的蛋白或“靶”蛋白。“靶”蛋白在此将用来表明有意义的病毒蛋白和由所表达的合成基因所产生的蛋白这两方面。但是也应该理解的是所表达的蛋白许也在不重要方面不同于病毒蛋白或也许仅相应于病毒蛋白一个部份或亚单位。
作为合成基因最初步骤，靶蛋白被确定下来。如果打算制备亚单位疫典典诊断剂时，靶蛋可用试验来确定，它能加速受感染动物形成中合或保护抗体。在PI-3病毒情况下，保护抗体是针对着病毒血凝素(HA)，即基本结构蛋白而产生的。血凝素(HA)蛋白在病毒表面上找到并使病毒在传染过程开始附在细胞上。拟分离编码血凝素蛋白基因，这样它才能无性繁殖细胞并用来进行特别HA蛋白病毒生产。这种生物合成血凝素蛋白特别适用于疫苗。它将加速在被注射疫苗的动物本体上产生针对PI-3抗体而不会有受病毒感染危险，因为血凝素蛋白本身是不会有传染性的。然而，有证据表明，其它结构蛋白也会产生有影响抗体。一种疫苗或诊断剂的活性可能会在含有那些其它结构蛋白的生物合成变种情况下进一步增加，例如，结构融合蛋白这是一种病毒表面蛋白，它须要负责与细胞融合以期受到感染并具有使这病毒的核糖核酸转移到这些细胞上的性质。我们希望结构融合蛋白会包含在一种疫苗或类似物中。
受到病毒感染的宿主细胞可用适宜方式得到。最好是马丁一达包尔比牛贤脏细胞用作宿主细胞，因为它们保证病毒重现在很高水平，细胞用病毒感染并用一般细胞培养技术制备。
核糖核酸可适宜方式由细胞中收集。Chirgwim等人的“硫氰酸胍-Cs CI方法”生物化18辉卷5294-5299页(1979)，在例1中更为详细描述这种方法可被采用。整个核糖核酸也就是宿主信息核酸，转移核糖核酸和核蛋白体核糖核酸以及病毒核糖核酸和信息核糖核酸会被分离或重新被恢复。
影响真核生物的各种病毒的信息核酸自然以多腺苷酸形出现。一在把m RNA和其它细胞成分或分或和其它RNA分离时，最好利用这一特点。为了分离多腺苷信息脱氧核糖核酸，全部再现的核糖核酸大部份就近地在少量脱氧胸苷酸的纤维体上分离。然而，如果须要的话，也可用其它方法分离信息核糖核酸。
用逆转录作用技术，由多腺苷酸信息核糖酸构成双链的杂交的核糖核酸/脱氧核糖核酸分子是有可能的。酶的逆转录作用，朝着脱氧核糖核酸聚合酶的一个核糖核酸将在每个每分每分子上合成一个与核糖核酸链上互补的脱氧核糖核酸新链。这个转化作用要求出现一个双链成长点或的初始的初始点，一个少量胞苷分子杂化在信息核糖核酸的3/聚脱氧腺苷终端会形成这样初始点，在双链成长点，逆转录作用开始合成逆转转录的脱氧核酸，产生双链的信息核糖核酸/逆转录脱氧核糖核酸杂化子。
接着，每个双链分子的信息核糖核酸链以一种完全脱离逆转录脱氧核糖核糖核酸方式水解式消除，例如，核糖核酸链在碱性水解作用下水解或与核糖核酸酶一起水解，或在热变性作用时由逆转录脱氧核糖核酸中消除，结果是一个单链逆转录脱氧核糖核酸，它是一个在3′端带有发夹环的自身初始点结构。
可采用逆转作用技术或另外的脱核酸聚合酶象E.Coli脱氧核糖核酸聚合酶(E.C.2.7.7.7)或使用一种脱氧核糖核酸聚合酶k lenow法(用胰蛋白酶分子时形成)使单链逆转录脱氧核糖核酸分子被转变成双链的逆转录脱氧核糖核酸。任何这些醢随着在实际上双链发夹端的初始转变作用，将构成一种和第一个单链逆转录脱氧核糖核酸分子互补的第二个脱氧核糖核酸分子互补的第二个脱氧核糖核酸链。最终分子基本上是具有保留的单链发夹端的双链逆转录脱氧核糖核酸，在用SL核酸酶(E.C.2.1.30.1)处理这些分子时，一个单链的特殊核酸酸，单链发夹端被调整。结果产生一群与最初的一群与最初的一群信息核糖核酸分子互补的双链的逆转录脱氧核糖核酸分子。
大家记得，在这个工艺中作为模板的核糖核酸分子，包括病毒和宿主信息核糖核酸两者，因此，用上述叙述的方法所制备的逆转录脱氧核糖核酸群是颇为不均匀的。逆转录脱氧核糖核酸克隆产生能够确定重大意义逆转录脱氧核糖核酸基因的储库或基因存储库，而研究中心的CDNA亦可从其中被确定出来。
CDNA克隆储存库是用把CDNA基因插入一适当的宿主的转化作用的适当的载体上方法制备。对于该程序中这个阶段，宿主一载体将根据在控制中简易性及切片中一致性而选择，另外，载体将包含单一限制核酸内切酶识别部位，这个部位最好对于CDNA和水解载体同聚物拖尾下再成形是合适的，例如，原粒载体，p BR322，对于E.COLI转录作用是合适的，随着Pst1限制核酸内切酶水解生成一种线性的脱氧核糖核酸分子。这种线分子用末端脱氧核苷酸转移酶(E.C.2.7.7.31)和脱氧嘌呤核苷三磷酸会在载体上拖尾生成聚脱氧胸腺嘧啶核苷尾。采用末端的脱氧核苷酸转移酶和脱氧三磷酸胞苷，聚脱氧胞苷酸poly-c尾可以加在CDNA分子上，在载体上的聚脱氧胸腺核苷尾与在CDNA上的聚脱氧胞苷互补。
这种产物(在这实例中，CDNAS拖成的poly-C和线性载体上拖成的poly-G)然后会混合并在加热和慢慢冷却时退火形成插在原始pst I(抽样部位Ⅰ)限制部1的具有CDNA基因重建质粒。在退火基础上，插入的CDNA每一端的一个链将有相应于Pst Ⅰ位置上的缺口。一旦这种重建的质粒放到转移作宿主细胞内，宿主细胞会修复这个缺口，在插入的基因任一端重建pst Ⅰ位置。为进一步进行操作，这种组建允许使用pst Ⅰ限制核酸内切酶经常切割CDNA基因。
有几种可以把CDNA基因插入载体中所采用的可供选择的程序。例如，用适当脱氧核糖核酸连接酶可以把碎片和链分子连在一起。换句话说，同聚物拖尾可以用来在每个碎片末端生成互补的poly-A多聚腺苷酸和poly-T多聚胸腺嘧啶核糖核酸顺序。
因此构成嵌合质粒或载体用作在使用载体于适宜转化作用的转移细胞上E.Coli实际是非常适合于作转录作用宿主，但其它有机物，例Bacillus subtilis应用适宜的载体选择因此CDNA构成的克隆储存库，包含有病毒特殊基因克隆会确定下来并被分离。
一个仅包含病毒特殊克隆的分支克隆存储库，也就是，把具有病毒特殊基因或脱氧核糖核酸碎片采用不同的杂化技术来形成转移宿主细胞。除了质量数32放射磷dcTP三磷酸脱氧胞苷用来为获得放射性示的CDNE外，采用上述方法，由感染病毒和由未参感染马丁一达尔比牛肾细胞制备出单链CDNA示踪物。由在先构成的CDNA储存库中的E.coli克队隆细胞在硝酸纤维过滤物中长大并形成复制的过滤物，菌落被溶解并释放出来的核酸稳定在过滤物上，放射性示踪物杂化在过滤物上的克隆的CDNA上。未结合的示踪物被去除之后，病毒的特殊菌落，也就是包含相应于一个病毒基因CDNA的菌落用放射图显示会被确定下来。采用细胞加病毒CDNA示踪物杂化的过滤物正面读到正面茵落而不是采用细胞信息核糖核酸示踪物杂化重现过滤物上正面读到正面菌落是病毒特殊的CDNA克隆。仅仅这些克隆需要在下面叙述的鉴定工艺中予以研究。
为了简化筛选工艺，互逆杂化(或菌落交叉杂化)分析会被来确定在相应于分离的病毒特殊的CDNA克隆储存库范围内的单独几组克隆。这一步也可不求因为在转录作用和直接表达及接着免疫判定，例如采用单克隆抗体免疫判定可以被确定。下来然而，由于在储存库中会有大量克隆更为有效是这将会使这工艺过程整体化，此时在形成在那个组范围内交叉杂化的多组克隆并因此几组克隆会被认为包含上述病毒基因片。
互逆杂化，一种单一病毒特殊的克隆用Pst1(产品抽样试验Ⅰ)水解释放出CDNA插。这个插片然后被分开用32P放射性示踪，并在将所有在PI-3 CDNAⅢ型牛类付流感病毒CDNA储存库针对的克隆杂交。和示踪物杂交的所有克隆，定义成组A。第二示踪物由未杂化克隆之一衍生出来，并且这过程重复到形成组B等等，直到多个组形成，并克隆按可能或所要求的范围分类，在此所讨论的Ⅲ型牛类付流感病毒实例5中组A和C包含大量的克隆，并且基于与m RNA信息核糖核酸大量的另外种付粘病毒模板的类似物(Roeenblatt等人的“脱氧核酸互补于Measles病毒，编码在血细胞凝集素和Matrix蛋白上的信息核糖核酸的克隆和特征”J.Virology 42卷790-797页(1982)这些假定编码病毒壳包核酸蛋白基因和血细胞凝集素蛋白基因，分别如表1所示。
诺尔森点迹分析法使用每个组的克隆模型来决是每个克隆组编码。在这个技术方面，克隆会和相应信息核糖核酸原始粒子有关，单个的克隆模籴用放射性同住素示踪并被用来作为决定由吸附到硝酸纤维过滤物上的受感染细胞的病毒信息核糖核酸的示踪物。病毒m RNAs例如由电泳法测定所表明的六种不同的poly-A RNA类(标志成RNA1-6)在PI-3类感细胞中找到。模拟感染细胞是根据感染细胞的同择程序制备，不增加病毒制剂。使用水泡性口膜类病毒m RNAs，或其它已知大小的m RNAs的分子量。
正如表1中所示，六种牛类流感病毒PI-3的poly-A的RNA编码能力大致与六种病毒结构蛋白有关，并与病毒基因组所确定的总的编码能力有关。组A示踪物(m RMAI)杂化在相应于假想的存在的壳包核酸m RMA位置上并且组C示踪物(m RNA3)杂化在相应于假想存在的血细胞凝集素HA的m RNA上。没有观察到未受感的宿主细胞杂化在m RNA上。
杂化选择和体外病毒m RNA的转化作用可用来确证编码的转译功能，并且因此确定单个克隆并且因此确定单个克克隆编码转译的病毒载体蛋白，也就是HA蛋白。在这些程序中，来自受病毒感染的poly-Am RNA。和控制细胞在一种m RNA依赖于非细胞转化系统中可以比较它们直接特病毒蛋白合成能力。
来自每个类别中克隆质粒CDNA被分离出来并且被固定在硝化纤维这滤器上。微由受病毒感染细胞或模拟感染细胞(控制细胞)衍生出来的poly-Am RNAs与这滤界面CDNA杂化。专门杂化在每个固定丁的CDNAs上的m RNAs由这滤物中析出并转移到体外。应用一种技术象聚丙烯酰胺胶电泳(PAGE)转化作用产物分析来确定相对于每个克隆类的CDNA编码的病毒蛋白克隆鉴定。用体外表达蛋白的固定分析法也是理想的，因为体内产生糖基化蛋白将不会在体外被糖基化，并且因此将不会在凝胶的上述位置上迁移。在PI-3实例中，类A克隆选择一个蛋白的m RNA，这个蛋白与PI-3壳包核酸蛋白同时迁移。类C克隆选择直接合成一个蛋白的m RNA，这个蛋白与HA蛋白同时迁移。没有特殊的病毒蛋白会在由模拚感染控制细胞m RNA的转化产物中探测出来。
另外编码靶蛋白克隆的特征是用限制酶分析和/或核苷酸系列确定。如希望构成一种仅编码靶蛋白的一个特殊位置的基因，象包含一种活性蛋白抗原方面的部份，这一步将具有特殊意义和重要性。另一方面，这个情况会用来设计和构成一种相应于靶蛋白活性方面合成蛋白或用于研究和合理设计抗病毒药物。这些特征性的工艺过程用惯用的方法和技术来实施。这些图表示p 1-3 HA的特征论述结果。备1表示如上所的克隆基因的DNA分列。备2列出基因的限制酶部份。备3是HA基因DNA系列的转化作用。备4将形成HA蛋白予计的氨基酸系列，它是用计算机得出的基因CDNA系列分析。
参考备1，DNA系列和限制酶识别和解理部份完全详细表示出来了。按照惯例，DNA系列在5′至3′方向上读出。在这个备上所示的HACDNA插入物是在长度方向碱基对1675，其包括用于克隆的poly-G和poly-C拖尾。没有这拖尾，这个CDNA克隆表示由PI-3 HAm RNA衍生出来的碱基1633。克隆代表了基本上完整的HAmRNA复件的CDNA;由所感染细胞所获得的HAmRNA排列初始围表示出仅仅大约10到15碱基在基因5′端不见了。备1基因编码蛋氨酸基(Met)的第一个转化作用起点密码(ATG)在顺序40位置找到，双仃密码(TAGTAG)在靠近克隆基因(位置1486)3′端找到，因此，这是清楚的，备1代表了一个几乎完整的病毒HAmRNA复制件，并且也许是m RNA编码区域全部蛋白。
另外起始编码也许处于病毒m RNA向上方的部份，所以不可能在备1中表示出来。大部份真核生物病毒m RNAs用含m RNA蛋白体结合部位出现的5′非编码碱基链来表示其特征。备1所表示的基因假想存在的未编码5-序列大约是40碜碱基长。另外，如上指出约10到15碱基看来脱离了CDNA排列。
非编码的3′序列特征在于在DNA序列位置1492上，紧接在仃室密码之后，标准的多聚腺苷符号(AAATAA)。这个顺序(备1线下)表明poly-A拖尾附加在体内的m RNA上。
备2列出所有可能的备1克隆的CDNA基因中限制酶或煮核酸内切酶部份。表中数据DNA序列用电子计算机分析得到。第一纵行表明的是限制酶识别部位或隔离部位，并第三行用碱基号码确定在系列中每个酶位置。除非酶缩写在括号里，数字代表隔离部位5′边。括号说明对于已知特别酶的识别部位。酶实际上会隔离主不同部位。这些字母代表大述氨基酸。
A-腺嘌呤C-胞嘧啶G-鸟嘌呤J-腺嘌呤或腺嘧啶K-鸟嘌呤或胸腺嘧啶L-腺嘌呤或胸腺嘧啶M-胞嘧啶或鸟嘌呤N-腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤或胸腺嘧啶P-腺嘌呤或鸟嘌呤Q-胞嘧啶或胸腺嘧啶T-胸腺嘧啶备3表明备1的DNA系列转化到相应的氨基酸系列。按照惯例，氨基酸系列由氨基端读到羧基端。备1中所示CDNA克隆特征在于一个开放转移码由位置1485，在此可看到一双仃编码所有其它阅读移码都被分列的多次仃顿编码出现而分成块。
(备3)由位置40核苷酸初始蛋氨酸残余物估计在位置1486终端或仃顿编码上。由这个CDNA基因译成多肽密码包含予测的482氨基酸残基(见备4)并且有予测分子量54，142道尔顿。这个值低于由病毒中分离出的HA蛋白所观察到的分子量，这个值似乎是在没有糖化作用时所期望的。备4中所示的HA多予测的氨基系列(靶蛋白)假定的用实线划出的糖基化作用部(天冬氨酸-黄苷一丝氨酸，或天冬氨酸一黄苷-苏氨酸)。
水疗法分折已展示了蛋白内的几个亲水区域和畏水区域。在蛋白羧基终端(残基445至482)的畏水区具有重要意义。这个蛋白具有如病毒HA那样的蛋白膜特征。这个终端的畏水分列在备4中用断绩线表示出来。
如已确定邯蛋白CDNA基因，然后该基因被嵌入一合适表达载体上。由专门工艺要求(也就是净化产量)产品稳定性(也就是对蛋白酶敏感性)及产品毒性及或抑制性决定造样或构成于这个目的的一种合适载体标准。表达载体和宿主造样将受到在这个技术领域：
中工作的人的知识和技术水平限制。
在评定CDNA基因表达的载体的合适程度时一定要使用一种适合方法来决定靶蛋白表面。在判定载体蛋白时，可使用各种标准免疫测定方法即可采用免疫学又可采用射线显影术。针对钝粹的靶蛋白又针对研究中的病毒，也就是针对免疫测定应用中的每种病毒蛋白，微克隆抗体可以制备出来。
研究中的CDNA基因插入到所选择的表达载体上所形成的重新结合质粒用于转移随后繁殖出来的宿主上。目的是，当转移宿主在相应条件下培养在一合适中间体上时，靶会积蓄蛋白。中间体和条件将由转移宿主决定并且选择将受到在这个技术领域：
中工作的人的知识和技术限制。蛋白表达产物在受到质粒相邻启动基因区的影响下将由繁殖的合成基因编上码。载体最好预先疲安排好并选择好，以便包括一个强的启动基因，适用于有意义基因的最全的表达。所表达的蛋白会确定或基本上确定出有意义病毒蛋白，可以代表那蛋白一部份或是转移并合蛋白。这个“转移合并蛋白”是两种合并基因或是它们的碎片，也表达产物的肽就是合并转移产物的肽。用本发明方法产生出来的转移合并蛋白将包括所有或部分病毒靶蛋并在转移作用载体或宿主RNA上位于相邻于有意义的基因的一个基因氨基酸系列。转移合并蛋可以予料将其有免疫活性。用通常使用方法会得元蛋白产物。例如宿主细胞可被分离或分解或含有排出蛋白的清液可以收集起来。蛋白可以由溶菌产物或上清液中用分子篮筛色谱法高压液体色谱法，高压液体色谱法或免疫色谱法分离或提纯。特别用于载体蛋白的微克隆抗体可用在最后提及纯方法中。
被提纯多肽将是一种抗原，并且可以作为一种疫苗使用。当作为疫苗使用时，在一合适的佐剂盅中，合物合成抗原将在实验的动物或人体上产生对靶蛋白抗体，因此得到保护，不受到病毒影响。一般来说，用皮下注射或肌肉由注射，静脉注射，口服或喷雾把疫苗打入抗体中。
CDNA本身在各种环境中，如经感染的动物的血液中存在化验时是很有用的。例如动物的m RNA会被分离，并在一固定的板面上固定住。如果病毒m RNA存在，具有化学上的或放射性的示踪的觐病毒或靶蛋白的CDNA将会把有标记的病毒CDNA粘在实验的m RNA上。未被粘上的CDNA被去掉之后，被粘上的CDNA可以用色度法射线显影术等被判定出来。
而且，采用本发明方法做出面成的CDNA基因核苷酸分别基础上将有可能设计或构成典，基因的核苷酸系列可以转化成如图3和4中相应的表达蛋白的氨基酸系列，蛋白本身也可用化学合成，或将参入靶蛋白一个或多个活体或抗原部位的少量肽可以或合成出来。
下面的举例并不意味对此所描述的发明加以限制。
原种溶液和用在举例中培养基介质如下所述制备第一个链CDNA合成介质三个-HLE(PH8.3) 0.01M氯酸钾 60.00MM氯酸镁 10.00MM.
DCTP 三磷酸脱氧胞苷 0.50MM.
DATP 脱氧三磷酸腺苷 0.50MM.
DGTP 脱氧三磷酸乌苷 0.50MM.
DTTP 三磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷 0.50MM.
DTT 二硫酸糖醇 10.00MG.
OLIGO(DT)(12-18)由少量通常(12-18)脱氧胸腺嘧啶核苷分子组成聚合物 500MG/ML.
第二个链CDNA合成介质HEPES N-2-羟基乙脂哌嗪乙烷硫酸(PH6.8) 0.2MM.
氯化钾 60.00MM.
DCTP 三磷酸脱氧胞苷 0.50MM.
DATP 三磷酸脱氧腺苷 0.50MM.
DGTP 三磷酸脱氧乌苷 0.50MM.
DTTP 三磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷 0.50MM.
Denhantt′s 溶液菲科尔 (TM)(Phanmacan′a Fin化学公司) 5.0g.
Polyvinylpyrrolidone 聚吡咯烷酮乙烯 5.0g.
BSA(Pentax Fraction V)
牛类、免疫血浆清蛋白 5.0g.
水 至500ML.
通过一放置Nalgene过滤器过滤，在-20℃保存例Ⅰ(宿主和病毒MRNA离析)原种病毒判备.马丁-达尔比(Madin-Darby)(MDBK)肾细胞由美国标准菌库(ATCC)12301 Parklawn Arenue，Rockville，Maryland 30852，获得，并在最少是基本介质中(变体)(Dulbecco变体)(“DMEM”)(Flow实验公司)用10%胎牛血清(K、C生物制品)。Ⅲ型牛类付流感病毒(SF-4，VR 281菌种，由ATCC获之)是两次提纯菌斑。用受感染的MDBK马丁-达尔比牛肾细胞马病毒-盐水溶液在低感染多次重复下(0.01PFU/CELL胞斑形或单位/细胞)制备病毒原种受感染细胞在37℃大约3-4天长大到细胞病毒几乎完成，令有病毒上清液获之，分层及使用前在-70℃冷冻保藏。
在MDBK细胞上测定菌斑在2.0%(W/V)甲基纤维素半分离涂层条件下，在用2%胎牛血清50 Ⅰ、Ⅴ/ml国际单位盘尼西林和50Mg/ml链霉素DMEM最少是基本介质帮助下滴到原种上。三天后出现了明显的菌斑，在这时板被结晶紫色染上色斑并且数出菌斑。
氚化丁的Ⅲ型牛类、付流感病毒MRNA的制备在含有受过感染MDBK马丁-达尔比牛肾细胞的T-150烧并内，RNA在受感染后18小时在每毫升中有1.0MGD放线菌素条件下用每毫升3H-尿核苷中20NC Ⅰ居里单位代谢示踪，这个时间是病毒MRNA合成最高峰。放线菌素D被用作阻止宿主DNA向RNA转化作用，当VRNA核蛋白体核糖核酸接着向病毒MRNA转化时，从而仅仅病毒mRNA变成被示踪氚化的Ⅳ类牛付流感病毒mRNAS在加州吸附分析试验中用作对比物并来决定PI-3载体的大小。
RNA的离析全的RNA使用Chirgwin etal生物化学18卷5294-5299页(1979)硫氰酸胍-氯酸铯方法由受感染的MDBK马丁一达尔比牛肾细胞中得到。按照这种方法由5个T-150烧并中10细胞在流入10ml硫氰酸胍(GUSCN)缓冲剂(5.0M GUSCN)0.0mM三-盐酸(PH7.0)50.0m M EDTA.依地酸，5%(V/V)B-氢硫基乙醇用40TM肌氨酸(Ciba-Geigy公司)调整到2%(w/V)在原位被分离成层状这种混合物被加热到55℃保持5分钟然后在冰中冷冻5分钟。溶菌素在50m M EDTA依地酸分离成7.0ml5.7M Cscl并回转容器溶动中(25，000R PM每分钟速率)在15，000Xg，20℃下5小时离折。全部的RNA由离心管底部以一种小丸体被回收到。RNA小丸体在Oligo(d T)少量脱氧胸腺嘧啶核苷分子组成的聚合物纤维素体上进一步碎化成包合聚脱氧腺m RNA采用Avi v和Leder Proc.Na H.Acad.Sci.USA69卷1408-1412页(1972年)。
除了细胞是用盐水浸染而不是用病毒-盐水溶液浸染外，RNA用上述方法由复制感染的MDBK马丁-达尔比牛肾细胞中离折出来。由复制感细胞中分离出来RNA用于例Ⅳ和例Ⅴ中以作一比较的目的。
例Ⅱ(CDNA分子合成)互补于在例Ⅰ中分离的聚脱氧腺苷m RNA的DNA用5.0μg poly-Am RNA聚脱氧腺苷信息共核糖核酸在100μl第一1链CDNA合成介质在37℃保温10分钟来合成。接看，每μg m RNA加进12单位鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶(生活科学公司)。这个混合物在42℃保温45分钟，在变中冻5分钟然后在100℃再加热3分钟。在一微量驱虫剂中以15，000xg离心2分钟至脱落蛋白分离出去。
双链CDNA用在100μl第二链CDNA合成介质合有100μl第一链反应上清液反上清液200μl培养基由单链CDNAE.Coli DNA聚合酶(Klenow碎片)添加到合成所获定的每μg单链CDNA中10单位浓度中。这个混合物在15℃保温16小时。用单一的苯酚一氯仿进行萃取伎反应仃止。
产物(双链CDNA分子)脱并在两个连续精胺沉淀及接着在乙醇沉淀中浓缩。在双链反应溶液中的双链CDNA在0℃(冰里)30分钟10mM精胺存在时被沉淀的CDNA用一微量驱虫剂在15，000离心作用下5分钟收集到。在含有10mM精胺溶液中小丸粒被再悬浮。在0℃放置30分钟后，沉淀物用如前述离心方法收集。沉淀的CDNA在400mM乙酸钠和10mM乙酸镁中再悬浮，然然后用2.5体积乙醇在-70℃沉淀。
双链CDNA产物与SL核酸酶一起溶解至单链或发夹端脱离，CDNA在50μl体积的0.3M Nacl，0.03M乙酸钠，0.003M Ence(PH 4.5)和10单位SL核酸酶中，在37℃放置30分钟。双链CDNA反应产物脱盐并用精胺沉淀物浓缩。
例Ⅲ(CDNA库的结构)由在例Ⅱ中受病毒感染的细胞的mRNA制备的CDNA族在放置于具有30单位终端脱氧核糖核酸转移酶时被拖尾，在含有250mM二甲胂胛(PH-7.2)，2.0mM Co Cl，1.0mM DTT二硫苏糖醇和1.0mM dCTP三磷酸脱氧苷反应缓冲剂中于25℃15分钟产生具有聚脱氧腺苷拖尾的CDNA分子。PBR322(“脑研究进展”第322期)质粒载体与Pst I限制核酸内切酶一起在32℃水解16个小时产生出线状DNA分子。这些线状分子是用dGTP脱氧三磷乌苷使用拖尾CDNA中所用的同样程序拖尾出来的聚脱氧胸腺嘧啶核苷。拖尾poly-G载体分子和poly-C拖尾CDNAs混合并用下述保温方法退火70℃置30分钟，37℃置150分钟和22℃置30分钟，为了形成插在原来的Pst Ⅰ限制部位具有CDNA基因重建的质粒。这种结构允许在Pst Ⅰ切除掉CDNA基因。在这个例子中形成的嵌合质粒用于E.Coli k-12菌种Ac 80(由L.Bopp.通用电器供应)细胞，其由Kushner Proc.of the Int′l Symposium of Gen.Eng.生物医药Pren(1978)所谈的用磷酸钙共同沉淀方法所得之。被转录的E.Coli细胞构成含有CDNA插片细胞库。
例Ⅳ(特殊病毒克隆鉴定)包含特殊病毒基因克隆用际踪由mRNA逆转录所衍生出来的CDNA操测物方法由不同的菌落杂交来鉴定，mRNA即是由守P I-3病毒感染式是模型感染MDBK马丁一达尔比牛肾细胞用例Ⅰ程序提取出来。放射性示的单链CDNA合成用例Ⅱ中所述方法得到，除非P dc T P三磷酸脱氧胞苷在混合反应中取代dc T P。
无性繁殖E.Coli细胞用例Ⅲ制备，在覆盖在Luria琼脂板硝化纤维过滤器的复制酶做出来。用0.5M NaoH把所得到切菌落溶解，然后释放出来的核酸在80℃一个真空炉中加热60分钟固定在过滤器上。含有溶解E.Coli菌落的过滤器用在5 X Denhardt′s试剂(也就是，在上述给定的5倍浓度中)5 X SSC 0.15M氯化钠-0.015柠檬酸钠100ug/ml变性沙门精液，50%甲酰胺和DNA在42℃下保温24小时放射性示踪物的杂交作用产生无性繁殖的CDNA，用过滤器在2 X Denhardt′s试剂，5 X SSC〔0.15M氯化钠-0.015柠檬酸钠(PH7.0)〕，50ug/me沙门精液DNA，50%甲酰胺，7.5%硫化葡聚糖，特殊的放射示踪物既对于MDBK马丁一达尔牛肾细胞m RNA又对于MDBK+PI-3m RNA用保温方法来进行。保温是在42℃下置24小时。游离的示踪物在2倍SSC(0.15M氯化钠-0.15M)柠檬酸钠加上0.1% SDC十二烷基硫酸钠(去垢剂)清洗过滤物时及接着用0.1×SSC和0.1% SDS清洗中剥落。特殊病毒克隆用放射自显影来确定。与含有病毒分别示踪物不同地杂交产生的菌落也就方法仅用MDBK马丁一达尔比牛肾细胞+PI-3m RNA示踪物杂交产生的过滤物正面菌落和用MDBK m RNA示踪物杂交产生的双重过滤物反面菌落被确定并再分筛来确认病毒特征。
例Ⅴ(互逆杂交作用)Ⅳ例中特殊病毒CDNA克隆用Roznblatt etal.互补牙编码血细胞集素和基质蛋白Measls病毒m RNA的DNA的无性繁殖和特征。J.Virolgy病毒学42卷790-797页(1982)互逆杂交方法分类。克隆DNA用Pst I限制酶水解办法由其中之一的特殊病毒CDNA克隆的PBR322载体中剥离。受到限制的DNA在1.5%琼脂糖凝胶中分离作用下解体产生线状PBR322质粒DNA和插片物CDNA.插片物CDNA由凝胶中洗脱并用32p-d CTP切口转录程序射线示踪.Maniutis其它人Proc，Natl.Acad.Sci美国72卷1184-1188页(1975)采用(曾在Bethsda研究实验中使用过)切口转录试剂件。放射性示踪的CDNA示踪物用于在PI-3 CDNA库针对所有病毒-特殊性克隆采用下述方法杂化作用中。菌落同时凝聚在主琼脂链上并硝化纤维过滤物凝聚在第二个琼脂链并随后长大。在过滤物上菌落用Hanahan和Meselson方法“基因”第10卷63-67页(1980)用碱来分离。中合作用之后，DNA用烘干方法固定在过滤物上。这些菌落DNA吸印用Grunstein和Hogness中所描述的32P示踪物杂合，Proc.Natl.Aead.Sci U.S.A72卷3961-3965页(1975)接着杂合作用，过滤物放射自显影。这些与示踪物杂合的克隆成为PI-3A类。
第二个示踪物用同样方法由非杂化类来制备。杂化过程不断重复直至所有克隆根据逆杂化分析理论又分成六组。表1说明已知道的每类克隆号数CDNA插入物大约尺寸，相应m RNA大概尺寸m RNA分子和暂时编码测定。
表1(以逆杂化作用关系为基础的P1-3 CDNA克隆分类)组号 A B C D E斑踪物 6～8 5～2 3～5 5～4 6～6克隆 38 8 10 3 5插入物 500 400 500 400 500尺寸范围 ～1500bp ～1300bp ～1600bp ～1300bp ～1000bp相对的 RNA5 RNA4 RNA3 RNA6 ？mRNAmRN 大小 1600 1900 1950 1190 ？(体基)mRNA分子量0.55 0.64 0.65 0.41 ？(×10逆尔顿)编码测定 NC F(？) HA M P(？)1.10 P1～3特别克隆不可能用互逆杂合分析来分类(Nc病毒粒子;F融合;HA血细胞凝聚集;M基质;P磷蛋白)例Ⅵ (Northern斑点分析)
相应mRNAs(再互逆杂化作用)确定每个CDNA克隆类，应用Northenr斑点分析法。CDNA插入物由组A～D的单个克隆中剥落开用32P示踪使用的例Ⅴ中所述的用于CDNA示踪物方法，切口转录作用。载体RNA由受P1～3病毒感染和模拟感染的MDBK细胞用14%乙二醛和50%二甲亚砜于5%磷酸钠(PH60)中在50℃变性1小时。m RNAS是(使用20×SSC)用毛细管作用转录到一硝化纤维过滤物上斑。
转录后，过滤物在65℃烘干两小时，冷却到室温然后放进5 X SSC中15分钟。然后用一含有予杂化缓冲剂袋密封起来(缓冲剂5X Denhardt′s试剂，5 X SSC，50%甲酰胺和100μg/ml变性沙门精液DNA)并在42℃水池中保温4小时。然后过滤物被切成小片，每个小片有PI-3m RNA和 。这些小片放进含有杂化作用缓冲剂的单个小袋中(2X Denhardt′ss，5X SSC，50%甲酰胺和1.0mM葡聚糖硫酸脂。50μg/me变性沙门精液DNA和1.0mM焦磷酸)每个小片和已配制出来的32p示踪物杂化，这种32p示踪物在放入袋之前放进沸腾水池加热5分钟产生变性。杂化作用是在其放入42℃水池中保温20小时时进行的。接着，过滤物用1.0X SSC和0.1%SSC冲洗(洗四次，每次15分钟)。下面它们进行放射性自显影。在例1中制备到的氚化丁的PI-3m RNA电脉在吸口部于上述硝化纤维过滤物的平行点线上并用EN Hame照射(TM技术手册)(新英格兰核公司)荧光图照相术使之显影作为一种内部标记和控制。显影采用Kodak XAR(技术手册)胶卷用增光屏在-70℃下曝光至48小时，直到图象可见到。
单个病毒的m RNA给出初步的(在与病毒蛋白和其它的付粘病毒的尺寸关系相类的基础上)编码测是在这个例中，水洗性口膜炎病毒m RNAs用于标记以便确定PI-3 mRNA分子量。(Rose，J.及其它人例Ⅶ(杂化选择和转录作用)对于组A和组C这些临时编码测定用杂化物选择和体外病毒m RNA转录作用所确定。DNA质粒(10μg)由组A和C的PI-3克隆中分离出来并用Cs Cl-溴乙锭离心作用来纯化DNA在20μg I之-HCI(PH7.5)和1.0mM EDTA依地酸中加热10分钟至100℃然后马上放到冰中冷却而产生变性相当(当量浓度体积氢氧化钠加进并且DNA溶液在25℃保温20分钟。在加入9.0ml 1.5M Nace，0.15M柠檬酸钠和0.25M之HCI(PH8，0)溶液被中和。在2.0cm直径硝纤维过滤物上(浸在3倍SSC中)用一真空管缓慢过滤，DNA被固定住。这个过滤物在25℃空气干燥的1个小时，然后在-80℃真空炉中烘干两小时。
干燥后，过滤物切成0.7cm小块并放进一硅化处理30ml空中。50%(w/v)脱碘甲酰胺，20mM PIPES哌嗪乙烷硫酸.(PH6.4)，0.75M NaCl，1.0mM EDTA，依地酸(螯合剂)，1%(W/v)SDS十二烷化基硫酸钠，5，0μg一单链沙门精液DNA和0.5μg E.Coli转移RNA予杂化溶液加入之中。这溶液在37℃下保温两小时。予杂化缓冲剂分离出来并小片用不含转移RNA和单股脱氧核糖核酸予杂化缓冲剂冲洗。
在杂化作用时，切成的过沪物与由受病毒感染的或模拟感染的MDBK马丁一达尔比牛肾细胞分离出来的50μg整体细胞RNA一起置于100μI的50%(v/v)脱碘甲酰胺，20mM PIPES(PH6.4)哌嗪硫酸，0.75M Nace，1.0m M EDTA依地酸，1%(W/V)SDS十二烷基硫酸和1.0mM钒的络合物于50℃保温5小时。过滤物用TNE〔10毫克分子三倍的盐酸(PH8.0)-100毫克分子Nace 1.0 mM依地酸(PH8.0)〕加上0.5% SDS.十二烷基硫酸钠彻底冲洗，然后单独用TNE冲洗。过滤物转移到15ml定试管并加进30μl灭菌的水。结合的mRNA洗脱用沸腾方法在水槽中放置1分钟来处理。样品立刻放进液氮中冷冻，然后放到室温解冻。过滤物扔掉。洗脱的RNA用碳酸氯仿，异戊醇进行提取然后在-70℃用乙醇沉淀。沉淀mRNA乙醇用离心方法和冻干方法收集。
每个洗脱的杂化选样了的mRNA(用35 S-蛋氨酸)转录到无细胞Wheat Germ提取物IVT系统中(Bethesda研究实验室)(新英格兰核工程)。特殊病毒转录作用产物(蛋白)使用聚克隆免抗纯化PI-3病毒血清进行免疫沉淀。免疫络合物正如Rose Nature 279卷260页(1979)所谈一用吸附于蛋白一A聚丙烯酰胺(免疫泡TM Bio-Rad)与反应混合物相分离。免疫沉淀的产物采用放置25μl缓冲剂(水中5%W/VSDS，6% V/V2-硫基乙醇)中沸腾5分钟方法由吸收剂蛋白-A中脱落出来并在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统(SDS-PAGE)(Laemmli，Nature 227卷680-685页1970)电脉。电脉后，凝胶电印到硝化纤维纸上(Bio-Rad)用EN Hame(TM)喷射法(新英格兰核工程)进行荧光照相并且一周中24小时，使用科达Kodav，X-Omat AR(TM)胶卷(Kodak)在-70℃进行射线自显影，直至图象可见。
在控制时，病毒mRNA由与例1中所描述受牛的PI-3病毒感染的细胞中分离出来。全部分离出来的mRNA根据该例中前面所述体外转录程序被转录。转录作用产物(病毒和宿主两者)使用聚克隆免抗纯化PI-3病毒血清，这正如上所述确定病毒的特殊蛋白，而进行免疫沉淀。用这种方式所确定蛋白如在表Ⅱ(多肽控制)中所示。可以看到用随后免疫沉淀法在体外转录所有的mRNA确定了三种病毒蛋白。它们之中两种，血细胞凝集素(HA)和核衣壳蛋白(NC)与由杂化选择的mRNAs转录的病毒特殊蛋白相符合。也就是，类A示踪朝着具有65-70，000道尔顿分子量(相应于68000道尔顿病毒核壳蛋白和65-67.000道尔顿控制类蛋白)一个蛋白合成的(杂化选样)mRNAs类C示踪朝着具有60，000道尔顿分子量(相应于69，000道尔顿病毒血细胞凝集素蛋白和60，000道尔顿控制类蛋白)一个蛋白合成的杂化选样的mRNAs。31，000道尔顿蛋白在相应干35，000道尔顿病毒基质蛋白的控制类中被确定出来，非病毒特殊多肽在与RNA一起由模拟感染细胞所编程序的小麦胚提取物中确定出来。
表Ⅱ(牛Ⅲ类付流感病毒多肽分子量)多肽符号 病毒多肽 控制多肽 杂化多肽L 180，000 ND NDP 79，00 ND NDHA 69，000 60，000 60，000NC 68，000 65-67，000 65-70，000F 55，000 ND NDM 35，000 31，000 ND1.用道尔顿表示的分子量素/2.ND＝“不定”3.病毒HA多肽与体外转录的HA多肽之间分子量不同是由于在体外产物中缺少糖基化作用。
4.核壳蛋白(NC)和基质蛋白的未经过糖基化作用，因此在SDS-PAGE凝胶中反映较小区别。
原则上，本发明涉及主体和操作模式已在上述说明书中阐明。然而，在此打算进行保护的发明将不包括限于已分开特殊形式，因这些内容是看作阐述性的而不是限制性的。那些具有一般技术水平的人在不违背发明精神前提下可以知道之区别和变化。
权利要求
1.一个合成基因或DNA碎片特征在于a)偏码牛Ⅲ类付流感病毒蛋白或其部分，及b)包括一双链DNA基因，该基因是病毒RNA基因编码在上述蛋白或其部分的一个复本。
2.权项1合成基因，其编码牛Ⅲ类付流感病毒血细胞凝集素或其一部分。
3.权项2合成基因的DNA系列，该系列开始具有一起始密码子，结束具有终端或停止密码子，并且该DNA系列包括图1所示的核苷酸系列或该系列部分。
4.权项2合成基因的DNA系列，该系列编码一个具有图4示氨基酸系列一多肽或其一部分。
5.权项1合成基因，其编码牛的Ⅲ类付流感结构融合蛋白或其的一部分。
6.权项1双链DNA基因包括在一载体或质粒中。
7.权项6的载体或质粒，在它们之中上述的DNA基因编码牛的Ⅲ类付流感血细胞凝集素，或其的一部分。
8.权项6的载体或质粒，在它们之中上述的DNA基因编码牛的Ⅲ类付流感结构融合蛋白或其一部分。
9.权项1的双链DNA基因包括在一宿主细胞中。
10.权项9的宿主细胞，其中上述DNA基因编码牛的Ⅲ类付流感血细胞凝集素或其一部份。
11.权项9宿主细胞，其中上述DNA基因编码牛的Ⅲ类付流感结构融合蛋白或其一部份。
12.培养权项9上述的宿主细胞产生出合成的牛Ⅲ类付流感病毒蛋白或其一部分。
13.权项12的蛋白或其一部份，其包括图4示氨基酸系列或其一部分。
14.构成一种对于病毒载体蛋白的合成基因的方法，病毒载体蛋白被编码在位于未被分割的牛的类付流感病毒负链病基因组的基因的予期位置上。该方法包括有a)分离大量具有编码上述病毒蛋白基因的m RNA。b)用酶逆转录和低脱氧核苷酸初始分子由上述大量的m RNA构成双链的m RNA/c DNA杂化物。c)溶解或去掉上述杂化物的m RNA链。d)在步骤(c)之后由所保留下来的单链CDNA，用DNA多聚酶产生出基本上完整的双链CDNA分子，并e)使用单链特殊核酸酶修整上述基本完整的双链CDNA分子的单链端部位置。
15.权项14方法，用其中上述合成基因插放到适宜的载体上，适合的宿主与重组载体一起被转录，并转录宿主克隆到所生成的包含上述病毒载体蛋白合成基因的库。
16.权项14方法，其中在步骤(a)分离的大量m RNA经离心进一步分离多腺苷酸的m RNA。
17.权项16方法，其中上述步骤(b)的少量的脱氧核苷酸聚合物分子是将杂化到聚腺苷酸的m RNA的diqo(dt)分子。
18.权项14方法，其中，步骤(c)包含用碱基或核糖核酸溶解的m RNA链。
19.权是项14方法，在此方法中步骤c包含用热变性作用由CDNA链分m RNA链。
20.权项14方法，在此方法中，合成基因至少编码在上述病毒载体蛋白一个抗原部位上。
21.权项14方法，在此方法中，上述病毒载体胥白是牛Ⅲ类付流感病毒的血细胞凝集素。
22.权项21方法，此方法中上述蛋白基因基本上包括图1示的核苷酸系列或其一部分。
23.权项21方法，在此方法中由上述合成基因产生的上述蛋白基本上包括图4示氨基酸系列或其一部分。
24.权项14方法，在此方法中，上述病毒载体蛋白是牛的Ⅲ类付流感病毒结构融合蛋白。
25.用权项14方法所产生出来的对于牛的Ⅲ类付流感病毒载体蛋白或至少上述病毒蛋白一抗原部位的合成基因。
26.权项25的合成基因其包含图1这示的核苷酸系列或其一部分。
27.权项25的合成基因，其编码在图4示氨基酸系列或其一部分的一个多肽上。
28.权项25合成基因包含在一个载体或质粒内。
29.用权项28的载体或质粒转录的一个宿主细胞并表达其中所包含的合成基因蛋白。
30.权项14方法，在此方法中，在确定上述合成基因核苷酸系列，将上述核苷酸转录到所表达蛋白的相应氨基酸系列，及合成具有上述氨基酸系列或其一部分的肽的条件下，合成基因是用来形成或构成一种疫苗或诊断剂合成肽。
31.生产协相应于牛Ⅲ°类付流感病毒的载体蛋白一种病毒蛋白或其一部份方法包括a)构成一种编码上述载体蛋白或其一部份合成基因条件Ⅰ)分离大量的含有编码上述病毒蛋白的基因的m RNA。Ⅱ)使用酶逆转录和低脱氧核苷酸引物分子由上述大量的m RNA来产生双链m RNA/c DNA杂化物。Ⅲ)溶解或去除上述杂化物的m RNA链。Ⅳ)利用DNA聚合酶由在步骤c)之后保留的单链CDNA产生基上完整地双链CDNA分子。Ⅴ)使用单链特殊的核酸酶修整上述基本上完整的双链CDNA分子的单链端部位置。Ⅵ)把所得的双链CDNA分子插入到载体内并用重组载体转体转录宿主。Ⅶ)无性繁殖所转录的宿主至形成一基因库。b)确定并分离上述合成基因。c)将上述基因插入到一适宜表达载体上。d)包含上述合成基因重组载体转录一合适的宿主。e)无性繁殖所转录宿主。f)在适合于上述合成基因表达的一个介质中培养上述宿主。g)在介质和/或在转录宿主上累积上述病毒蛋白或其一部份。
32.权项31方法，在此方法中上述步骤g)中累积的病毒蛋白或其一部分被分离或提纯。
33.权项31方法，在此方法中上述载体蛋白是牛的Ⅲ类付流感病毒血绷胞凝集素或多种它们的抗原部位。
34.权项33方法，在此方法中上述蛋白或其一个或多个抗原部位包括图4示的氨基酸系列或其一部分。
35.机项31方法，在此方法中上述载体蛋白是牛Ⅲ类付流感病毒结构融合白或它们的一或多个抗原部位。
36.权项3.1.方法，在此方法中所表达的蛋白适合用作一种疫苗或诊断剂。
37.在一种适宜的佐剂中权项36的蛋白包含在一种疫苗中。
38.权项31方法产生出一种牛的Ⅲ类付流感病毒蛋白或其一部份。
39.权项31方法，在此方法中所产生出来的病毒蛋白是一种包括所有的或部份的病毒载体蛋白的转录融合蛋白及由相邻基因编码的氨基酸系列。
专利摘要
发明公开了构成一种用于产生病毒蛋白或其一部分的合成基因方法。该方法可用于负链RNA病毒基因组上组建基因，如流感病毒或副流感病毒基因于适当宿主上，用表达合成基因所制备的蛋白或其一部分，并用于疫苗或诊断目的。
文档编号C12N15/00GK85100949SQ85100949
公开日1987年1月10日 申请日期1985年4月1日
发明者约翰·M·赖斯 申请人:W·R格雷斯公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan